Metaloenzimas tipo VIM detectadas en aislamientos clínicos en Pseudomonas aeruginosa en cuatro hospitales en Venezuela.

VIM- type metalloenzymes detected in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in four Venezuelan hospitals.

Damarys I Sánchez G¹, Daniel Marcano Z¹, Enza Spadola C^1,2, Lilia V León G¹, Daisy J Payares B¹, Carmen I Ugarte N^1,3, Nuris N Salgado M, Graciela Maggi O³, Armando Guevara P⁴, Samari Torres G¹, José A Rodríguez U¹, Ángel H Flores R¹, Betty D Tarazona G¹

¹ Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel", Caracas, Dtto. Capital.

² Hospital Militar Dr. Carlos Arvelo, Caracas, Dtto. Capital.

³ Hospital de Niños J.M. de los Ríos, Caracas, Dtto. Capital.

⁴ Hospital Universitario Ruiz y Páez, Ciudad Bolívar, Edo. Bolívar. Correspondencia a Damarys I. Sánchez. Dirección: Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel", Dpto. de Bacteriología, Ciudad Universitaria, Los Chaguaramos. Correo electrónico: dsanchez@inhrr.gov.ve; damarys_sanchez@yahoo.com.

En los últimos años se ha observado mundialmente un incremento del aislamiento de cepas de Pseudomonas aeruginosa resistentes a múltiples antibióticos, siendo la producción de β-lactamasas la principal causa de resistencia a los antibióticos β-lactámicos, los cuales constituyen la única opción terapéutica en muchos casos. Las metalo-β-lactamasas (MBLs) son una familia de enzimas degradadoras de β-lactámicos que recientemente han emergido como determinantes de resistencia de importancia clínica y que son activas contra los carbapenem; no hidrolizan a los monobactámicos; son inhibidas por agentes quelantes de iones metálicos como el EDTA y el ácido dipicolínico; no son inhibidas por el ácido clavulánico, sulbactan ni tazobactan y presentan uno o dos iones de zinc en su sitio activo. Este reporte describe la detección de MBLs tipo VIM mediante ensayos fenotípicos y moleculares en nueve cepas de Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenems aisladas de muestras clínicas de cuatro hospitales de Venezuela. Por métodos fenotípicos se evidenció que 100% de las cepas eran productoras de MBLs, y por PCR todas las MBLs resultaron ser de la familia VIM, las cuales confieren alto nivel de resistencia a los antibióticos β-lactámicos, con excepción del Aztreonam, único antibiótico al cual se observó sensibilidad, complicando así las opciones terapéuticas.

Palabras clave: Antibióticos, Pseudomonas aeruginosa, carbapenem, metalo-β-lactamasa.

Abstract

In recent years there has been a worldwide raise in the isolation of Pseudomonas aeruginosa strains with resistance to multiple antibiotics, being β-lactamase production the main cause of resistance to β-lactamic antibiotic (which are the only therapeutic option in many cases). The MBLs are an β-lactamic- degrading enzymatic family that have emerged as clinically relevant resistance determinants and are active against carbapemens, don´t hydrolise monobactams, have one or two zinc ions in its active site and are inhibited by metallic ions chelating agents such as EDTA and dipicolinic acid, but aren´t inhibited by β-lactamase inhibitors such as clavulanic acid, sulbactam or tazobactam. This report describes the detection of VIM-type MBLs by phenotypic and molecular methods in 9 carbapenemsresistant Pseudomonas aeruginosa strains isolated from clinical samples of four Venezuelan hospitals. By phenotypic methods it was evidenced that 100% of the strains were MBLs producers, and by final- point PCR it was determined that all the MBLs were from the VIM family, which confer high- level resistance to the β-lactamic antibiotics (except Aztreonam), and because they are carried by plasmids with the ability to transfer horizontally to other bacterial families, they can be responsible for therapeutic complications in an individual or the patients collective.

Key words: Antibiotics, Pseudomonas aeruginosa, Carba-penems, metalo-β-lactamase.

Recibido: 01 de agosto de 2007 / Aceptado: 07 de febrero de 2008

INTRODUCCION

En los ultimos anos se ha observado un aumento en el aislamiento de cepas de Pseudomonas aeruginosa multirresistentes en todo el mundo; los hospitales de nuestro pais no escapan a esta realidad. Este hecho tiene gran relevancia al momento de la seleccion del tratamiento empirico en infecciones producidas por este microorganismo. P. aeruginosa es un importante patogeno oportunista en el ambito nosocomial, que causa un amplio rango de complicaciones clinicas tales como neumonia, sepsis, meningitis, otitis externa, infecciones urinarias, entre otros, y principalmente en pacientes inmunocomprometidos y sometidos a procedimientos invasivos en unidades de cuidados intensivos. Existen reportes de casos en los cuales se han encontrado cepas de P. aeruginosa resistentes a multiples antibioticos, y otros en los cuales este patogeno ha desarrollado resistencia intratratamiento a la terapeutica inicial (1); esto es debido a que, ademas de presentar resistencia intrinseca a varios antimicrobianos, frecuentemente presenta diversos mecanismos de resistencia adquirida, lo que conlleva a una clara reduccion de las posibilidades terapeuticas (2). La produccion de β-lactamasas es la principal causa de resistencia a los antibioticos β-lactamicos entre las bacterias Gram negativas (3). Existen dos familias diferentes de β-lactamasas, no relacionadas entre si, las serino-β-lactamasas y las metalo β-lactamasas (MBLs), este ultimo grupo es capaz de degradar todos los antibioticos β-lactamicos con excepcion de los mono bactames, confiriendole altos niveles de resistencia a estos aislamientos (4). Las MBLs son una familia de enzimas degradadoras de β-lactamicos presentes en algunas especies de bacilos Gram negativos ambientales que recientemente han emergido como determinantes de resistencia de importancia clinica. Estas enzimas, que pertenecen a la clase B de la clasificacion molecular  de Ambler y al grupo 3 de la clasificacion funcional de Bush, Jacoby y Medeiros, presentan las siguientes caracteristicas: son activas contra los carbapenemos, no hidrolizan a los monobactamicos, son inhibidas por agen tes quelantes de iones metalicos como el EDTA y el acido dipicolinico, no son inhibidas por el acido clavulanico, sulbactan ni tazobactan, y presentan uno o dos iones de zinc en su sitio activo, los cuales se unen a moleculas de agua que intervienen en la inactivacion por hidrolisis del anillo β-lactamico (5,6,7,8).

La clasificación de Bush agrupa a las betalactamasas según los perfiles del sustrato y su inhibición por el ácido clavulánico, incluyendo dentro del grupo 3 las carbapenemasas tipo metalobetalactamasas (9), que proporcionan resistencia a los carbapenem; y son inhibidas por EDTA (10).

La subclase B1 de la clasificación molecular de Ambler agrupa a las MBL transferibles de tipo IMP, VIM, SPM, GIM y SIM; las cuatro primeras han sido encontradas en P. aeruginosa, las IMP y las VIM son los tipos de MBLs más diseminadas. La IMP1 fue la primera MBL des crita P. aeruginosa, en cepas recuperadas de un bro te de infección nosocomial en Japón (11). Esta enzima exhibe un perfil de actividad de amplio espectro que incluye actividad contra penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, oxacefamicina y carbapenem, sólo los monobactam escapan de esta acción (12). Las MBLs del tipo VIM son las más frecuentes en el continente americano y poseen variantes alélicas numeradas del 1 al 12, dentro de las cuales la más diseminada a nivel mundial es VIM-2. Estas enzimas están bien identificadas en la resistencia a carbapenem en P. aeruginosa y en otros no fermentadores, desde los países de Europa, y la cuenca mediterránea (Italia, Francia, Grecia, España y Turquía), como en los países del extremo Le jano Oriente (Korea, Taiwán y Singapur), Estados Unidos y América.

Las MBLs tienen un amplio rango de hidrolisis de sustratos que pueden degradar practicamente a todas las betalactamasas, excepto los monobactam (13). Este reporte describe la deteccion de metalo-β-betalactamasas tipo VIM presentes en cepas aisladas en cuatro hospitales en Venezuela.

Cepas: Se estudió un total de nueve cepas de origen clínico, previamente descritas como Pseudomonas aeruginosa resistentes a los β-lactámicos, incluyendo los carbapenemas, colectadas de muestras clínicas en pacientes hospitalizados. La información epidemiológica se muestra en la tabla 1.

Estudio de la sensibilidad: A todas las cepas recibidas se les realizó pruebas de susceptibilidad por el método de difusión en agar descrito en el documento M2-A10 del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (14), determinándose el perfil de susceptibilidad a los siguientes antimicrobianos: imipenen, meropenem, aztreonam, piperacilina/tazobactam, ceftazidima, cefepima, amikacina y ciprofloxacina, para esto se usaron dis cos comerciales (Oxoid). Como control de calidad se usaron las cepas Escherichia coli ATCC 25922 y Pseu domonas aeruginosaATCC 27853, y los resultados fueron interpretados utilizando los criterios del documento M100-S16 CLSI (15).

Deteccion de MBLs: La deteccion de metalo β-lactamasas se realizo mediante la doble difusion con discos, utilizando discos de imipenem (IPM), meropenem (MER) y EDTA- (EDTA-SMA). Para esto se inoculo una pla ca de agar Mueller Hinton con una suspension de la cepa problema con una turbidez equivalente al 0,5 de MacFarland, y luego se coloco el disco de EDTA-SMA en el centro de la placa y a ambos lados, a 1,5 cm de dis tancia, los discos de IPM y MER. La ampliacion del halo de susceptibilidad de meropenem y/o imipenem en la proximidad del disco de EDTA-SMA indico la presencia de una metalo β-lactamasa. Los discos de EDTASMA fueron preparados impregnando discos de papel de filtro de 6 mm de diametro con 10 ml de una solucion que contenia 4 volumenes de EDTA 0,5 M y 6 volumenes de SMA 300 mg/ml (16). Como control positivo se utilizo la cepa Pseudomonas aeruginosa M7017 productora de MBL tipo IPM y como control negativo se uso la cepa de Pseudomonas aeruginosa Fav-20 hiperproductora de bomba de eflujo (provenientes del Instituto Dr. Carlos Malbran, Buenos Aires, Argentina).

Identificación de genes metalo-β-lactamasa: La presencia de los genes bla_VIM-like para Pseudomonas ae ruginosa fue analizado por la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), amplificando un segmento de 261 pares de bases de los genes de la familia VIM, empleando secuencias especificas iniciadoras para VIM-F (ATTGGTCTATTTGACCGCCGT) y VIM-R (CTA CT CAAC GACTGAGCGGAT) según procedimientos estándar (17). Como control de extracción se amplificó la secuencia de 16S ribosomal de las cepas en es tudio utilizando los iniciadores 16S-F 5’-AGGAGGTGATCCAACCGCA y 16S-R 5’-AACTGGAG GAAG GT - GGGGAT (18). La amplificación se realizó en un ter mociclador Applied Biosystem Gene Amp PCR System 2400. El programa de PCR consistió en una desnaturalización inicial a 94 °C por 5 min. y posteriormente se realizaron 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 30 segundos, alineación a 57 °C por 30 segundos y extensión a 72 °C por 30 segundos, culminando el protocolo con un paso de extensión final a 72 °C por 5 mi nutos. El volumen final de la reacción fue de 50 µL. Los productos de PCR fueron analizados en gel de agarosa al 1% y teñido con bromuro de etidio, analizado con el equipo de fotodocumentación (Gel Doc XR- ChemiDoc XRS BIO-RAD)^®.

Las nueve cepas procesadas e identificadas previamente como Pseudomonas aeruginosa mostraron 100% de resistencia a aminoglucósidos y los siguientes lactámicos: ceftazidima, cefepima, imipenem y meropenem, mientras que para aztreonam 89% de las cepas fueron sensibles, encontrándose solo el 11% con resistencia a este antibiótico.

Al realizar la detección de MBLs por el método de difusión con discos se observaron zonas de sinergia entre los discos de IMI- EDTA–MER en todas las cepas, demostrando fenotípicamente la presencia de MBLs figura 1).

La amplificación por PCR de genes de la familia VIM resultó positiva en las nueve cepas procesadas, obteniéndose productos de 261 pb, lo cual indica la presencia del gene bla_VIM-like.

P. aeruginosa se caracteriza por su capacidad para producir intrínsecamente enzimas degradadoras y mo dificadoras de antibióticos, así como por su capacidad para captar elementos genéticos extracromosomales que codifican mecanismos de resistencia, entre los cuales se encuentran la produccion de MBLs (19). Las MBLs principalmente encontradas en el continente americano son de la familia VIM, habiendose reportado en dos hospitales de Caracas la enzima VIM-2 (20), lo cual es consistente con nuestros hallazgos. Los genes que codifican a las MBLs son transmisibles ya que estan frecuentemente asociados a plasmidos que tambien poseen ge nes que codifican enzimas modificadoras de aminoglucosidos (21,22,23), esto explica la resistencia a β-lactamicos y aminoglucosidos encontrados en las ce pas estudiadas. Adicionalmente, P. aeruginosa puede presentar resistencia a otros grupos de antimicrobianos, incluyendo al aztreonam, lo cual puede deberse a otros mecanismos de resistencia que posea la bacteria como perdida de porinas, hiperproduccion de AmpC, produccion de β-lactamasas de espectro expandido y modificacion de las topoisomerasas II y IV (8,24). En el con tinente americano se han detectado las MBL: IMP-1, IMP-7, IPM-16, VIM-2, VIM-7, VIM-8 y SPM-1, muchas de las cuales han sido reportadas en P. aeruginosa (25). La primera VIM-2 de Suramerica fue reportada en el ano 2002 en Chile y Venezuela (20). Otro estudio realizado en nuestro pais evidencia la tendencia de la resistencia a los antibioticos β-lactamicos y otros antimicrobianos en cepas de P. aeruginosa aislada en hospitales publicos y privados, resultando en una mayor resistencia en cepas nosocomiales provenientes de hospitales publicos que aquellos provenientes de hospitales privados, donde cefepime e imipenem muestran menor resistencia en los centros privados en comparacion con los publicos; tambien se observo un aumento progresivo de la resistencia ante todos los antibioticos β-lactamicos utiles para el tratamiento de infecciones por P. aeruginosa. Esta resistencia se ha encontrada asociada con un elevado uso de antimicrobianos en los hospitales (26). P. aeruginosa es un reconocido patogeno nosocomial que ha incrementado sus niveles de resistencia, y esto se puede atribuir a una combinacion de factores, tales como inadecuado control de infecciones nosocomiales en presencia de carbapenemasas tipo VIM, ya que estos genes estan generalmente ubicados en integrones que contienen genes estructurales que pueden conferir resistencia a multiples antibioticos.

La presencia de metalo-β-lactamasas en microorganismos de nuestros hospitales reviste gran importancia, ya que puede traer graves consecuencias debido a que los elementos geneticos que codifican estos determinantes de resistencia pueden ser transferidos desde P. aeruginosa a otros bacilos Gram negativos como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Enterobacter spp, por nombrar algunos. Este fenomeno ya ha sido reportado en Australia (8). Si esto sucede, tendremos como consecuencia la produccion de infecciones nosocomiales producidas por bacilos Gram negativos multirresistentes (incluyendo resistencia al imipenem y meropenem), con la consecuente elevacion de la estancia hospitalaria, mortalidad y costos.

En conclusion, reportamos la presencia de genes bla_VIM-like en P. aeruginosa, lo que sugiere la emergencia de este tipo de mecanismos de resistencia en Venezuela que le confieren alto nivel de resistencia a los antibioticos β-lactamicos, por lo cual se hace necesaria la implementacion en nuestros hospitales de adecuados programas de control de infecciones nosocomiales, ya que estos genes tienen la capacidad de diseminarse horizontalmente a cepas del mismo genero e incluso a otras familias bacterianas, limitando las opciones terapeuticas. En nuestros laboratorios de microbiologia es importante realizar de forma rutinaria la busqueda y caracterizacion de los mecanismos de resistencia a los antibioticos β-lactamicos de este tipo de cepas, ya que la opcion terapeutica es el aztreonam, y la presencia de mecanismos de resistencia a betalactamicos como las Betalactamasas de espectro expandido, limitaria su uso y complicaria la terapeutica antimicrobiana.

1. Giamarellou Helen. Prescribing guidelines for severe Pseudomonas infections. Journal of Antimicrobial Chemother. 2002; 49:229-233.        [ Links ]

2. Jordi V, Francesc M. Lectura interpretada del antibiograma de bacilos gramnegativos no fermentadores. Enferm Infec Microbiol Clin. 2002; 20:304-312.        [ Links ]

3. Jacoby GA, Munoz-Price LS. The New β-lactamases. New Engl J Med. 2005; 352:380-391.        [ Links ]

4. Rossolini Gian M. Acquired Metallo-β-lactamases: An Increasing Clinical Threat. Clin Infect Dis. 2005; 41:1557-1558.        [ Links ]

5. Murphy T, Simm A, Toleman M, Jones R, Walsh T. Bio chemical characterization of the adquired Metallo β-lactamases SPM-1 from Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 2003; 47: 582-587.        [ Links ]

6. Toleman M, Biedenbach D, Bennett D, Jones R, Walsh T. Italian metallo β-lactamases: a national problem? Report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Programme. J Antimicrob Chemother. 2005; 55: 61-70.        [ Links ]

7. Sader H, Castanheira M, Mendes R, Toleman M, Walsh T, Jones R. Dissemination and diversity of metalo β-lactamases in Latin America: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program. Int J Antimicrob Agents. 2005; 25: 57-61.        [ Links ]

8. Peleg A, Franklin C, Bell J, Spelmam D. Dissemination of the metallo β-lactamase gene bla IMP-4 among gramnegative pathogens in a clinical setting in Australia. Clin Infect Dis. 2005; 41: 1549-1556.        [ Links ]

9. Bush K, Jacoby M, Medeiros A. A Funtional Classification Scheme for β-Lactamases and Its Correlation with Molecular Structure. J Antimicrob Chemother. 1995; 39:1211-1233.        [ Links ]

10. Marchiaro P, Mussi M, Ballerini V, Pasteran F, Viale A, Vila A, Limansky A. Sensitive EDTA-Based Microbiological Assays for Detection of Metallo-β-lactamases in Nonfermentative Gram-Negative Bacteria. Antimicrob Agents Chemother. 2005; 43: 5648-5652.        [ Links ]

11. Athanassios T, Spyros P, Neil W, Livermore D. Outbreak of infections caused by Pseudomonas aeruginosa producing VIM-1 carbapenemase in Greece. J Clin Microbiol. 2000; 38: 1290-92.        [ Links ]

12. Nobuhisa M, Naomasa G, Chie I, Eiko S, Satoshi O, Takeshi N. Interplay between chromosomal β-lactamase and the MexAB-OprM efflux system in intrinsic resistance to β-lactams in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 1999; 43: 400-02.        [ Links ]

13. Sardelic S, Pallecchi L, Punda-Polic V, Rossolini G. Carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa carrying VIM-2 metallo-β-lactamase determinants, Croatia. Emerg Infect Dis. 2003; 9:1022-1023.        [ Links ]

14. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Test; Approved Standard, Eighth Edition. Volume 23 Number 1. Wayne, Pennsylvania, USA: Clinical and Laboratory Stan dards Institute; 2003.        [ Links ]

15. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Testing: fourteen informational supplement. Document M100-S14. Wayne, Pennsylvania, USA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2003.        [ Links ]

16. Lee K, Lim YS, Yong D, Yum JH, Chong Y. Evaluation of the Hodge test and the Imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp. J Clin Microbiol. 2003; 41: 4623-4629.        [ Links ]

17. Galas M. Biología molecular: Manual de Laboratorio; Buenos Aires, Argentina: Instituto de Enfermedades Infecciosas Dr. Carlos Malbran; 2004.        [ Links ]

18. Greisen K, Loeffelholz M, Purohit A, Leona D. PCR Primers and Probes for the 16S rRNA Gene of Most Species of Pathogenic Bacteria, Including Bacteria Found in Cerebrospinal Fluid. J Clin Microbiol. 1994; 32:335-351.        [ Links ]

19. Gibb A, Tribuddharat C, Moore R, Louie T, Krulicki W, Livermore D, et al. Nosocomial outbreak of carbapenemresistant Pseudomonas aeruginosa with a new bla_IMP allele, bla_IMP-7. Antimicrob. Agents Chemother. 2002; 46:255-258.        [ Links ]

20. Mendez R, Castanheira M, Garcia P, Guzman B, Toleran T, Walsh R, Jones N, SENTRY Antimicrobial Survillance Program. First isolation of bla_VIM-2 in Latin America: report from the SENTRY Antimicrobial Survillance Program. Antimicrob Agents Chemother. 2004; 48:1433-1434.        [ Links ]

21. Kimura S, Alba J, Shiroto K, Sano R, Niki Y, Maesaki S, et al. Clonal diversity of metalo β-lactamase-possessing Pseudomonas aeruginosa in geographically diverse regionas of Japan. J Clin Microbiol. 2005; 43: 458-461.        [ Links ]

22. Walsh T, Toleman M, Poirel L, Nordmann, P. Metallo β-lactamases: the quiet before the storm?. Clin Microbiol Rev; 2005; 18:306-325.        [ Links ]

23. Xiong J, Inés M, Ye H, Chen H, Yang Y. and the Guangzhou Antibiotic Resistance Study Group. bla_IMP-9 and its association with large plasmids carried by Pseu domonas aeruginosa isolates from; the People´s Repu blic of China. Antimicrob. Agents Chemother, 2006; 50: 355-358.        [ Links ]

24. Lolans K, Queenan AM, Bush K, Saud A, Quinn JP. First nosocomial outbreak of Pseudomonas aeruginosa producing an integron-borne metallo β-lactamase (VIM-2) in the United States. Antimicrob. Agents Chemother. 2005; 49: 3538-3540.        [ Links ]

25. Villegas M, Lolans K, Olivera M, Suárez C, Correa A, Quee nan A, Quinn J, et al. First Detection of Metallo-β-Lactamase VIM-2 in Pseudomonas aeruginosa Isolates from Colombia. Antimicrob Agents Chemother. 2006; 50:226-229.        [ Links ]

26. Martín, G. Resistencia bacteriana a β-lactámicos: Evolución y mecanismos. Arch Ven de Farmacolog Terap, 2002; 21 (1): 107-116.        [ Links ]