Polimorfismos en el Promotor del Gen del Angiotensinógeno (AGT) y su relación con la miocardiopatía chagásica crónica en pacientes venezolanos

Karlena C Lara O¹, Juan C Mendible^2†, Carlos D Ramírez^{3, 4, *}, Alida Hung³

1. Escuela de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela.

2†. Instituto de Medicina Experimental. Facultad Medicina, Universidad Central de Venezuela.

3. Cátedra de Bioquímica, Escuela de Medicina J. M. Vargas. Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela.

4. Instituto de Biología Experimental, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela.

* Autor para correspondencia: Instituto de Biología Experimental, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela. Teléfono: (+ 58-212) 7510111/0377 Fax: (+ 58-212) 7535897. Apartado Postal 47114. Caracas 1041A, Venezuela. E-mail: cramirez@hramirez.net

La enfermedad de Chagas constituye un importante problema de salud pública en América Latina por presentar elevados índices de prevalencia y por la gravedad de sus cuadros clínicos, tales como la Miocardiopatía Chagásica Crónica (MCC), en la cual los pacientes pueden presentar diferentes grados de alteración cardíaca, siendo los pacientes chagásicos tipo 3 los que presentan mayor compromiso. Por otra parte, se conoce que diversos polimorfismos en el gen del angiotensinógeno (AGT) están correlacionados con el desarrollo de ciertas miocardiopatías hipertróficas. En este trabajo se estudió la posible correlación entre el polimorfismo -6A/G del promotor del gen del AGT con la susceptibilidad al desarrollo de una MCC en pacientes chagásicos tipo 3. Para esto, se estudió una población de 22 pacientes chagásicos tipo 3 (confirmado por seguimientos y parámetros clínicos) y 19 voluntarios seronegativos a Trypanosoma cruzi y sin ningún tipo de alteraciones cardíacas. Los genotipos derivados del polimorfismo -6A/G fueron determinados mediante la técnica de MS-PCR (Mutagenically Separated PCR), utilizando dos iniciadores alelo-específicos para el promotor del gen del AGT. Los resultados obtenidos indican que la distribución de los genotipos GG, AA y AG derivados del polimorfismo -6A/G no difieren significativamente entre pacientes y controles (1, 3, 18 y 1, 2, 16; respectivamente) con un valor de c² obtenido de 0,0983 (p<0,005), lo cual sugiere que el polimorfismo –6A/G en el promotor del gen del AGT no está correlacionado con el desarrollo de MCC presente en estos pacientes.

Palabras clave: Miocardiopatía Chagásica, Trypanosoma cruzi, Angiotensinógeno, AGT, Promotor, -6 A/G, Polimorfismos.

Chagas´disease constitutes an important problem of public health in Latin America for its high prevalence indexes and for the severity of its clinical manifestations, such as the cardiomyopathy, in which the patients can present different grades of heart alteration, being the Chagas’ patients type 3 those that present greater heart compromise. On the other hand, it is known that diverse polymorphisms in the gene of the angiotensinogen (AGT), are correlated with the development of certain hypertrophic cardiomyopathies. In this work, we studied the correlation between the polymorphism –6A/G in the promoter of the gene AGT, with the susceptibility to the development a hypertrophic cardiomyopathy in Chagas patients’ type 3. For this, a sample of 22 Chagasic patients type 3 was studied (confirmed by evaluations and clinical parameters) and 19 seronegative controls to Trypanosoma cruzi without any type of heart alterations. The derivative genotypes of the polymorphism -6A/G were determined by the technique of MS-PCR (Mutagenically Separated PCR), using two allele-specific initiators (primers) for the promoter of the gene AGT. Our results indicate that the distribution of the genotypes GG, AA and AG of the polymorphism -6A/G do not differ significantly among patients and controls (1, 3, 18 and 1, 2, 16; respectively) with a value of c² obtained of 0, 0983 (p < 0,005), that which suggests that the polymorphism -6A/G in the promoter of the gene AGT is not correlated with the development of cardiomyopathy in these patients.

Keywords: Chagasic Cardiomyopathy, Trypanosoma cruzi, Angiotensinogen, AGT, Promoter, –6 A/G, Polymorphisms.

La enfermedad de Chagas constituye uno de los problemas de Salud Pública más importantes en América Latina, y tiene un gran impacto social y laboral debido a su amplia distribución geográfica, los elevados índices de prevalencia que se presentan y a la gravedad de sus cuadros clínicos, como la Miocardiopatía Chagásica Crónica (MCC). Por todo esto, el conocimiento de su proceso evolutivo es imperativo (1, 2). El agente causal de la afección es un protozoario flagelado denominado Trypanosoma cruzi, cuyo ciclo de vida comprende una compleja serie de estadios (3). Se ha determinado que entre 18 y 20 millones de personas están sufriendo la infección por T. cruzi, y que 120 millones de habitantes en Latinoamérica están en riesgo de contraer la enfermedad. En Venezuela se considera a la Tripanosomiasis como una enfermedad re-emergente, debida a su transmisión activa en la pasada década (4).

La infección por T. cruzi lleva al individuo a desarrollar la enfermedad en tres períodos: un período agudo, un período indeterminado o indiferenciado, y un período crónico. Paralela a esta clasificación con respecto al estado de avance de la enfermedad, se han reportado clasificaciones clínicas de los pacientes con esta patología, dependiendo de las alteraciones que presenten a nivel cardíaco (5, 6).

Los pacientes que sobreviven al período agudo entran al período indeterminado o indiferenciado del período crónico, el cual dura de 10 a 20 años y se caracteriza por la ausencia total de manifestaciones clínicas. Únicamente de un 20 a un 30% de estos individuos desarrollarán los síntomas del tercer período y el resto de ellos nunca desarrollarán síntomas, a pesar de ser portadores del parásito y de que su serología se mantenga positiva (1). Esto último sugiere que un componente genético podría estar participando en la progresión de la enfermedad.

Las manifestaciones clínicas de esta última fase pueden presentarse a nivel cardíaco manifestándose como miocardiopatías. De acuerdo al grado de alteración cardíaca, los pacientes chagásicos son clasificados como de tipo 2 o tipo 3, siendo estos últimos los que presentan el mayor compromiso cardíaco (1).

La MCC se presenta como consecuencia de una serie de eventos que se desarrollan durante la evolución de la enfermedad. En las formas fulminantes de la misma, los tripanosomas flagelados salen de la sangre e invaden las células reticuloendoteliales y las células de músculo liso, estriado y cardíaco, siendo a este nivel donde ocurren los cambios morfológicos característicos de la MCC (6, 7). El desarrollo de una hipertrofia cardíaca puede responder a diversos factores entre los que destaca la herencia de una variante genética que hace a una persona susceptible. Tal proceso pudiera estar modulado por la activación programada de una amplia variedad de genes que interactúa entre sí y con factores ambientales. Ya que muchos genes pueden adoptar diferentes formas de acuerdo a mutaciones que ocurren en sus exones y/o secuencias relacionadas con su expresión (secuencias promotoras y reguladoras) lo que origina variantes genéticas o polimorfismos, que conducen a que la función de dichos genes sea llevada a cabo con menor o mayor eficiencia, su herencia comúnmente influencia el fenotipo de la cardiopatía. El fenotipo final es la consecuencia de la interacción de la mutación responsable con su ambiente genético y con los factores ambientales (8, 9).

Uno de los genes en estudio y del cual se conoce su participación en la modulación del crecimiento cardíaco y en la expresión fenotípica de hipertrofia cardíaca (14) es el gen del angiotensinógeno [AGT] (8). Dicho gen está ubicado en el cromosoma 1q42-q43, contiene 5 exones y codifica para la producción de angiotensinógeno, glicoproteína con un peso molecular de 50 KDa, que contiene en su extremo amino el decapéptido angiotensina I (AI) el cual es liberado por la acción proteolítica de la enzima renina. A partir de la AI se produce, por acción de la enzima convertidora de angiotensina (ECA), angiotensina II (AII), el péptido biológicamente activo del Sistema Renina-Angiotensina (SRA) (15), el cual tiene diversos efectos incluyendo vasoconstricción, proliferación celular entre otros, eventos que representan un riesgo elevado para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares (3). En tal sentido, el angiotensinógeno es una proteína que desempeña un papel determinante en el SRA, sistema que regula la presión arterial y la función cardiaca (16).

Conociendo la importancia que tiene el angiotensinógeno a nivel fisiológico gracias a su papel en el SRA, el cual regula la presión arterial y la función cardiaca, el estudio de diferentes variantes genéticas derivadas del gen que lo codifica y la posibilidad de que dichas variantes pudiesen estar determinando cierta susceptibilidad al desarrollo de enfermedades cardíacas, en este caso particular, en pacientes infectados con T. cruzi, resulta de gran importancia a la hora de encontrar factores de riesgo a problemas de salud pública como la enfermedad de Chagas (8, 15).

Pacientes y Controles. La fuente de ADN genómico humano estuvo representada por sangre periférica extraída de 22 pacientes (14 hombres y 8 mujeres) provenientes de diferentes regiones del país (Estados Táchira, Miranda, Trujillo y Área Metropolitana) que asistieron a la Unidad de Cardiomiopatías del Hospital Universitario de Caracas y a la Unidad de Cardiología del Instituto de Medicina Tropical, UCV. Dichos pacientes presentaron serología positiva para la enfermedad de Chagas y fueron clasificados como tipo 3, con edades comprendidas entre 41 y 76 años con una media de 53,7 + 0,67. Éstos fueron comparados con 19 individuos controles (9 hombres y 10 mujeres) Chagas negativos comprobados como tal en la Sección de Inmunología del Instituto antes mencionado. Tanto los pacientes como los individuos controles accedieron de manera voluntaria a la toma de la muestra de sangre luego de haber sido informados del estudio. Las muestras de sangre fueron refrigeradas y transportadas al Laboratorio de Biología Molecular, Cátedra de Bioquímica de la Escuela de Medicina José María Vargas de la UCV, donde fueron procesadas antes de 24 horas.

Amplificación del gen AGT mediante MS-PCR. El aislamiento del ADN a partir de sangre periférica se realizó por un método salino estándar (10). Para la detección del polimorfismo en estudio, el promotor del gen del AGT fue amplificado mediante la técnica conocida como MSPCR (Mutagenically Separated PCR), en la cual tanto el alelo mutante como el normal son amplificados en la misma reacción, usando iniciadores alelo-específicos de diferentes longitudes (11, 12). Los iniciadores empleados fueron los siguientes: P1: 5'-TACCCAGAACAACGGCAGCTTCTTCCACT- 3'. P2: 5'-CCGGTTACCTTCTGCTGTACAGCCCAGAACAACGGCAGCTTCTTCCATC- 3'. P3: 5'-GTGTCGCTTCTGGCATCTGTCCTTCTGG-3' (11). La mezcla de reacción de un volumen final de 25µl contenía 1 unidad de la enzima polimerasa ATE (polimerasa de ADN Termoestable) de FUNDAIM, 1.5mM de MgCl₂, 250µM de dNTP, amortiguador de PCR 1X (50mM KCL, 10mM tris-HCl pH 9.25-9.75, 1% Tritón X-100), 1M de Solución E (según el protocolo de la polimerasa ATE), 10pmoles de cada iniciador y entre 20-100ng de ADN. La amplificación se llevó a cabo empleando el siguiente programa: 94º C por 5 min., 35 ciclos con 94º C por 45 seg., 62º C por 45 seg., 72º C por 45 seg., y finalmente 72º C por 7 minutos (13). Los productos de PCR fueron analizados mediante electroforesis en geles de agarosa al 3% en amortiguador TBE 0.5X. Luego de la corrida fueron teñidos con bromuro de etidio (5,0 µg/mL), visualizados en un transiluminador (FisherBiotech) y fotografiados para su análisis y registro.

Una vez comprobada la integridad del ADN extraído se realizó la MS-PCR a cada una de las muestras con el fin de detectar los diferentes polimorfismos derivados de la mutación –6A/G en el promotor del gen AGT. La longitud de los iniciadores alelo específicos difiere en 20 nucleótidos, por lo tanto, el tamaño de los productos de amplificación de los alelos A y G fueron: de 171 pb y 191 pb, respectivamente. En este sentido, para aquellos pacientes homocigotos para el alelo A (AA) se obtuvo una banda de 171 pb, para los pacientes homocigotos para el alelo G (GG) una banda de 191 pb y finalmente para los pacientes heterocigotos (AG) se obtuvieron dos bandas de los tamaños correspondientes (Figura 1). La misma asignación de genotipos se realizó con los individuos controles (Figura 2).

Análisis estadístico. Para la evaluación de la relación que pudiese presentar alguno de los genotipos derivados del polimorfismo -6 A/G del gen bajo estudio con la progresión de la MCC, se desarrolló una prueba de c² con 2 grados de libertad y un nivel de significancia de 0,005.

Para la elaboración de este estadístico se planteó como Hipótesis nula (Ho) que la MCC era independiente de cualquiera de los genotipos derivados del polimorfismom bajo estudio y el criterio para aceptar dicha hipótesis consistió en que el valor de c² que se obtuviese debía ser menor o igual al valor de c² _0.995 para 2 grados de libertad, el cual corresponde a 10,5965. En la tabla 1 se muestran las frecuencias obtenidas y esperadas de los diferentes genotipos derivados del polimorfismo -6 A/G para pacientes y controles, observándose que la distribución de los genotipos GG, AA y AG no difieren significativamente entre los dos grupos (1, 3, y 18 respectivamente en pacientes y 1, 2, 16 en controles) con un valor de c² obtenido de 0,0983, con lo cual se acepta la Ho lo que sugiere que la MCC es independiente de cualquiera de los genotipos derivados del polimorfismo -6 A/G para los efectos de este estudio.

Por su parte, en la tabla 2 se muestran las frecuencias observadas y esperadas de los alelos A y G del gen AGT para pacientes y controles. El equilibrio Hardy-Weinberg fue confirmado mediante c², y el valor obtenido para este estadístico (c²= 2,01 < c² _0.995= 7.8794; p<0,005) indica que las frecuencias de los diferentes alelos son virtualmente idénticas a las esperadas para una población que está en equilibrio de Hardy-Weinberg.

(Frecuencias Esperadas)

(Frecuencias Esperadas)

En los últimos años se ha explorado la posibilidad que diferentes genes modificadores, puedan estar obrando sobre la expresión fenotípica de la hipertrofia cardiaca en pacientes con cardiomiopatía. Dentro de este grupo de genes, el del angiotensinógeno pareciera estar jugando un papel importante en la expresión fenotípica de la miocardiopatía. En estudios más recientes (13) se demostró la existencia, con mayor frecuencia en hipertensos, de una variante en el promotor del gen, en la cual una guanina en la posición –6 (variante -6G) desde el sitio de iniciación (+1), ha sido sustituida por una adenina (variante -6A). Dado que también demostraron que el gen con adenina en posición -6 es transcrito con más eficiencia in vitro que la variante encontrada con más frecuencia en normotensos, estos autores sugieren que ésta es la forma original del gen y proponen que dicha variante predispone genéticamente a la HTA. Más recientemente, Liu y col., (17) reportan el papel que desempeñan los polimorfismos –6 A/G y M235T en el desarrollo de hipertensión esencial en la población china.

Diversos trabajos han aportado evidencias de la predisposición genética a desarrollar la MCC. En Venezuela se han realizado estudios con pacientes crónicamente infectados con T. cruzi, reportando que polimorfismos en genes que codifican para diferentes elementos del sistema inmune del paciente, específicamente del sistema HLA, parecen jugar un importante papel en la evolución de la enfermedad de Chagas (18-20). El presente estudio intenta explicar las diferencias encontradas entre pacientes chagásicos con respecto a la progresión de la MCC, basándonos en la suposición de que estas diferencias podrían estar siendo determinadas por características genéticas de cada individuo (8). De aquí nuestro interés en encontrar una asociación entre los genotipos derivados del polimorfismo -6 A/G en el promotor del gen del angiotensinógeno con el desarrollo de la MCC. Los resultados obtenidos sugieren que posiblemente no existen diferencias estadísticamente significativas entre pacientes Chagásicos tipo 3 e individuos controles Chagas negativos, con respecto a la presencia de los diferentes genotipos derivados del polimorfismo –6 A/G del gen estudiado y el desarrollo de MCC. Un estudio similar al presente es el de Brugada y col., (8) quienes estudiaron el papel que la variante -6 A/G pudiese estar desempeñando en la expresión fenotípica de la hipertrofia ventricular izquierda en pacientes con Miocardiopatía Hipertrófica (MCH), y en el cual no se encontró efecto significativo del gen del angiotensinógeno sobre los índices de MCH, al igual que en esta oportunidad en pacientes con MCC. Por otra parte, los estudios de Arzola y Chacón (14) y Mendible (16), quienes estudiaron la relación en polimorfismos del gen AGT con el desarrollo de infarto al miocardio, encontraron que la variante -6A se encuentra en total desequilibrio de enlace con otra variante en el mismo gen (235T) y que la primera variante mencionada es responsable del desarrollo de infarto al miocardio en pacientes venezolanos. En este sentido, se debe considerar el estudio, en trabajos posteriores, tanto de este haplotipo (-6A/235T) como de otros, considerando que estos podrían tener un mayor valor pronóstico en pacientes chagásicos que el estudio de un sólo polimorfismo (8, 13, 14, 15, 19, 21, 22).

Este artículo está dedicado a la memoria del Dr. Juan Carlos Mendible. Los autores expresan su agradecimiento al personal de la Unidad de Cardiomiopatías del Hospital Universitario de Caracas, así como también a la Unidad de Cardiología del Instituto de Medicina Tropical de la Universidad Central de Venezuela, y a los pacientes

y controles que participaron en este estudio. Este trabajo fue presentado parcialmente en la 54 Convención Anual de la ASOVAC, Valencia (Venezuela), 2004.

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