Sobrevivencia de Sitophilus oryzae (L.) en harina cruda y extruida de granos de Canavalia ensiformis

Nelson C Zamora*

* Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”. Departamento de Fermentación. e-mail: nelsonczamora@hotmail.com,  nelsonczamora56@yahoo.es.

RESUMEN

El objetivo de este trabajo fue evaluar la sobrevivencia de gorgojos adultos del arroz (Sitophilus oryzae) en harina cruda y extruida de granos de Canavalia ensiformis. Se determinó el contenido de los factores antinutricionales (título hemaglutinante y canavanina). La actividad hemaglutinante de la harina cruda fue eliminada, como resultado de la alta temperatura (155 ˚C) empleada durante el proceso de extrusión. El contenido de canavanina en la harina cruda y extruida no fue afectado por la extrusión. Se midió la sobrevivencia de gorgojos adultos del arroz como respuesta a dietas con harinas y almidón de granos de Canavalia. La sobrevivencia de los gorgojos alimentados con harina cruda y extruida fue menor que la de los insectos mantenidos en ayunas (control negativo, es decir, sin alimento). La diálisis de las harinas mejoró la sobrevivencia de los gorgojos en relación al control negativo, pero no se alcanzó la sobrevivencia de los gorgojos alimentados con harina de cotiledones de arvejas (control positivo). La suplementación de las harinas con arginina (0,1%) no produjo mejora en la sobrevivencia de los insectos. La mortalidad de los gorgojos en almidón de harina extruida fue similar al control negativo. En general, los resultados indican que S. oryzae es susceptible a los factores antinutritivos tales como canavanina.

Palabras clave: Canavalia ensiformis, Sitophilus oryzae, gorgojo del arroz, harinas, factores antinutricionales.

ABSTRACT

The purpose of this work was to evaluate the survival of Sitophilus oryzae (L.) on raw and extruded jack bean (Canavalia ensiformis) seeds fluor. The content of antinutritional factors (haemaglutination title and canavanine) was determined. The haemagglutinating activity was eliminated as result of the high temperature (155 ˚C) employed during the extrusion process. The canavanine content in raw and extruded fluor was not affect by the treatment of extrusion. Survival was measured in adult rice weevils (Sitophilus oryzae) fed diets with fluors and starch of C. ensiformis seeds. Survival of rice weevils fed with raw and extruded fluor was lower than that of the weevils kept in starvation (negative control). The dialysis of raw and extruded fluor improved the survival of S. oryzae in relation to the negative control, but survival was not as good as in the insects fed with pea cotyledons fluor (positive control). The fluors supplemented with arginine (0,1%) did not show improved in the survival of rice weevils. The mortality caused by starch of extruded fluor was not different from that of the negative control. As a whole, the results indicate that S. oryzae is susceptible to antinutritive factors such as canavanine.

Key words: Canavalia ensiformis, jack bean, Sitophilus oryzae, rice weevil, fluors, antinutritional factors.

INTRODUCCIÓN

La Canavalia ensiformis es una buena fuente de energía, proteínas, vitaminas y minerales para ser usada en la alimentación de humanos y animales (1, 2). Sin embargo, este enorme potencial nutritivo se ve reducido por todo un conjunto de diversas sustancias que obstruyen la utilización de sus nutrientes, los factores antinutricionales (FAN), definidos como compuestos naturales provenientes principalmente del metabolismo secundario de las plantas, que reducen el consumo del alimento y su utilización por los animales (3).

Específicamente, en la Canavalia ensiformis se han identificado la concanavalina A, una lectina hemaglutinante; y la canavanina, un aminoácido no proteico homólogo de la arginina, como los FAN de mayor importancia presentes en los granos de Canavalia (1, 4, 5). Para la utilización de la Canavalia como ingrediente para la alimentación animal se han realizado diversos procesos de detoxificación, con resultados positivos en el mejoramiento de su calidad nutricional (4). Se ha evaluado el efecto del proceso de extrusión, una tecnología de temperatura alta/tiempo corto que permite obtener una gran variedad de alimentos e ingredientes; es versátil, tiene una alta productividad y calidad en los productos, con la eliminación de los principales FAN y una mínima degradación de nutrientes (6).

La utilización de estos nutrientes básicos entre los distintos grupos de la escala zoológica son semejantes y la digestión de los alimentos se realiza extracelularmente en el tracto digestivo. Los macronutrientes deben ser hidrolizados para que sus productos sean asimilados. En consecuencia, los sistemas enzimáticos de los animales catalizan reacciones similares y son afectados de manera análoga por diversos FAN producidos por las plantas (7). Tales similitudes han hecho posible la implementación de sistemas modelo para estudios nutricionales, como los gorgojos del arroz (Sitophilus oryzae) (8). Este bioensayo con insectos tiene como ventajas la corta duración y el menor costo de los experimentos. La pequeña cantidad de alimento requerida para cada ensayo permite evaluar el efecto de los FAN. Por otra parte, se trabaja con pequeñas poblaciones de insectos, lo que permite disminuir la variabilidad de los parámetros estudiados y facilita los análisis estadísticos (8, 9).

La forma más sencilla de evaluar la toxicidad de alimentos en el bioensayo con gorgojos del arroz es monitoreando la sobrevivencia de aquellos que reciben el alimento que se sospecha tóxico y compararla con la de otros alimentos con una dieta nutricionalmente satisfactoria (harina de cotiledones de arvejas peladas) o mantenidos en ayunas (8). El objetivo del presente trabajo fue evaluar la sobrevivencia de gorgojos adultos del arroz (Sitophilus oryzae) en harina cruda y extruida de granos de Canavalia ensiformis.

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales

Granos: Se utilizaron granos de Canavalia ensiformis, correspondientes al genotipo Original, los cuales fueron suministrados por la Facultad de Agronomía de la Universidad Central de Venezuela, Maracay. Así mismo, los granos de arvejas peladas (Pisum sativum), fueron obtenidos de un establecimiento comercial de la localidad.

Insectos: En el presente estudio se utilizaron como animales experimentales gorgojos adultos de arroz, Sitophilus oryzae L. (Coleoptera: Curculionidae), donados por el Departamento de Entomología de la Facultad de Agronomía de la Universidad Central de Venezuela.

Métodos

Obtención de las harinas: Los granos de Canavalia ensiformis y Pisum sativum se limpiaron para eliminar las impurezas y se molieron en un molino de impacto marca Arthur Thomas, hasta obtener una harina capaz de pasar a través de un tamiz de malla 60 mesh (0,25 mm de abertura de poro). Las harinas se envasaron en recipientes plásticos con cierre hermético.

Obtención de la harina extruida: Una porción de la harina cruda de C. ensiformis (5 kg), fue sometida al proceso de extrusión en un extrusor semi-industrial marca The Bonno, modelo 21/2, bajo las siguientes condiciones de operación: humedad de la harina cruda 20%; temperatura 155 ˚C; velocidad del tornillo 75 rpm; velocidad de alimentación 205 g/min. El producto obtenido de la extrusión fue enfriado a temperatura ambiente (25 ˚C) y molido hasta obtener una harina que pasara a través de malla de 60 mesh (0,25 mm). La harina extruida se envasó en recipiente plástico con cierre hermético.

Extracción de los almidones: Se utilizó el método reportado por Sathe y Salunkhe (10), el cual consistió en un fraccionamiento húmedo de los componentes de la harina cruda y extruida de Canavalia. Se usó una preparación comercial de almidón de papa (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), con fines comparativos de las dietas en la sobrevivencia de los gorgojos.

Factores antinutricionales: a) Título hemaglutinante: se realizó por el método señalado por Jaffé y Brücher (11), utilizando eritrocitos lavados de sangre de conejo sin tratamiento enzimático previo y pre-tratados con pronasa y tripsina. b) Canavanina: se determinó por el método colorimétrico de Rosenthal (12), usando el reactivo pentacianoaminoferrato al 1%.

Tratamiento de diálisis: Se prepararon suspensiones mezclando la harina cruda y extruida con agua destilada en una relación 1:20 (harina:agua), las cuales se colocaron en membrana de diálisis de celulosa natural, dializándose contra agua destilada a 4 ˚C por 72 horas con ocho cambios de agua. Las harinas fueron secadas a 37 ˚C y conservadas en envases plásticos con cierre hermético.

Cultivo de los insectos: Los cultivos se establecieron colocando 60 gorgojos adultos en cotiledones de arvejas (300 g) en envases de vidrio cerrados, protegidos de la luz y mantenidos a temperatura ambiente (25 ˚C), por 20 días, para permitir la ovoposición. Luego se retiraron los padres y se esperó la aparición de nuevos adultos, generación (F1), a los 20 días, que fueron usados en el ensayo de sobrevivencia.

Suplementación de las harinas con arginina: A las harinas que conformaban las dietas del ensayo se les agregó el aminoácido homólogo de la canavanina, arginina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), en una concentración de 0,1%.

Dietas experimentales: Para el ensayo de sobrevivencia de los insectos se prepararon semillas artificiales, con forma de esferas de 3-5 mm de diámetro, amasando las harinas (arvejas, Canavalia cruda, Canavalia extruida, dializadas, fracciones de almidón) con agua destilada. Las esferas se secaron en una estufa por 6 horas, a 37 ˚C y se conservaron en envases de plástico con cierre hermético a temperatura ambiente.

Ensayo de sobrevivencia de Sitophilus oryzae: Con los insectos cultivados en cotiledones de arvejas se conformaron, al azar, grupos de 40 individuos, que se colocaron en viales de vidrio de 25 ml con 2 g de la dieta correspondiente. Los viales se mantuvieron a temperatura ambiente en completa oscuridad. Cada ensayo experimental se realizó por triplicado. La duración de cada uno de ellos se indica en las figuras respectivas. La sobrevivencia de los gorgojos fue establecida en comparación con la de un control negativo, en el cual los insectos son colocados en un vial sin alimento o dieta (control de ayunas) y con la de gorgojos alimentados con harina de arveja o almidón de papa (control positivo). Los animales se contaron diariamente, descartándose los animales muertos.

Análisis estadísticos: Los resultados se expresaron como porcentaje de sobrevivencia. Los datos de los resultados obtenidos se analizaron utilizando el programa Number Cruncher Statistical System (versión 4,22) para computadoras IBM, elaborado por Jerry L. Hintze, Kayville, Utah, 1986.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Factores antinutricionales

Los resultados obtenidos en la determinación de los factores antinutricionales (título hemaglutinante y canavanina) de las harinas de Canavalia ensiformis analizadas, se muestran en la Tabla N˚ 1. Se observa que en comparación con los eritrocitos sin tratamiento enzimático, la incubación con tripsina y pronasa aumentó sustancialmente el título hemaglutinante de los extractos de la harina cruda, indicando que estos tratamientos aumentan la sensibilidad de los eritrocitos de conejo frente a la concanavalina A. El proceso de extrusión fue efectivo para eliminar la actividad hemaglutinante presente en la harina cruda de canavalia, de tal forma que ésta no fue detectada en los eritrocitos activados con las enzimas proteolíticas. Estos resultados son similares a los reportados por otros autores (13, 14), quienes observaron una alta sensibilidad de las hemaglutininas a los tratamientos térmicos.

TABLA N˚ 1 Concentración de canavanina y título de hemaglutinación en las harinas de Canavalia ensiformis

* Los valores corresponden a la máxima dilución donde se observa hemaglutinación macroscópica en 1 hora a temperatura ambiente.

ND: No Detectable

** Gramos de canavanina/100 g de harina. Los valores son las medias ± la desviación estándar de 4 determinaciones.

El contenido de canavanina no fue afectado por el proceso térmico aplicado. Por su parte, el tratamiento de diálisis disminuyó el contenido de canavanina de las muestras hasta valores cercanos al límite de detección del método utilizado. Los resultados coinciden con los reportados por Tepal y col. (14). Debido a que la temperatura de descomposición de la canavanina es de 184 ˚C, resulta razonable que el tratamiento de extrusión realizado a 155 ˚C no afectó el contenido de este aminoácido. El ligero incremento reportado en la Tabla N1, puede deberse a que el método de detección de la canavanina no es 100% específico, pudiendo detectar productos de su descomposición. El método ha sido criticado por carecer de una especificidad absoluta y un umbral elevado de sensibilidad (15, 16). La disminución de la concentración de canavanina cuando se sometió al proceso de dializado, podría deberse a la solubilidad del aminoácido en agua y su eliminación por permeación a través de la bolsa de diálisis (4). Los resultados obtenidos con las harinas dializadas confirman estudios previos, los cuales mencionan pérdida del aminoácido en el agua de diálisis y a temperaturas superiores a 184 ˚C (4).

Ensayo de sobrevivencia de gorgojos del arroz (Sitophilus oryzae)

En el Gráfico N˚ 1 se presentan los resultados de los experimentos de sobrevivencia de gorgojos del arroz adultos en harina de arvejas peladas o almidón de papa, y en ausencia de alimentos (control en ayuno). En los dos primeros casos se observó una sobrevivencia del 100% durante los 20 días del ensayo. En el control en ayuno se encontró la mortalidad progresiva de los insectos, de tal manera que después de 11 días de ayuno, 50% de los insectos había muerto y ninguno de ellos permaneció vivo después del día 19. Estos resultados indican que tanto la harina de arvejas peladas como el almidón de papa proveen los nutrientes necesarios para asegurar la sobrevivencia de los insectos y que el ayuno conduce a la muerte de los insectos, por lo cual se utilizaron como controles positivos y negativos en los ensayos. Estos resultados obtenidos son similares a los reportados por otros autores para otras leguminosas (8).

El efecto de la harina cruda y extruida de Canavalia sobre la sobrevivencia de los gorgojos se presenta en el Gráfico N˚2. Ambas harinas causaron un fuerte efecto deletéreo sobre los insectos, los cuales murieron antes que el control en ayuno. Aparentemente, la harina cruda produjo un efecto nocivo ligeramente más pronunciado que la harina extruida, determinado por el tiempo necesario para que se produzca 50% de mortalidad, 7,5 días para la harina cruda y 9 días para la harina extruida. En el control en ayuno, el 50% de mortalidad de los insectos ocurrió a los 11 días. En el control de arvejas no se detectó la muerte de los insectos durante los 20 días del ensayo. Como las harinas aceleran la muerte de los gorgojos en comparación con el control en ayuno, es razonable suponer que éstas ejercen un efecto tóxico sobre ellos. Los resultados del Gráfico N˚ 2, sugieren que el principal factor tóxico es de carácter termoestable, posiblemente la canavanina, la cual prácticamente no fue afectada por el proceso térmico aplicado.

En el Gráfico N˚ 3 se muestra el efecto de las harinas de Canavalia cruda y extruida dializadas, donde se observa que la sobrevivencia de los gorgojos mejoró en comparación con las harinas no dializadas (Gráfico N˚ 2). Estos resultados pueden explicarse por la disminución del contenido de canavanina cuando las harinas fueron sometidas al tratamiento de diálisis, debido a la solubilidad del aminoácido en agua y su eliminación a través de la bolsa de diálisis por permeación (4). Los resultados obtenidos coinciden con los reportados por Gómez (4), quien encontró que a los niveles de canavanina presentes en las harinas dializadas no se observó toxicidad sobre los gorgojos adultos. No obstante, la mortalidad de los insectos fue mayor cuando fueron sometidos a dietas de harina extruida dializada. Resulta difícil determinar si este incremento de la mortalidad se debió a algún agente tóxico residual, o a un rechazo de los insectos a comer las harinas dializadas por carecer de un nutriente esencial o la dilución de éstos durante la diálisis. La mortalidad de los insectos privados de alimentos fue muy acentuada cuando fue comparada con las harinas dializadas. Considerando que el efecto tóxico de canavanina se ha atribuido a su analogía estructural con la arginina (17), se ensayó el efecto de este aminoácido sobre la sobrevivencia de los insectos. Los resultados obtenidos se muestran en el Gráfico N˚ 4, donde se observa que la adición de arginina no produjo una mejora en la sobrevivencia de los insectos. La harina cruda con arginina tuvo un efecto deletéreo similar al control en ayuno. Los resultados de la harina cruda dializada con arginina mostraron una ligera mejoría en la sobrevivencia a partir del día 13. Ambas harinas suplementadas causaron un fuerte efecto tóxico después del sexto día del ensayo. La suplementación con arginina no fue efectiva en la utilización del aminoácido por los insectos, probablemente debido a la compleja interacción y antagonismo entre el aminoácido y su análogo (18). Swaffer y col. (19) han observado que la canavanina es activa como un antagonista de la arginina sólo en condiciones de baja concentración de arginina, como es el caso de la concentración utilizada para suplementar la harina cruda y dializada. Janzen y col. (20) reportaron que los aminoácidos proteicos, a niveles superiores al 1%, tienen efectos tóxicos sobre el Callosobruchus maculatus. Sin embargo, en sus ensayos el efecto de la arginina no fue estadísticamente significativo, en comparación con el control que no contenía el aminoácido. De acuerdo con lo expresado por estos autores, los insectos son excepcionalmente sensibles a la composición de sus dietas, por lo que cambios en la proporción relativa de un aminoácido pueden afectar la captación y utilización de otros.

En el Gráfico N˚ 5 se muestra el efecto de la suplementación con arginina de la harina extruida y dializada de Canavalia sobre la sobrevivencia de Sitophilus oryzae. Los resultados obtenidos para la harina extruida con arginina mostraron que la mortalidad de los insectos se presentó a partir del sexto día del ensayo y fue esencialmente semejante a la del control en ayuno. Estos resultados pueden atribuirse a que durante el proceso de extrusión el contenido de arginina fue reducido, produciéndose un imbalance en el contenido del aminoácido en la harina tratada, lo cual podría ser asociado a una reducción del consumo voluntario del alimento por los insectos (21, 22, 23). Es posible que eventos similares puedan ocurrir en animales monogástricos alimentados con harina de Canavalia (22, 23). En relación a la harina extruida dializada con arginina, se observó que mejoró la sobrevivencia de los gorgojos respecto al control en ayuno. Esto podría deberse al bajo contenido de canavanina presente en la harina dializada (Tabla N˚ 1). En tanto que la suplementación con arginina podría tener un efecto de enmascaramiento de la inhibición tóxica de la canavanina por homología estructural, actuando como antagonista por estar ambos aminoácidos a baja concentración (19).

Considerando que los gorgojos sobrevivieron normalmente en la preparación comercial de almidón de papa (Gráfico N˚ 1), se comparó la sobrevivencia de estos insectos mantenidos con dietas a base de almidones de Canavalia, aislados de la harina cruda y extruida (Gráfico N˚6). Los resultados obtenidos con almidón de la harina cruda muestran que no se produjo mortalidad de los insectos, los cuales sobrevivieron, igual que los alimentados con almidón de papa, durante los 20 días del experimento, lo que podría atribuirse al aporte de nutrientes de ambos sustratos. Los resultados de mortalidad de los gorgojos colocados en almidón extraído de la harina extruida fueron semejantes a los del control en ayuno. Esto puede ser atribuible a la acción de factores tóxicos residuales o a la baja disponibilidad de nutrientes del almidón no digerible, que limitan su consumo por los insectos. Se ha reportado que algunas fracciones de almidón aisladas de harina de Canavalia, en cuanto a composición, tienen considerables cantidades de proteínas insolubles (24, 25).

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

En general, los resultados presentados en este trabajo indican que las harinas resultaron tóxicas para los gorgojos del arroz y que éstos son muy susceptibles frente a factores tóxicos termoestables como la canavanina presente en la harina de los granos de Canavalia. Esto puede ser de mucha utilidad en la evaluación nutricional de harinas de leguminosas, y de fracciones obtenidas a partir de éstas, para realizar estudios sobre nutrición básica aplicada a los humanos y animales.

El modelo utilizado para la evaluación de la toxicidad basado en la sobrevivencia de gorgojos del arroz adultos (S. oryzae), es de tal complejidad que no es suficiente para demostrar el efecto de los tratamientos sobre la toxicidad de las harinas, pudiendo determinarse respuestas sólo cuando las diferencias en la calidad de la dieta son acentuadas, es decir, arvejas vs Canavalia cruda, pero no Canavalia cruda vs extruida.

Se recomienda que para lograr una comparación significativa entre los tratamientos es necesario diluir las harinas con un componente no tóxico (harina de arroz, arvejas o almidón de maíz), con lo cual puede lograrse aumentar la vida media de los insectos.

AGRADECIMIENTOS

El autor agradece al doctor Andrés Carmona la constante ayuda prestada, así como sus valiosas observaciones durante la realización de este trabajo. Igualmente, al grupo del Laboratorio de Bioquímica Nutricional y Metabolismo, Instituto de Biología Experimental, Universidad Central de Venezuela, por posibilitar el uso de sus laboratorios para el desarrollo de este trabajo.

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