Evaluation of the antimicrobial activity of Azadirachta indica ethanolic extracts.

María J Gualtieri A¹, María C González², Keylla P Contreras B², María C Noguera C², Erika E Uzcátegui M², Sheila Villasmil¹, Carolina Villalta R¹

¹ Laboratorio de Investigación de Medicamentos Orgánicos. Departamento de Farmacognosia y Medicamentos Orgánicos. Facultad de Farmacia y Bioanálisis. Universidad de Los Andes. Mérida 5101-A. Venezuela. gualtier@ula.ve.

²  UE Colegio La Presentación. Mérida. mcgualtieri@hotmail.com.

RESUMEN

La presencia del acné juvenil, es una enfermedad que repercute directamente en la autoestima del adolescente, provocando en ocasiones inseguridad para establecer comu nicación y relaciones con otras personas, debido a su falta de confianza y respeto a su imagen. Debido a los altos costo del tratamiento para esta patología, el siguiente trabajo tuvo como objetivo determinar la actividad antimicrobiana de la Azadirachta indica y preparar una fórmula magistral (crema) antiacné. Los resultados obtenidos de la actividad antibacteriana de los extractos etanólicos de las hojas de Azadirachta indica A. Juss, mostraron que el Staphylococcus aureus presentó la mayor sensibilidad con una zona de inhibición de 15 mm. a una dilución 1/10; E. faecalis, con una sensibilidad de 7 mm, tanto en las diluciones 1/10 y 1/100; K. pneumoniae, con una zona de inhibición de 8 mm. y E. coli; mostró ser resistente a todas las diluciones ensayadas. Esta búsqueda sugiere que los principios activos extraídos con etanol de las hojas, pueden jugar un rol significativo en la acción inhibitoria contra el Staphylococcus aureus responsable del acné juvenil.

Palabras clave: Staphylococos aureus, acné, actividad antimicrobiana, extractos de plantas, Azadirachta indica.

The presence of the youthful acne, is a disease that directly repels in the self-esteem of the adolescent, causing sometimes insecurity to contact and relations with other people, due to its lack of confidence and respect to its image. Due to high the cost of the treatment for this pathology, the following work had as objective to determine the antimicrobial activity of the Azadirachta it indicates and to prepare a skillful formula (Cream) antiacne. The obtained results of the antibacterial activity of the etanólicos extracts of the leaves of Azadirachta indica A. Juss, showed that the Staphylococcus aureus presented/displayed greater sensitivity with a zone of inhibition of 15 mm to a dilution 1/10; E. faecalis, with a sensitivity of 7 mm, as much in dilutions 1/10 and 1/100; K. pneumoniae with a zone of inhibition of 8 mm and E. coli, showed to be resistant all the tried dilutions. This search suggests them extracted active principles with ethanol of the leaves, can play a significant roll in the inhibiting action against the Staphylococcus aureus responsible for the youthful acne.

Key words: Staphylococos aureus, Acné, Antimicrobial activity, Plant extracts, Azadirachta indica.

Recibido: 06 de Junio de 2007 / Aceptado: 15 de noviembre de 2007

La piel provee una gran variedad de condiciones físicas y químicas para la aparición de diversas patologías, entre ellas encontramos el acné, afección inflamatoria de las glándulas sebáceas, principalmente tratada con medicamentos locales tópicos, pero debido a los inconvenientes que pueden presentarse (como efectos secundarios) se ha incrementado el uso de productos naturales en las diversas formulaciones disponibles pa ra tratar esta patología. Las formas farmacéuticas más usadas en el tratamiento del acné son geles o lociones y cremas.

Los extractos de Azadirachta indica (Neem) son empleados en tratamientos médicos que datan de hace aproximadamente 4.500 años. Las propiedades terapéuticas terapéuticas de esta planta son numerosas y se conocen desde épocas remotas. Mucho antes de que la civilización occidental descubriera las cualidades analgésicas del árbol del sauce, del que proviene la aspirina, los fitoterapeutas de la India antigua ya habían documentado, en las escrituras sánscritas más tempranas, las aplicaciones del Neem.

Durante siglos, y basado en conocimientos empíricos, el hombre ha utilizado las plantas como fuente para la elaboración de medicamentos, ya sea en preparaciones tradicionales o en fármacos (1). En las ultimas décadas se han realizado innumerables estudios sobre la actividad antibacteriana de principios activos de plantas superiores, con la finalidad de combatir la prevalencia de ciertas enfermedades infecciosas, aunado a esto, la desventaja que presentan los principales antibióticos sintéticos, en relación al espectro de acción antibacteriana y/o los efectos colaterales que pueden originar (2,3). Con mayor interés se ha intensificado el esfuerzo por descubrir sustancias quimioantibióticas de origen vegetal y clínicamente útiles, debido al problema que surge ante la emergencia continua de cepas resistentes a los antibióticos (4,5).

La presencia del acné juvenil, enfermedad que repercute directamente en la autoestima del adolescente, provoca en ocasiones inseguridad para establecer comunicación y relaciones con otras personas, debido a su falta de confianza y respeto a su imagen. Debido a la gran problemática que se presenta por los altos costos del tratamiento para esta patología, en los últimos años se han tratado de buscar nuevas alternativas terapéuticas a base de productos naturales, que demuestren alta efectividad equivales a los patentados comerciales. A pesar de los numerosos reportes existentes acerca de las propiedades antisépticas que exhibe la Azadirachta indica, el propósito del presente trabajo es extraer los principios activos de las hojas, evaluar la actividad antibacteriana de los extractos y elaborar una formulación magistral (crema) con los extractos obtenidos, que permita combatir el acné juvenil.

Algunos estudios han demostrando el efecto inhibitorio de una fracción del aceite de Neem (NIM-76) en el crecimiento de ciertos patógenos tales con E. coli y K. pneumoniae y Cándida albicans. Además, presentó actividad espermaticida (6).

El extracto hexanoico de las semillas de Neem puede ser utilizado para la contracepción y su mecanismo de acción parece que puede activar a las células linfocitos T del sub-tipo CD8+ mediante reacciones inmunes (7).

El acné es una de las enfermedades de la piel más comunes, observada principalmente en adolescentes. Generalmente los dermatólogos recomiendan cremas, geles o lociones, todos con principios activos sintéticos, pero estos productos pueden provocar algunos efectos secundarios, además de que en algunos casos resultan poco accesibles para la población. De tal manera que se propone la elaboración de una crema con los extractos etanólicos de Azadirachta indica, que sea estable y segura, para el tratamiento de esta patología.

Material vegetal: La especie vegetal fue recolectada en Carora, estado Lara, Venezuela. Este material fue identificado botánicamente en el Herbario MERF de la Facultad de Farmacia, Universidad de Los Andes, depositado bajo el N° 005. Las partes aéreas de la especie Azadirachta indica A. Juss, fueron secadas en una estufa a 45 ºC y molidas con un tamaño de partícula de £ 2 mm. 100 g en peso seco del material vegetal fueron sometidos a una extracción con etanol de 98% en aparato de Soxhlet a 65 °C durante 6 horas y se obtuvo un extracto verde oscuro, el cual fue filtrado y rotaevaporado a 50 °C al vacío hasta sequedad, con un rendimiento de 5,79%. Para la preparación de los distintas diluciones se procedió a preparar un patrón en una concentración 1:1, y a partir de éste, diluciones (1:10 y 1:100).

Microorganismos de ensayo: Se seleccionaron bac terias grampositivas: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 19433 y gramnegativas: Escherichia coli ATCC 25992, Klebsiella pneumoniaea ATCC 23357, Pseudomona, aeruginosa ATCC 27853.

Preparación de los inóculos bacterianos: Se partió de cepas frescas y purificadas en un medio de cultivo básico. Con un asa en aro se tomó una pequeña cantidad de colonias para luego ser suspendidas en una solución de cloruro de sodio al 0,85% estéril hasta alcanzar la turbidez equivalente al 0,5 McFarland (106-8 UFC/ml).

Evaluación de la actividad antibacteriana por el Método de Difusión del Agar: Se impregnaron discos de papel filtro (3M) de 4 mm de diámetro con 20 ml del concentrado y diluido; del mismo modo se impregnaron discos con el solvente utilizado (etanol al 97%), el cual fue el control negativo. El control positivo estuvo representado por un disco de antibiótico comercial que inhibe el crecimiento bacteriano de las cepas ensayadas: disco de Vancomicina (Oxoid) de 30 mg para las bacterias grampositivas y disco de Ciprofloxacina (Oxoid) de 5 mg para las bacterias gramnegativas.

Preparación de las placas e inoculación: En las placas de Petri se colocaron 20 ml de agar Müeller Hinton (Himedia) estéril, dejándose solidificar a temperatura ambiente. Una vez preparadas las placas se inoculó en forma homogénea la superficie de cada una de ellas con los inóculos bacterianos, utilizando para ello un hisopo de algodón estéril.

Colocación de los discos impregnados: Una vez que las placas fueron debidamente inoculadas, sobre la superficie se colocaron en forma equidistantes los discos impregnados con el extracto concentrado, los diluidos y los controles negativos y positivos.

Preincubación e incubación: Después de la colocación de los discos en las placas de agar Müeller Hinton, éstas fueron incubadas a 4 ºC durante un mínimo de 12 horas, luego se colocaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y posteriormente fueron incubadas a 37 ºC por 24-48 horas. Las pruebas se realizaron por duplicado.

Formulación de una crema antiacné a base del extracto etanólico de Azadirachta indica: Se incorporó el extracto vegetal, empleando la concentración que mostró la mayor sensibilidad (5%), a una base hidrosoluble en un mortero limpio. Se mezcló, se envasó y se rotuló, como una “Crema Antiacné”.

En la Tabla 1 se muestran los resultados obtenidos de la actividad antibacteriana de los extractos etanólicos de las hojas de Azadirachta indica A. Juss, observándose que el Staphylococcus aureus presentó la mayor sensibilidad en una zona de inhibición de 15 mm. con la dilución 1/10; E. faecalis, con una sensibilidad de 7 mm, tanto en las diluciones 1/10 y 1/100; K. pneumoniae con una zona de inhibición de 8 mm; y E. coli, mostró ser resistente a todas las diluciones ensayadas.

En la Tabla 1 se expresan los resultados obtenidos en la valoración de los extractos etanólicos, donde las diluciones 1:1, 1:10 y 1:100 mostraron actividad antibacteriana contra las bacterias grampositivas: Staphylo coccus aureus y Enterococcus feacalis y bacterias gram negativas: Escherichia coli (no activa), Klesiella pneumoniae y Pseudomona aureoginosa.

El extracto tiene actividad inhibitoria selectiva sobrelas bacterias probadas. Los ensayos antibacterianos determinaron que la actividad inhibitoria contra las cepas estudiadas fueron especies dependientes. Diluciones iguales a 1/100 demostraron poder inhibitorio sobre todas las bacterias excepto E. coli, E. feacalis y K. pneumoniae, las cuales fueron sensibles al extracto independientemente de su concentración. Por el contrario, S. aureus y P. aureoginosa demostraron incremento de la sensibilidad a medida que la concentración disminuía.

El extracto etanólico mostró actividad antibacterial contra importantes patógenos como Staphylococcus aureus, Enterococcus feacalis, Klesiella pneumoniae, Pseudomona aureoginosa. Este poder inhibitorio fue ob servado con las diluciones 1:1, 1:10 y 1:100, del extracto etanólico. Sin embargo, el extracto etanólico no mostró ninguna actividad inhibitoria contra Escherichia coli (tabla 1).

Esta búsqueda sugiere que los principios activos extraídos con etanol de las hojas, pueden jugar un rol significativo en la acción inhibitoria contra bacterias clínicamente importantes.

En base a los resultados obtenidos sobre la actividad antibacteriana de los extractos de las hojas de Aza dirachta indica, la dilución 1/10 resultó ser la más eficiente para inhibir el crecimiento de Staphylococcus aureus. La dilución 1/100 también resultó ser eficiente para inhibir Klesiella pneumoniae y Pseudomona aureoginosa; en consecuencia, se preparó una crema con propiedades antibacterianas al 5%.

Los resultados obtenidos de esta investigación se correlacionaron con estudios realizados (6) donde los extractos de la semilla del Neem mostraron actividad an timicrobiana contra E. coli, S. Typhi, S. dysenteroides, P. vulgaris, P. aeruginosa, S. faecalis, S. aureus.

La fórmula magistral elaborada presentó las si guientes características organolépticas: olor característico a la planta, color beige claro, aspecto homogéneo; fácil absorción.

1. Se evaluó la actividad antibacteriana de los extractos etanólicos obtenidos de las hojas de Azadirachta indica, frente a diferentes cepas de microorganismos: gram positivas; S. aureus, E. faecalis; gramnegativas: E. coli, K. pneumoniae y P. Aureuginosa, por el método de dilución en agar con disco impregnado.

2. Las diluciones 1/10 y 1/100 mostraron actividad an tibacteriana contra las cepas de Staphylococcus aureus, Enterococcus feacalis, Klesiella pneumoniae, Pseudomona aureoginosa, en consecuencia se preparó una crema, antiséptica para el acné.

3. El método de extracción Soxhelt, empleando como solvente el etanol al 98%, permitió extraer los principios activos de las hojas.

Entre las recomendaciones podemos mencionar:

1. Evaluar la efectividad de la crema en pacientes con acné.

2. Extraer los principios activos del fruto y evaluar actividad antimicrobiana.

3. Formular un gel, loción o jabón antibacteriano.

4. Evaluar la actividad antimicrobiana contra el Propionibacterium acnes.

Al ingeniero Juan Mendoza por contribuir con la identificación taxonómica de la especie Azadirachta indica a la doctora María del Carmen Araque, del La boratorio de Biología Molecular de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis de la Universidad de Los Andes, por realizar la actividad antimicrobiana

1. De los Ríos C, Hidalgo D, Quintero M, Marqués G, Crescente O. Estudio preliminar in vitro de la actividad biológica de Chromolaena voglii (Robinson) H. Huber. Revista de la Facultad de Farmacia. 1999, 36: 2-5.        [ Links ]

2. Cáceres A, Cano O, Samayoa B, Aguilar L. Plants used in Guatemala for the treatment of gastrointestinal disorders. 1. Screening of 84 plants against enterobacteria. Journal of Ethnopharmacology. 1990; 30(1): 55-73.        [ Links ]

3. Dimayuga R, García S. Antimicrobial screening of medicinal plants from Baja California Sur Mexico. Journal of Ethnopharmacology. 1991; 31: 181-192.        [ Links ]

4. Pokorný R, Olejníková P, Balog M, Zifcák P, Hölker U, Janssen M, et al. Characterization of microorganisms isolated from lignite excavated from the Záhorie coal mine (southwestern Slovakia). Research in Microbiology. 2005; 156 (9): 932-943.        [ Links ]

5. El Solh N, Moreau N, Ehrlich S. Molecular cloning and ana lysis of Staphylococcus aureus chromosomal aminoglycoside resistance genes. Plasmid. 1986; 15 (2): 104-118.        [ Links ]

6. SaiRam M, Ilavazhagan G, Sharma S, Dhanraj S, Suresh B, Parida M. Antimicrobial activity of a new vaginal contraceptive NIM-76 from neem oil (Azadirachta indica). Journal of Ethnopharmacology. 2000; 71: 377-382.        [ Links ]

7. Mukherjee S, Garg S, Talwar G. Early post implantation con traceptive effects of a purified fraction of Neem (Azadirachta indica) seeds, given orally in rats: possible mechanisms involved. Journal of Ethnopharmacology. 1999; 67: 287-296.        [ Links ]