Trypanosoma vivax: Bometría y eritrometría en infecciones experimentales.

Edwin O Chávez A^{1, 2}, Roschman A González L^{2, 3}, Trina M Perrone C⁴, Félix A Tejero M⁵

¹ Cátedra de Fisiología. Escuela de Medicina José María Vargas, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela (UCV), Caracas.

² Postgrado en Zoología. Instituto de Zoología Tropical, Facultad de Ciencias, UCV. Caracas.

³ Centro de Microscopía Electrónica. Escuela de Biología, Facultad de Ciencias, UCV. Caracas.

⁴ Laboratorio de Fisiología de Parásitos. Centro de Biofísica y Bioquímica, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC). Caracas.

⁵ Laboratorio de Biología Funcional de los Kinetoplastida. Sección de Parasitología, Instituto de Zoología Tropical, Facultad de Ciencias, UCV. Caracas.

Correspondencia: Dr. Félix Tejero. Laboratorio de Biología Funcional de los Kinetoplastida. Sección de Parasitología, Instituto de Zoología Tropical, Facultad de Ciencias, UCV, Caracas. E-mail: felixtejero@cantv.net.

RESUMEN

La anemia y la poiquilocitosis son manifestaciones clínicas características de la tripanosomosis por Trypanosoma vivax. No obstante, poco se sabe acerca de la multicausalidad de las alteraciones de forma y tamaño que experimentan los eritrocitos durante la infección. La  parasitemia, las dimensiones tripomastigóticas y el área eritrocítica fueron registradas a lo largo de las infecciones. El análisis estadístico reveló cambios significativos en las variables consideradas. El estudio demostró relación entre las dimensiones tripomastigóticas y el área eritrocítica. Además, probó que el patrón de cambio morfométrico experimentado por tripomastigotes de aislados diferentes en distintos hospedadores, pudiera ser un evento hospedador-dependiente.

Palabras clave: Trypanosoma vivax, morfometría, eritrocito.

ABSTRACT

Anemia and poikilocytosis are clinical manifestations characteristic to tripanosomosis by Trypanosoma vivax.  Nevertheless, little is known about the multicausality of the form and size alterations that experience the erythrocytes during the infection. The parasitemia, the trypomastigotic dimensions and the erythrocytic area were registered throughout the infections. The statistical analysis reveals significant changes in the considered variables. The study demonstrated relationship between the trypomastigotic dimensions and the erythrocytic area. In addition, it proved that the pattern of trypomastigote morphometric change of different isolates experienced in different hosts could be a host-dependent event.

Key words: Trypanosoma vivax, morfometrics, erytrocyte.

INTRODUCCIÓN

La tripanosomosis bovina por Trypanosoma vivax, es una enfermedad conocida en Venezuela como “cacho hueco” o “huequera” que está ampliamente distribuida en nuestras zonas ganaderas. El deterioro general de los animales infectados se caracteriza por pérdida de peso, decaimiento, mucosas pálidas, deterioro de la condición corporal y muerte eventual, lo que supone incrementos considerables en los costos de producción derivados de la utilización de medicamentos y asistencia veterinaria (1). En este contexto, la anemia es la expresión patológica por excelencia, entidad patológica que, por lo general, está asociada a cambios eritropoyéticos (2, 3, 4).

Comprender aspectos básicos de la biología de este microeucariota resulta embarazoso, por cuanto T. vivax no infecta roedores y el manejo de animales de talla media y/o grande en el laboratorio es problemático por razones logísticas. El inconveniente se ha solucionado simuladamente, ya que el desarrollo parasitológico de algunos aislados del hemoflagelado ha sido adaptando a roedores de laboratorio (5,6). Sin embargo, por ello es pertinente estudiar el comportamiento de diferentes aislados de T. vivax en modelos experimentales disímiles, con la finalidad de conocer las semejanzas o diferencias que permitan esclarecer aspectos básicos de su biología.

Si bien el estudio de la morfometría de aislados neotropicales de T. vivax (7) y las variaciones eritropoyéticas del hospedador (2, 3, 4) son aspectos que han sido abordados, los cambios de forma y dimensionalidad eritrocitarias no han sido explorados y, menos aun, su relación cuantitativa con las variaciones morfométricas del parásito. En este trabajo comparamos la relación cuantitativa que se establece entre cambios en la morfometría tripomastigótica y la dimensionalidad eritrocítica en dos modelos experimentales (ovejas mestizas y ratas albinas) inoculados con dos asilados de T. vivax.

MATERIALES Y MÉTODOS

Trypanosoma vivax.

Aislado TVGF12, procedente de la Guyana Francesa y previamente adaptado a roedores de laboratorio. Aislado TVSBZ, obtenido de un cebú mestizo en el municipio Colón, Estado Zulia, Venezuela.

Animales experimentales e inóculo.

Ocho Ovis aries mestizas (“West African”; 2 años de edad; 25,8 ± 2 kg) fueron inoculadas por vía intravenosa con 2,6 x10⁶ tripomastigotes del aislado venezolano (TVSBZ). Ocho Rattus norvegicus (“Sprague-Dawley”; 2 semanas de edad; 199,6 ± 8 g)  fueron inoculadas intradérmicamente con 102 tripomastigotes del aislado de la Guayana Francesa (TVGF12).

Diseño experimental.

Durante un mes y medio, cada cinco días se cuantificó la parasitemia, expresada en 106 tripomastigotes/ml (8), y se hicieron extendidos de sangre que se fijaron con metanol y colorearon con solución de Giemsa (10%).

El registro morfométrico de las variables homólogas sobre los tripomastigotes (todas referidas en μm) se realizó a partir de extendidos de sangre. Los frotis fueron muestreados sistemáticamente (9,10) y las imágenes de los tripomastigotes fueron delineadas con cámara clara acoplada a un microscopio fotónico. Los dibujos obtenidos se digitalizaron y las magnitudes numéricas de PC (distancia extremo posterior-cinetoplasto), CN (distancia cinetoplasto-centro del núcleo), PN (distancia extremo posterior-centro del núcleo), AN (distancia centro del núcleo-extremo anterior), F (longitud del flagelo libre), A (ancho máximo a nivel del núcleo), L (longitud total), LC (distancia extremo anterior-extremo posterior), fueron establecidas y expresadas en micrómetros (μm). Además, se determinó el área de los eritrocitos (Ae), expresada en μm².

El manejo numérico de los datos incluyó pruebas de normalidad, homogeneidad de la varianza, análisis de la varianza (ANOVA) y regresión lineal simple (RLS) (11, 12). Los experimentos se repitieron tres veces y cumplieron con las normas establecidas en la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (13).

RESULTADOS

Las pruebas de normalidad de los datos indican que los conjuntos de variables (parasitológicas, y morfométricas) presentan distribuciones normales. Por su parte, la prueba de homogeneidad de la varianza corrobora el supuesto de igualdad de las varianzas. Los resultados de ambas premisas permiten el uso del ANOVA como prueba de análisis de medias.

Modelo ovino: Infección experimental de O. aries con T. vivax TVSBZ.

El ANOVA aplicado a nueve variables  morfométricas, ocho en tripomastigotes y una en eritrocitos, así como a una variable parasitológica (parasitemia) establece que, para a £ 0,05, las medias de las diez variables en cuestión, difieren significativamente. La Tabla 1, resume la información suministrada, así como otros parámetros estadísticos.

Tabla 1. Parámetros estadísticos de las variables registradas en el modelo ovino. Los resultados del ANOVA se compendian en las columnas F y p. Diferencias significativas con p < 0,05. Las unidades de cada variable están referidas en la metodología.

El análisis de RLS examinó todas las variables morfométricas de los tripomastigotes. En todos los casos, el área eritrocítica se consideró la variable dependiente, debido a su incremento concomitante con el transurso de la infección, sobrepasando el valor normal de 14 μm² reportado para esta especie (14, 15). Por razones obvias, sólo incluimos resultados de análisis con mayor coeficiente de determinación (R²).

La ecuación Ae = -20,60 + 5,94CN, representa el cambio en términos matemáticos. R² = 0,7153, define la proporción de la variabilidad de Ae, que es explicada conociendo un valor de la variable independiente (CN). Indica, en consecuencia, que la certidumbre del evento descrito por la ecuación es 71,53% para un intervalo de confianza del 95%. La representación cartesiana de los puntos de registro, Ae = -20,60 + 5,94CN y su intervalo de confianza se muestra en la Figura 1.

Figura 1. Regresión lineal simple en el modelo ovino. Muestra la relación entre  la dimensionalidad eritrocítica y la distancia que separa al cinetoplasto del núcleo de los tripomastigotes de Trypanosoma vivax.

Modelo murino: Infección experimental en R. novergicus con T. vivax TVGF12.

El ANOVA aplicado a nueve variables  morfométricas, ocho en tripomastigotes y una en eritrocitos, así como a una variable parasitológica (parasitemia) establece que, para a £ 0,05, las medias de las diez variables en cuestión, difieren significativamente. La Tabla 2, resume la información suministrada, así como otros parámetros estadísticos.

Tabla 2. Parámetros estadísticos de las variables registradas en el modelo murino. Los resultados del ANOVA se compendian en las columnas F y p. Diferencias significativas con p < 0,05. Las unidades de cada variable están referidas en la metodología.

El análisis de RLS incluyó regresiones de todas las variables morfométricas de los tripomastigotes. En todos los casos, Ae se consideró la variable dependiente, debido al incremento concomitante con el transurso de la infección, sobrepasando el valor de 20 μm² reportado para esta especie (14, 15). Por razones evidentes, sólo incluimos resultados del análisis con mayor R².

La ecuación Ae = -64,87 + 6,66L, representa el cambio en términos matemáticos. R² = 0,7104, define la proporción de la variabilidad de la variable dependiente (Ae) que es explicada conociendo un valor de la variable independiente (L). Indica, por lo tanto, que la certidumbre del evento descrito por la ecuación es 71,04% con un intervalo de confianza del 95%. La Figura 2 presenta gráficamente lo expresado.

Figura 2. Regresión lineal simple en el modelo murino. Muestra la relación existente entre la dimensionalidad eritrocítica (en micrómetros cuadrados) y la longitud total de los tripomastigotes de Trypanosoma vivax (en micrómetros).

DISCUSIÓN

Las manifestaciones mórbidas características de la tripanosomosis por T. vivax comprenden macrocitosis y poiquilocitosis (2). Si bien, diversos autores han abordado la temática (3,4), las relaciones cuantitativas que se establecen entre el área de los eritrocitos y la dimensionalidad de los tripomastigotes, no han sido investigadas. El ANOVA establece que las medias de las 10 variables sondeadas, independientemente del modelo investigado, son diferentes, hecho que corrobora lo indicado al respecto de la plasticidad fenotípica de los eucariotas, tripanosomatídeos incluidos (16).

El análisis de RLS demuestra que el 72 % del cambio dimensional observado en los eritrocitos ovinos es inducido por modificaciones morfométricas de los tripomastigotes (TVSBZ). En tal sentido, investigaciones previas indican que el desplazamiento del cinetoplasto de los tripomastigotes de algunos tripanosomas africanos está relacionado con la activación y/o la represión adaptativa de la mitocondria (17, 18, 19, 20). En consecuencia, no sería descabellado conjeturar que los cambios en el estado metabólico de la mitocondria del T. vivax influirían en la química sanguínea del hospedador y, por lo tanto, en el área de sus eritrocitos.

Más aun, los resultados de la RLS demuestran que las variaciones de área en los eritrocitos de los ovinos infectados experimentalmente con el aislado TVSBZ, dependen de las modificaciones de la distancia cinetoplasto-núcleo de los tripomastigotes circulates. Asimismo, establecen que las variaciones de área en los eritrocitos de ratas infectadas experimentalmente con el aislado de la Guayana Francesa (TVGF12), dependen de las modificaciones de la longitud total de los tripomastigotes.

El análisis revela relaciones disímiles entre las variables. Los cambios del tamaño promedio de los eritrocitos, están vinculados parcialmente a la permanencia en circulación de tripomastigotes “estilizados”: los cambios eritrocitarios observados parecieran estar asociados a la presencia de ciertos tipos pleomórficos del T.vivax. En tal sentido, se ha sugerido que la transición  tripomastigote largo-delgado  a corto-rechoncho está asociada al control de la densidad poblacional de los parásitos (21). Si bien, T. vivax es una especia considerada monomórfica, previamente hemos demostrado que la parasitemia experimental en ovinos se caracteriza por el aumento de la longitud corporal y el decremento de la distancia cinetoplasto-núcleo (22). Por consiguiente, no sería de extrañar que ciertos cambios en la proporción y forma de los tripomastigotes, estuvieran asociados a mecanismos densodependientes que determinarían la presencia de los morfotipos pleomórficos mejor adaptados.

En conclusión, el análisis numérico de los resultados también evidencia diferencias significativas en diferentes hospedadores, tanto en la pauta morfométrica de los tripomastigotes, como en sus implicaciones sobre las dimensiones de los eritrocitos ovinos y murinos. Este hecho sugiere un comportamiento hospedador-dependiente en infecciones experimentales por T. vivax, lo cual debe ser considerado a la hora de utilizar diferentes modelos animales para estudiar la biología del flagelado.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos al Dr. Marc Desquenes (CIRDES, Burkina Faso) por facilitarnos el aislado TVFG12 de Trypanosoma vivax. Asimismo, apreciamos el apoyo económico del BID-FONACIT (Proyecto 2004-000400).

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