Pruebas analíticas de resistencia a antirretrovirales en pacientes infectados por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana Tipo 1 (VIH-1)

Cristina del R. Gutiérrez G.¹

¹ Departamento de Virología. Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”. Tlf (Fax): 693.4551. crisgutier@cantv.net

RESUMEN

La resistencia a antirretrovirales constituye un factor de fracaso terapéutico importante en el manejo clínico del paciente infectado por VIH. Se han descrito dos tipos de pruebas de laboratorio que permiten determinar sí un paciente bajo terapia antirretroviral ha desarrollado cepas del VIH resistentes: las pruebas fenotípicas y las pruebas genotípicas. Se sospecha de resistencia farmacológica cuando los niveles de carga viral aumentan (0,5 log), o permanecen detectables en mediciones repetidas. Las pruebas fenotípicas se basan en un análisis cuantitativo de la concentración de droga antirretroviral necesaria para la inhibición de la replicación del VIH in vitro, cuantificando así el grado de resistencia. Las pruebas genotípicas detectan la presencia de mutaciones en el genoma del VIH asociadas a resistencia a antirretrovirales. No existe una pauta sobre la interpretación de los resultados obtenidos de estas pruebas analíticas. La realización de análisis de resistencia como herramienta molecular de avanzada, aunado al análisis de la carga viral y el inmunofenotipaje constituye un importante aporte en el manejo y control del paciente infectado por VIH.

Palabras clave: VIH, ensayos de resistencia, drogas antirretrovirales, mutaciones, fenotipificación, genotipificación.

ABSTRACTS

Resistance to antiretroviral constitutes an important therapy failure factor in HIV infected patient clinic managing. Two laboratory tests have been described to determine HIV resistant isolates: phenotypic assays and genotypic assays. Pharmacologic resistance is suspected when HIV load viral levels increase (log 0.5) or remain detectable in repeated tests. Phenotypic tests are based in a quantitative assay of antiretroviral drug concentration required to inhibit HIV replication in vitro, quantifying also resistance levels. Genotypic tests detect the presence of HIV genomic mutations associated to antiretroviral resistance. No does exist a role about result interpretation obtained to these analytic tests. Resistance tests like advanced molecular instrument joined to load viral levels and immunophenotype assays in both constitute an important contribution in control and managing of HIV infected patients.

Keywords: HIV, resistance assays, antiretroviral drugs, mutations, phenotypification, genotypification.

INTRODUCCIÓN

La resistencia viral, en sentido amplio se define como cualquier cambio que mejore la replicación de un virus en presencia de un inhibidor (1). Sin embargo, estos microorganismos están provistos de una gran capacidad de adaptación a los cambios introducidos en su medio natural.

A diferencia de los virus ADN, los cuales son genéticamente más estables, los virus ARN presentan una elevada tasa de cambios o mutaciones (número de incorporaciones erróneas por nucleótido copiado) durante el proceso de replicación. La mayoría de los virus ARN generan variantes virales no idénticas pero genéticamente muy cercanas, denominadas cuasi-especies, las cuales se hayan sometidas a un continuo proceso de variación, competición y selección (2). Tal es el caso del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el cual se caracteriza por presentar altos niveles de replicación (10¹⁰-10¹¹ partículas virales producidas por día) y una elevada frecuencia de aparición de mutaciones (3x10^-5 pares de bases por ciclo de replicación), originando la formación y selección de diversas cuasi especies virales (3).

La notable variabilidad genética de este agente viral es conferida por su elevada tasa de replicación y por la acción de la enzima transcriptasa reversa (TR), carente de actividad exonucleasa 3'→ 5' correctora de errores y por ende responsable de la introducción de cambios o mutaciones a nivel genómico, que darán paso a la selección de cuasi especies en virtud de su capacidad de supervivencia en un ambiente “hostil” (4, 5). Estas mutaciones originadas durante la replicación del VIH se producen al azar y pueden resultar en defectos virales, los cuales pueden ser letales para el virus, o tener poca o ninguna consecuencia sobre la biología de la partícula viral (6).

El inicio de la terapia antirretroviral combinada entre 3 o 4 fármacos comenzó a mediados de los años 90 y resultó en una súbita disminución en la mortalidad y morbilidad entre pacientes infectados por el VIH. La gran eficacia de la terapia combinada estriba en el uso simultáneo de múltiples drogas activas, las cuales son más potentes y potencialmente más difíciles de ser superadas por cepas del VIH resistentes, en comparación con terapias menos efectivas (6).

Los fármacos antirretrovirales, especialmente cuando se utilizan en concentraciones subinhibitorias, seleccionan mutaciones asociadas a resistencia como consecuencia de la alta variabilidad del virus (7). En la actualidad, el fenómeno de resistencia a drogas antirretrovirales es uno de los principales aspectos de interés en la terapia de la infección por el VIH. A continuación, se tratarán aspectos fundamentales sobre las principales metodologías de laboratorio descritas para la determinación de este fenómeno en pacientes infectados por VIH.

RESISTENCIA A DROGAS ANTIRRETROVIRALES

El tratamiento con fármacos antirretrovirales se ha dirigido a la reducción de la carga viral del VIH en plasma por debajo de los niveles de detección, limitando así la posibilidad de selección de variantes resistentes del virus al tratamiento farmacológico y retrasando el comienzo del fracaso terapéutico. Sin embargo, a pesar de que en la actualidad disponemos de fármacos altamente eficaces, un número importante de los pacientes bajo terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA) pueden presentar fracaso terapéutico evidenciado por cargas virales detectables en plasma (fracaso virológico), falla inmunológica (disminución o aumento no satisfactorio de recuento de células CD4+) y/o un fracaso clínico: cuando se produce una progresión de la infección por el VIH, definida por la aparición de enfermedades oportunistas (8). Los factores que permiten explicar la existencia de este fracaso son múltiples (9): una adherencia insuficiente al tratamiento (principal factor de fracaso terapéutico); baja absorción de alguna de las drogas; inadecuada potencia y estructura de los medicamentos pertenecientes al régimen seleccionado; farmacocinética variable (forma en que el medicamento se absorbe, se distribuye, se descompone y se elimina del cuerpo) y finalmente, la resistencia a antirretrovirales continúa siendo uno de los factores de fracaso terapéutico de importancia fundamental en el manejo clínico del paciente infectado por VIH (10).

En general, la evolución viral tiende a seleccionar virus que tienen una ventaja en su replicación en un medio ambiente determinado. En un individuo recientemente infectado, sin tratamiento, serán seleccionadas aquellas cepas que replican con mayor eficiencia a nivel celular, o bien aquellas cepas virales capaces de evadir la respuesta inmunitaria del organismo (6). Cuando los fármacos antirretrovirales son administrados en dosis subóptimas emergen cepas resistentes a drogas bajo presión selectiva de la terapia antirretroviral, particularmente cuando la supresión viral es incompleta (ver Figura 1). Existen diversas causas que permiten explicar una supresión viral incompleta: potencia insuficiente, niveles de drogas inadecuados, adherencia inadecuada y resistencia pre-existente. Cada droga parece seleccionar mutaciones específicas de resistencia, lo cual resulta en una disminución en la sensibilidad a la droga. Sin embargo, se ha descrito una intensa reacción cruzada entre drogas de una misma clase, de manera que una mutación determinada puede asociarse a resistencia a uno o más fármacos pertenecientes a inhibidores de proteasa (IP), por ejemplo, o bien a inhibidores nucleosídicos/nucleotídicos de la transcriptasa reversa (INTR), o a inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa reversa (INNTR) (11). Las mutaciones genómicas del VIH asociadas a antirretrovirales frecuentemente descritas se resumen en la Figura 3.

Dado que alguna de las mutaciones en el genoma del VIH puede surgir bajo la presión selectiva de los fármacos, actualmente este agente viral posee la capacidad de desarrollar resistencia frente a los antirretrovirales disponibles en presencia del tratamiento (7). Esto es lo que se conoce como resistencia secundaria. En contraste, la resistencia primaria se refiere a la pérdida de susceptibilidad a los antirretrovirales ocasionada por la transmisión de virus resistentes en la infección aguda, ocurrida en pacientes que nunca han sido sometidos a tratamiento (pacientes “naive”) (10, 11).

El uso extendido de fármacos antirretrovirales ha traído como consecuencia la selección de cepas virales resistentes en una proporción significativa de individuos bajo tratamiento, lo cual representa un serio problema para su manejo clínico y permite la transmisión de estas variantes a otras personas. Esto representa un importante problema de salud pública en regiones donde las drogas antirretrovirales han sido ampliamente usadas por varios años (7). En Estados Unidos se han reportado cepas VIH-1 resistentes a drogas en infección aguda alrededor de un siete por ciento frente a los inhibidores no nucleosídicos y diez por ciento frente a los inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa reversa (12).

MUTACIONES ASOCIADAS A RESISTENCIA EN PACIENTES CON VIH

Se han descrito dos tipos de mutaciones: primarias y secundarias. Las mutaciones primarias constituyen cambios en el genoma que dan lugar a alteraciones en el sitio activo de la enzima, afectando la afinidad de ésta por su sustrato. Por lo general, este tipo de mutaciones se selecciona en la etapa temprana del tratamiento antirretroviral y surgen en virtud de la presión selectiva ejercida por el fármaco, como mecanismo de evasión frente a la actividad inhibitoria de la droga. En contraste, las mutaciones secundarias surgen posteriormente a la aparición de las mutaciones primarias, con la finalidad de restaurar la alteración en la actividad cinética que la enzima había sufrido por la mutación primaria. De esta manera, las mutaciones secundarias por sí mismas presentan un efecto reducido o nulo frente a la magnitud de la resistencia a la terapia antirretroviral. Así mismo, pueden incrementar la replicación viral, incrementando la adaptación o fitness (13).

La barrera genética se define como el número de mutaciones requeridas para reducir la actividad de la droga antiviral y puede clasificarse en (13):

• Baja: caracterizada por la pérdida de actividad antiviral debido a la aparición o selección de una mutación simple. Es relativamente fácil pasarla para que el virus se sobreponga.

• Alta: se refiere a la pérdida de actividad antiviral después de la aparición o selección de múltiples mutaciones. La trascendencia a nivel clínico del fenómeno de resistencia a los fármacos antirretrovirales es importante ya que cada fracaso terapeútico por esta causa, limita las opciones posteriores de tratamiento, tanto en el número de antirretrovirales que podemos usar como en la calidad de respuesta obtenida a la terapia (14).

MÉTODOS DE LABORATORIO PARA DETERMINACIÓN DE RESISTENCIA A DROGAS ANTIRRETROVIRALES

En general, se debe sospechar la presencia de resistencia farmacológica cuando los niveles de carga viral empiezan a aumentar (0,5 log), o si se hacen detectables en mediciones repetidas cuando previamente eran indetectables (13). Actualmente, las pruebas de resistencia han alcanzado un desarrollo tecnológico suficiente como para ser introducidas en la práctica clínica. Se han descrito dos tipos de pruebas de laboratorio que permiten determinar si una persona con antecedentes de uso de antirretrovirales ha desarrollado cepas virales farmacológicamente resistentes: las pruebas fenotípicas y las pruebas genotípicas (3, 13).

Es importante destacar que antes de tomar la muestra para una prueba de detección de resistencia se requiere estar seguro de que el paciente continúa bajo el tratamiento que supuestamente ha fracasado. Algunos autores recomiendan que el plazo máximo transcurrido entre el cese del tratamiento y la detección de resistencias no supere los quince días, pues el rápido recambio de la población viral conduciría a un predominio de cepas virales salvajes que daría lugar a falsos negativos en la determinación de resistencias. Además, se requiere de un umbral de carga viral mínimo para garantizar la obtención de resultados fiables, establecido generalmente en mil copias de ARNviral por mililitro (14). La Sociedad Internacional de SIDA de Estados Unidos (IAS/USA) recomienda el uso del genotipado en pacientes seropositivos para el VIH con fracaso del primer tratamiento o de varios tratamientos, y para mujeres embarazadas seropositivas (7, 14).

PRUEBAS FENOTÍPICAS

Las pruebas fenotípicas de resistencia a antirretrovirales se fundamentan en la capacidad que tienen aislados ciertos virales provenientes de pacientes con VIH de replicarse en cultivo frente a determinadas concentraciones de fármacos antirretrovirales, permitiendo el análisis cuantitativo de la concentración de droga necesaria para la inhibición de la replicación del VIH (3, 13).

Los primeros ensayos fenotípicos se realizaron en cultivos de células mononucleares de sangre periférica, blanco celular principal de la infección por el VIH, obtenidas de donantes negativos para la presencia del virus. A pesar de obtenerse resultados cuantitativos, no había mucha reproductibilidad entre los mismos. En este caso, la variabilidad es causada por diferencias genéticas entre las células de los diversos donantes y los distintos niveles de activación celular, los cuales tienen un dramático efecto sobre la susceptibilidad de la infección viral y más aún sobre los niveles de producción de virus en la célula infectada (15).

Los ensayos fenotípicos comerciales (Antivirogram^TM, PhenoSense^TMHIV y PhenoScript^TM) comúnmente usan la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar la región pol del paciente VIH-1 (3). Esta región codifica la transcriptasa reversa y la proteasa virales, blancos de la mayoría de los fármacos antirretrovirales comúnmente utilizados. La región pol del VIH-1 es incorporada en un virus manipulado a nivel genómico en el laboratorio que carece de esta región genética, y el virus recombinante resultante se cultiva en presencia de concentraciones crecientes de la droga para determinar la concentración requerida para inhibir el 50% (IC₅₀) o el 90% (IC₉₀) de su replicación (ver Figura 2)(15). Al comparar los cambios en la concentración necesaria para alcanzar el IC₅₀ o IC₉₀ en el aislado viral del paciente respecto a una cepa de referencia (virus salvaje), es posible no sólo determinar la disminución de sensibilidad de la droga sino también cuantificar el grado de resistencia. Las condiciones requeridas para el aislamiento in vitro del VIH son rigurosas y sujetas a una gran variabilidad.

Las cepas mutantes del VIH resistentes a drogas no se replican tan bien como una cepa salvaje y esta disminución en la capacidad de adaptación o fitness viral se ha asociado a una virulencia disminuida. Las cepas VIH resistentes a drogas antirretrovirales generalmente tienen una baja capacidad de replicación, entre 11 por ciento a 46 por ciento, con una media de 28 por ciento. Aunque estos análisis pueden ser accesibles, en el presente la relación entre la capacidad de adaptación o fitness viral y la respuesta clínica no ha sido suficientemente establecida para garantizar el uso de los análisis fenotípicos a nivel clínico (13).

La interpretación de los análisis fenotípicos es limitada debido a la escasa información sobre la correlación entre el grado de resistencia in vitro y la actividad de ciertas drogas in vivo (3,15).

Un fenotipo virtual es un perfil de susceptibilidad a drogas generado por computadora, el cual se produce por comparación del genotipo del paciente con una amplia base de datos de alrededor de cien mil genotipos y fenotipos, generado de aislados de muestras clínicas sometidas a ambos ensayos. Cuando se genera el genotipo de un paciente, la secuencia nucleotídica correspondiente a las regiones de la transcriptasa reversa y la proteasa del VIH son insertadas en el sistema del software, el cual es capaz de identificar todas las mutaciones que pueden afectar la resistencia a cada droga, y luego investiga la base de datos de genotipos de muestras previas que comparten los mismos patrones de mutaciones. Aunque un fenotipo virtual es menos costoso que un análisis fenotípico convencional, su utilidad desde el punto de vista clínico no se ha dilucidado completamente (13, 15).

PRUEBAS GENOTÍPICAS

Las pruebas genotípicas se basan en el análisis de la estructura genética viral, obtenida de aislados del VIH de muestras de plasma y por tanto detectan la presencia de mutaciones en el genoma asociadas a resistencia a drogas antirretrovirales (16). Existen tres pruebas genotípicas comerciales: la secuenciación y dos técnicas basadas en la hibridación: LIPA y GeneChip (15,16). En las técnicas de hibridación sólo se detecta determinado número de mutaciones de significación conocida. En el caso de LIPA, se trata de una técnica de hibridización en fase reversa post-PCR que utiliza como soporte tiras de nitrocelulosa con sondas de oligonucleótidos específicos inmovilizadas en líneas paralelas. Estas sondas son complementarias a la secuencia genómica con cambios o mutaciones conocidas que confieren resistencia a los fármacos antirretrovirales. La amplificación de la muestra se realiza con cebadores biotinilados que luego de la hibridación permitirán que el amplicón-híbrido reaccione con un conjugado compuesto por estreptavidina-fosfatasa alcalina. Luego de añadir el sustrato de la enzima se producirá un precipitado marrón-púrpura en las posiciones correspondientes a las líneas paralelas de las sondas inmovilizadas. En cuanto a la hibridación en microarrays o GenChip, ésta utiliza como soporte “chips” de sílice que contienen una biblioteca de sondas con múltiple capacidad de combinaciones posibles ya que se solapan entre sí. Esta técnica permite identificar el nucleótido presente en cada posición de la secuencia a analizar.

La secuenciación se considera el método de referencia de las pruebas de genotipificación (17). Las modernas técnicas de secuenciación derivan del método de Sanger, según el cual se procede a la síntesis de pequeños fragmentos genómicos a partir de la hebra de ADN molde con la incorporación de nucleótidos hasta que de forma aleatoria se incorpora un nucleótido terminador y cesa la síntesis, de manera que se sintetizan hebras de ADN de longitud variable. Esta metodología detecta todas las mutaciones presentes en las regiones del genoma del VIH que codifican para la transcriptasa reversa y la proteasa viral, indispensables para la replicación y supervivencia del virus en el individuo infectado. Estas dos regiones genéticas codifican las proteínas enzimáticas que constituyen los principales blancos del tratamiento antirretroviral. El desarrollo de resistencia a estos fármacos se asocia a mutaciones en estas regiones de codificación (15). El ensayo de genotipado Trugene HIV-1 de la Bayer HealthCare permite la determinación de mutaciones de resistencia a antirretrovirales a través de la secuenciación de aislados genómicos provenientes de viriones plasmáticos (16, 17). De acuerdo con el fundamento del ensayo, las mutaciones que confieren resistencia a los antirretrovirales se detectan, secuenciando mediante la reacción de clip o reacción de secuenciación, un producto amplificado de TR-PCR (transcripción reversareacción en cadena de la polimerasa), utilizando cebadores específicos del VIH-1 marcados con fluorocromos diferentes. Luego, las reacciones de secuenciación Clip son separadas mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida y se detecta la cantidad de luz y la longitud de onda cuando un haz láser excita el colorante fluorescente unido a cada fragmento de ADN. Una vez obtenida la secuencia génica del VIH a partir de la muestra sanguínea del paciente, ésta se compara con la secuencia de referencia del virus natural o salvaje mediante un programa informático acoplado al secuenciador. Para la realización de este análisis de alta complejidad se requiere de un personal científico experto en biología molecular debidamente certificado para la realización de la prueba.

Una evaluación genotípica de resistencia puede llevarse a término en 1-2 semanas. Los resultados se reportan como una lista de las mutaciones detectadas para los inhibidores nucleosídicos y nucleotídicos de la transcriptasa reversa, los inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa reversa y los inhibidores de proteasa. La mayoría de los reportes incluye una interpretación de posible resistencia o resistencia a drogas conferidas por estas mutaciones.

La tipificación de ácidos nucleicos a través de pruebas de genotipificación, tiene un enorme potencial para proveer información sobre la progresión de la enfermedad en el individuo y orientar a los médicos en la selección de la terapia antiviral adecuada para cada paciente, que reduzca el riesgo de mutación del virus y su consecuente resistencia viral.

La incorporación selectiva de las técnicas genotípicas a la práctica asistencial tiene interés al orientarse a optimizar e individualizar el tratamiento en cada paciente, permitiendo además conocer la epidemiología molecular de las cepas de VIH resistentes y el mejor uso del arsenal terapéutico disponible, e intentar disminuir el riesgo de aparición de resistencias potencialmente transmisibles.

Uno de los aspectos importantes a destacar respecto a la determinación de resistencias, es la interpretación de los resultados obtenidos de estas pruebas (18). No existe una pauta acerca de cuál sea la mejor interpretación de las pruebas. Entre las posibilidades disponibles se encuentra la interdisciplinaria, que implica la participación de microbiólogos, médicos infectólogos e inmunólogos y los sistemas basados en reglas generadas por la evidencia científica y la realización del denominado “fenotipo virtual” (Virco™), que es una algoritmo de búsqueda por confrontación de las mutaciones generadas por un tratamiento en una gran base de datos que correlaciona una determinada mutación con un fenotipo resistente específico. En la práctica se usan estos tres tipos de interpretaciones, que probablemente aportan sus beneficios, pero se necesitan estudios que las comparen con el fin de encontrar el mejor método (15).

La realización de este análisis de avanzada biotecnológica aunado a la determinación de la carga viral y el inmunofenotipaje (contaje de linfocitos T CD4+/linfocitos T CD8+) constituye un aporte de gran importancia en el manejo y control del paciente infectado con VIH, contribuyendo además con nuevos hallazgos en la investigación sobre la epidemiología molecular del VIH en nuestros países de América Latina.

REFERENCIAS

1. Wainberg M., Friedland G. Public health implications of antiretroviral therapy and HIV drug resistance. JAMA, 1998; 279 (24): 1977-1983.        [ Links ]

2. Mendoza C, Gallego O, Soriano V. Resistencias a los antirretrovirales. En: Soriano V, González J. Manual del SIDA. 5ª ed. Barcelona, España: Publicaciones Permanyer; 2003, pp. 599-627.        [ Links ]

3. Ruiz L, Fuster D, Martínez J, Paredes R, Cahn P, Clotet B. Drug Resistance: Definitions and concepts. En: Clotet B, Menéndez L, Schapiro J, Ruiz L, Kuritkes D, Burger D, “et al”. Guide to management of HIV drug resistance, antiretrovirals pharmacokinetics and viral hepatitis in HIV infected subjects. 5ª ed. Barcelona, España; 2005, pp. 1-19.        [ Links ]

4. Perelson A, Neumann A, Markowitz M, Leonard J, Ho D.D. HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time. Science 1996; 271: 1582-1586.        [ Links ]

5. Balzarini J, Pelemans H, De Clerq E, Karlsson A, Kleim J. Reverse transcriptase fidelity and HIV-1 variation. Science 1997; 275: 229-230.        [ Links ]

6. Phair J. Clinical Strategies for Treatment-Experienced Patients. Clinical Care Options, LLC. Copyright 2005. Disponible en: http://www.clinicaloptions.com.        [ Links ]

7. Thomson M, Pérez L, Najera R. Molecular epidemiology of HIV-1 genetic forms and its significance for vaccine development and therapy. The Lancet Dis Infect. 2002, 2: 461-71.        [ Links ]

8. Clavel F, Race E, Mammano F. HIV drug resistance and viral fitness. Advances in Pharmacology, 2000; 49: 41-63.        [ Links ]

9. Turner B, Summers M. Structural biology of HIV. J Mol Biol 1999; 285: 1-32.        [ Links ]

10. Pomerantz R. Primary HIV-1 resistance. A new phase in the epidemic?. JAMA, 1999; 282: 1177-1179.        [ Links ]

11. Soriano V, Domingo E. Importancia clínica de la variedad genética del VIH. Med. Clín (Barc) 1996; 107: 460-463.        [ Links ]

12. AIDS Info. Fracaso del régimen terapéutico para el VIH. El VIH y su tratamiento. Servicio del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos. 2005. Disponible en: http//:aidsinfo.nih.gov.        [ Links ]

13. Frenkel, L, Tobin N. Understanding HIV-1 drug resistance. Ther Drug Monit. 2004; 6(2): 116-121.        [ Links ]

14. Guerrero J. Resistencia del VIH a los fármacos antirretrovirales: evolución y perspectivas de futuro. Enf Emerg. 2002; 4(2): 57-58.        [ Links ]

15. García F, Domínguez M. La genotipificación y fenotipificación de la resistencia del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) a los fármacos antirretrovirales. Colombia Med. 2003; 34 (3): 143-154.        [ Links ]

16. O´Brian W. Resistance Testing in HIV: An in depth series. Genotyping vs Phenotyping: Which test when? iMedOptions, LLC copyright 2004. Disponible en: http://www.clinicaloptions.com        [ Links ]

17. Clotet B, Menéndez L. Guide to management of HIV drug resistance, antiretrovirals pharmacokinetics and viral hepatitis in HIV infected subjects. 6ª ed. Barcelona, España: Ediciones Gráficas Rey, S.L; 2006. pp. 4-5.        [ Links ]

18. Shafer R, Hertogs K, Zolopa A, “et al”. High degree of interlaboratory reproducibility of human immunodeficiency type 1 protease and reverse transcriptase sequencing of plasma samples from heavily treated patients. J Clin Microbiol. 2001; 39: 1522-1529.        [ Links ]