Comparación de los métodos Petrifilm^TM coliformes y Número Más Probable (NMP) para la determinación de coliformes fecales en muestras de queso blanco

Miriam C Ortiz L¹; Manuela Ríos de S¹

¹ Departamento de Microbiología de Alimentos. Gerencia de Registro y Control. Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel", miriamortiz@yahoo.es

RESUMEN

Los coliformes fecales son un grupo importante de microorganismos indicadores de inocuidad en alimentos, constituido principalmente por Escherichia coli, el cual es considerado como indicador de contaminación reciente de origen fecal, por ello la importancia de investigar su presencia y determinar rápidamente el nivel poblacional en alimentos. Este trabajo tiene como objetivo comparar el método tradicional Número Más Probable (NMP) para la determinación de coliformes fecales, según Norma Venezolana Covenin Nº 1104-96 con el método de placas rehidratables Petrifilm^TM 3M coliformes incubadas en baño de agua circulante (PBA) a 45 ± 0,2°C por 24 ± 2 horas y en estufa con aire circulante 44 ± 1°C por 24 ± 2 horas (PES) de acuerdo con lo recomendado por la Asociación Francesa de Normalización (AFNOR) y la Corporación 3M. Se analizaron un total de 42 muestras de queso blanco aplicando ambas metodologías, dispensando simultáneamente diluciones seriadas de las muestras. Para el análisis estadístico se realizó una correlación de muestras relacionadas (SPS versión 7,5), obteniéndose los siguientes resultados r = 0,952 entre NMP y PES y r = 0,944 entre NMP y PBA; lo que indica una buena correlación positiva entre ambas metodologías en sus diferentes modalidades para la determinación de coliformes fecales en muestras de queso blanco. Se concluye que las placas Petrifilm^TM coliformes incubadas a la temperatura óptima de crecimiento de dichos microorganismos es un método alternativo, rápido y confiable para la determinación del nivel de coliformes fecales en queso blanco.

Palabras clave: Coliformes fecales, Petrifilm^TM, método del Número Más Probable, queso blanco.

Fecal coliform belong to an important group of sanitary quality indicator microorganisms in food, mainly constituted for Escherichia coli, considerated as indicators of recent fecal contamination, that is why it is very important to investigate their presence and to detect their population in food rapidly. The objetive of this study was to compare the Most Probable Number (NPM) method for fecal coliform determination, according to Venezuelan standard COVENIN Nº 1104-96, with the coliform Petrifilm^TM 3M^TM plates, incubated in circulating thermostatically – controlled water bath (PBA) at 45 ± 0,2 ° C for 24 ± 2 hours and in a circulating air incubator at 44 ± 1° C for 24 ± 2 hours (PES), according to the recommendation of Association Francoise of Normalization, Paris (AFNOR) and 3M^TM corporation. Forty-two white cheese samples were analyzed using both methods mentioned above. They were dispensed at the same time with decimal dilutions of the samples. Data generated were subjected to correlation of related samples (SPS 7.5 version) and the correlation coefficients (r) were obtained; r = 0.952 NMP and PES; r = 0.944 NMP and PBA. It is interesting to observe a good correlation between the methodologies in their different forms for fecal coliform determination in white cheese. Coliform Petrifilm^TM plates incubated at the optimal temperature of coliform fecal culture represent a rapid alternative and reliable method for the assessment of fecal coliform population in white cheese.

Key words: Fecal coliform, Petrifilm^TM, Most Probable Number Method, White Cheese.

Los coliformes fecales conforman un grupo importante de microorganismos indicadores de calidad sanitaria en alimentos, representado por cuatro géneros de la familia Enterobacteriaceae: Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella y Escherichia, siendo este último el de mayor importancia; este género está constituido principalmente por Escherichia coli (1).

Escherichia coli se encuentra de manera natural y exclusiva en el intestino de humanos y animales de sangre caliente, por lo que su detección en alimentos constituye la evidencia más segura de que han sido expuestos recientemente a materia fecal y, por ende, al riesgo de que otras cepas patógenas de Escherichia coli u otros patógenos de hábitat intestinal estén presentes. Para la determinación de Escherichia coli en alimentos, se han utilizado métodos de Número Más Probable NMP/g o ml y recuentos en placas con agares selectivos (UFC/g ó ml). Ambos son largos (5-7 días) y costosos, recientemente se han introducido métodos basados en la reacción del 4 metil umberilferyl-D-glucuronido (MUG), lo cual permite la identificación específica de Escherichia coli en tiempo corto (24 horas); sin embargo, su elevado costo limita el uso rutinario por parte de los laboratorios de control o por las empresas de alimentos.

Como alternativa para conocer la exposición del alimento a materia fecal, a través del tiempo se ha venido utilizando la investigación de coliformes fecales. Estos comprenden al grupo de coliformes que fermentan la lactosa con producción de gas a temperaturas elevadas (44- 45,5 ºC) en 48 horas; aunque es un término sin validez taxonómica, han sido ampliamente utilizados como indicadores de contaminación fecal reciente en alimentos procesados. Se ha comprobado que Escherichia coli representa el 75-95% de los coliformes fecales en áreas de cultivo de bivalvos (2).

Por otra parte, los métodos para su búsqueda han sido descritos y aprobados por organismos internacionales: Comisión Internacional de Especificaciones Microbiológicas en Alimentos (ICMSF) (3), Asociación Americana de Salud Pública (APHA) (4), Administración de Drogas y Alimentos (FDA) (5); Métodos de Análisis Oficiales Internacionales (AOAC) (6), y se han establecido criterios de aceptación y rechazo para lotes de diferentes tipos de alimentos (agua, productos lácteos, carnes y otros) a nivel internacional (5-7) y en nuestro país, a través de las Normas COVENIN (8).

En la actualidad existen alternativas a los métodos tradicionales que permiten obtener resultados confiables en forma rápida a bajo costo; una de ellas la constituyen los recuentos en placa utilizando películas de agares selectivos rehidratables (Petrifilm^TM), desarrollados por la compañía 3M^TM. Esta compañía ha diseñado placas para recuento de coliformes (violeta rojo bilis, agentes gelificantes e indicador tetrazolium) y de Escherichia coli (violeta rojo bilis, agentes gelificantes, indicador de glucuronidasa y tetrazolium), los cuales permiten obtener resultados en 24 horas, cuya confiabilidad y reproducibilidad han sido comprobados y han recibido la aprobación de la AOAC, Asociación Francesa de Normalización (AFNOR) (9), y por el Comité Nórdico de Análisis de Alimentos (NMKL). Aún no se han desarrollado placas específicas para la determinación de coliformes fecales, sin embargo es necesario disponer de una metodología rápida para detectarlos ya que las Normas COVENIN para productos procesados contemplan requisitos para estos indicadores de contaminación entérica. La compañía 3M y la AFNOR sugieren el uso de las placas coliformes para la búsqueda de coliformes fecales; esta propuesta motivó la realización de este estudio, el cual tiene por objetivo evaluar el uso de las placas Petrifilm^TM coliformes para la investigación de coliformes fecales en forma rápida, incubándolas a temperaturas elevadas: 44 ºC ± 1 ºC, por 24 horas en estufa con aire circulante (PES), según lo recomendado por AFNOR (9) y 3M^TM (10) y a 45 ºC ± 0,2ºC por 24 horas, en baño de agua circulante (PBA) (8), comparando ambos resultados con el método tradicional de NMP, en muestras de queso blanco.

La Corporación 3M^TM suministró las placas Petrifilm^TM coliformes necesarias para realizar este estudio, el cual se realizó en dos etapas: en la primera se utilizaron cepas de Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli aislada en el Departamento de Microbiología de Alimentos proveniente de una muestra de queso blanco y Enterobacter cloacae, cepa donada por el Departamento de Microbiología de Medicamentos y Cosméticos, con la finalidad de comparar la eficiencia de los métodos.

En la segunda etapa se analizó por ambas metodologías un total de 42 muestras de queso blanco procedente de diferentes productores, captadas en el Mercado Mayor de Coche por las autoridades del Distrito Sanitario Nº 4 Caracas.

La determinación de coliformes fecales se realizó de acuerdo con el método del Número Más Probable (NMP) según la Norma COVENIN 1104-96 (8); para ello el recuento de coliformes fecales se determinó inoculando una serie de tres tubos con las diluciones apropiadas en agua peptonada al 0,1%, caldo lauril sulfato triptosa (CLST). Aquellos tubos que después de incubar a 35 ± 1ºC mostraron la presencia de gas dentro de las 48 ± 2 horas siguientes a la inoculación, fueron transferidos a caldo EC e incubados a 45 ± 0,2 ºC en baño de agua circulante por 24 ± 2 horas a fin de observar la presencia de gas; la lectura de los tubos se realizó con la Tabla de NMP (8).

Simultáneamente se inocularon las diluciones decimales realizadas en agua peptonada al 0,1% en placas Petrifilm^TMcoliformes, por duplicado, y fueron incubadas a 44 ± 1 ºC en cámara húmeda por 24 ± 2 horas en estufa de aire circulante, según lo indicado por la empresa 3M^TM y AFNOR. En el presente estudio se utilizó una estufa de aire circulante Precision Scientific, modelo 3EG, sensibilidad ± 1 ºC. Otro grupo de placas sembradas también por duplicado y colocadas en bolsas plásticas selladas, se incubaron en baño de agua circulante a 45 ± 0,2 ºC, temperatura recomendada para la determinación de coliformes fecales por el método tradicional.

Finalizado el período de incubación, en ambos grupos de placas se efectuó el recuento de colonias rojas asociadas a gas. Se contaron las placas que tenían entre 15 y 150 colonias, según indicaciones del fabricante.

Se aplicó un análisis de parámetros estadísticos descriptivos, tales como: Media, Desviación estándar y Varianza (Tabla 1).

Tabla 1 Nivel promedio de coliformes fecales determinado por los métodos NMP, PBA y PES en muestras de queso blanco

Para hacer la comparación entre los métodos: Petrifilm^TM coliformes y Número Más Probable (NMP) se efectuó un análisis de correlación de muestras relacionadas utilizando el Programa Estadístico SPS versión 7.5 (Tabla 2).

Tabla 2 Análisis de correlación de muestras relacionadas entre los métodos NMP, PES y PBA

Para la aplicación de los análisis estadísticos, se consideraron los contajes obtenidos por el NPM menos de 3 como 0.

Los niveles promedio de coliformes fecales, la desviación estándar y la varianza de los resultados obtenidos por los diferentes métodos se muestran en la Tabla 1. Las pequeñas diferencias entre las desviaciones estándar de los métodos NMP, PES y PBA sugieren que los métodos son reproducibles y confiables, evidenciándose de este modo la precisión de ambos métodos.

El estudio estadístico de los resultados (Tabla 1) entre los métodos comparados Número Más Probable (NMP) para coliformes fecales y PES, NMP y PBA, PES y PBA arrojó los siguientes coeficientes de correlación positivos significativos: 0,952, 0,944 y 0,986 respectivamente (Tabla 2), lo cual indica que existe una alta correlación lineal directa entre ambas metodologías en sus diferentes modalidades, existiendo una mejor correlación entre el método tradicional NMP y PES en comparación con NMP y PBA (0,952 Vs 0,944 PBA).

Por otro lado es necesario destacar que los valores de coliformes fecales obtenidos por el método NMP fueron en su mayoría más altos (Media = 4,63) que con Petrifilm^TM, lo cual está en concordancia con lo señalado por algunos autores como Acosta Salinas (11), quién estableció una comparación entre placas Petrifilm^TM Escherichia coli incubadas a 44,5 ºC por 24 – 48 horas en estufa y NMP para la determinación de Escherichia coli, concluyendo que Petrifilm^TM es un buen método para la determinación de microorganismos coliformes fecales (Escherichia coli) en alimentos, cuando la concentración se encuentra por encima de 10 UFC/g debido a la sensibilidad del método, encontrando que NMP es más sensible a concentraciones por debajo de lo antes mencionado, pero con la desventaja de que es un método lento y laborioso.

La AFNOR 1997 (9) estableció una comparación entre Petrifilm^TM coliformes incubado a 44 ± 1 ºC por 24 ± 2 horas en estufa y NMP para la determinación de coliformes fecales; para ello realizó un estudio en 202 muestras de productos lácteos y 92 muestras de productos cárnicos y vegetales, encontrando que Pertrifilm^TM coliformes resultó útil para la determinación de coliformes fecales, siendo un método exacto y seguro, no existiendo diferencia significativa entre ambos métodos y obteniendo resultados reproducibles y repetibles, logrando incluso la validación de las placas Petrifilm^TM coliformes para la determinación de coliformes fecales. Igualmente Zea, 2000 (12), comparó un método rápido para la determinación de coliformes con el método de NMP y Petrifilm^TM coliformes rápido igualmente, Priego y col. (13) compararon Petrifilm^TM 2000 y agar violeta rojo bilis, demostrando ambos autores que los métodos NMP, violeta rojo bilis y Petrifilm^TM son comparables.

Existe una alta correlación lineal directa entre los métodos NMP y PES (0,952) y NMP y PBA (0,944) para la determinación de coliformes fecales en muestras de queso blanco.

Los métodos NMP y Petrifilm^TM coliformes incubados en estufa o en baño de agua circulante son comparables y reproducibles.

Las placas Petrifilm^TMcoliformes incubadas a la temperatura óptima de crecimiento de dichos microorganismos, es un método alternativo, rápido y confiable para la determinación de coliformes fecales en queso blanco.

1. Doyle M. Food Microbiology fundamentals and frontiers. Washington DC: ASM Press; 1987.        [ Links ]

2. Paille et al. Seasonal variation in the fecal coliform population of Louisiana oysters and its relationship to microbiological quality. J. Food Protect. 1987; 50 (7): 545-549.        [ Links ]

3. The International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF). Microorganisms in foods 1. Their significance and methods of enumeration. 2 ed. Toronto: University of Toronto Press; 1978.        [ Links ]

4. American Public Health Association (APHA). Compendium of methods for the microbiological examination of foods, 3 ed. Washington D.C; 1992.        [ Links ]

5. Food and Drug Administration (FDA). Bacteriological analitical manual online. USA: Gaithersburg; 2001.        [ Links ]

6. Association of Official Agricultural Chemist (AOAC). Official methods of analysis. 17 ed. USA; 2000.        [ Links ]

7. The International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF). Microorganism in foods 2. Sampling for microbiological analysis. Principles and specific applications. Toronto: University of Toronto Press; 1986.        [ Links ]

8. Norma Venezolana COVENIN 1104-96 "Determinación del Número Mas Probable de coliformes fecales y Escherichia coli". Comisión Venezolana de Normas Industriales. Ministerio de Fomento. Publicación de Fondonorma. Caracas. Venezuela.        [ Links ]

9. Association Francoise of Normalization (AFNOR) "Attestation of validation of rapid methods of analysis". 1997.        [ Links ]

10. PETRIFILM TM 3M^TM Placas Recuento de coliformes, Folleto Teórico. 1999.        [ Links ]

11. Acosta S. Inventory of total coliform and fecal coliform organisms in cheese. Professional Thesis National Politecnical Institute; 1995.        [ Links ]

12. Zea Z. Evaluación de un método para la determinación de coliformes en leche pasteurizada y su comparación con el método de Número Más Probable (NMP) y Petrifilm^TM. 2000 Trabajo Especial de Grado Caracas: Universidad Central de Venezuela, Facultad de Ciencias; 2000.        [ Links ]

13. Priego R, Medina L, Jordano R. "Evaluation of Petrifilm^TM Series 2000 as a possible Rapid Method to count coliforms in Foods". J. Food Protection Vol. 63 (8), 2000:1137-1140.        [ Links ]