Fraccionamiento y caracterización de las proteínas solubles de la harina de nuez de Barinas (Caryodendron orinocense K.)

Fanny C Padilla ^*1, Thanee Guédez ², María J Alfaro ¹, Miriam Regnault ³, Alicia M Rincón C ¹

* Autor para correspondencia.

¹ Unidad de Análisis de Alimentos, Facultad de Farmacia, Universidad Central de Venezuela (UCV) Apdo 40109 Caracas, 1040 Venezuela. fannypadilla@hotmail.com

² Postgrado de Ciencia y Tecnología de Alimentos, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela (UCV).

³ Laboratorio de Análisis de Medicamentos, Facultad de Farmacia, Universidad Central de Venezuela (UCV).

RESUMEN

La harina de nuez de Barinas (Caryodendron orinocense K.) de acuerdo a estudios realizados presenta un contenido de pro teínas en el rango de 15-18%, que permite se pueda considerar como fuente de proteína. Sin embargo no se conoce la composición de estas proteínas. En este estudio se realizó un proceso de fraccionamiento de acuerdo a la solubilidad en diferentes solventes (agua, cloruro de sodio al 5%, hidróxido de sodio 0,02N, etanol al 70%), y el establecimiento de la composición proteica según el peso molecular de la harina de nuez de Barinas obtenida a partir de las nueces secas, molidas y des grasadas, determinando el rango de pesos moleculares por SDS-PAGE y su comparación con el rango de pesos moleculares de las proteínas de la harina de soya (Glycine max). Asi mismo, se determinó la digestibilidad in vitro por hidrólisis enzimática. Los resultados indican un rango de PM de 20.000- 97.000 daltons para la soya y de 6.500-45.000 daltons para la nuez de Barinas. El peso molecular más bajo sugiere una más fácil digestión de las proteínas, que corrobora el valor de la di - ges tibilidad obtenido de 75%. Las proteínas presentes están cons tituidas por albúminas 50,72%, globulinas 15,56%, prolaminas 23,10% y glutelinas 2,52% que representan el 92,15% del total de proteínas presentes. Estas fracciones presentaron una pureza de 81,57%, 94,01%, 70,86% y 92,53%, respectivamente. Estos resultados sugieren la posibilidad de uso de la harina de Caryodendron orinocense K en el desarrollo de productos alimenticios para niños y ancianos.

Palabras clave: Caryodendron orinocense K, fraccionamiento de proteínas, albúminas, globulinas, prolaminas, glutelinas.

Fractionation and characterization of soluble proteins from nuez de Barinas (Caryodendron orinocense K.) flour

SUMMARY

Nuez de Barinas (Caryodendron orinocense K.) flour has been reported to have a content of proteins in the range of 15-18% that allows considering it as a source of proteins. However, there is no evidence on the composition of these proteins. The objective of this study was the extraction and separation of the different fractions of proteins based on their solubility in different solvents (water, 5% sodium chloride, sodium hydroxide 0.02N, and 70% ethanol), and the protein composition assessment of the nuez de Barinas flour from dried, milled, and defatted nuts; by analysis of the range of mo lecular weight by SDS-PAGE. Molecular weights of proteins from soybean (Glycine max) flour, were used for comparison. In vitro protein digestibility was determined by enzymatic hydrolysis. Results presented soy proteins in the range of 20.000-97.000 daltons while the nuez de Barinas flour proteins were in the range of 6.500-45.000 daltons. Low molecular weight proteins should suggest a much easier digestibility of these proteins, which is related to the digestibility index of 75% found. Protein composition was found to be 50,72% albumins, 15,56% globulins, 23,10% prolamins, and 2,52% glutelins which represent 92,15% of total proteins present. These fractions showed a percent purity of 81.57, 94.01, 70.86 and 92.53, respectively. These results suggest the possibility to use this flour Caryodendron orinocense K. in developing food products for children and elderly persons.

Key words: Caryodendron orinocense K, protein fractionation, albumins, globulins, prolamins, glutelins.

Recibido: 04 de marzo de 2009 / Aprobado: 09 de julio de 2009

INTRODUCCIÓN

La búsqueda de fuentes alternativas de proteínas se ha convertido, a lo largo de las últimas décadas, en una im portante tendencia de investigación, no solo para encarar la creciente demanda de proteínas sino también para conseguir cultivos alternativos que sustituyan a las proteínas de origen animal, capaces de suplementar proteína de alta calidad (1) y prevenir la malnutrición. Las proteínas de nueces en general, gozan de aceptación mun dial y son valoradas por sus atributos sensoriales y nu tricionales. La harina de nuez de Barinas (Caryoden - dron orinocense K.), árbol nativo del piedemonte andino ve nezolano de acuerdo a estudios realizados presenta un contenido de proteínas en el rango de 15-18%, que permite se pueda considerar como fuente de proteína (2).

El fraccionamiento de las proteínas de fuentes alimenticias tiene gran importancia porque permite explicar la contribución de cada fracción a la calidad nutricional y las propiedades funcionales y por ende las aplicaciones en la elaboración de ciertos productos alimenticios (3). La extracción o fraccionamiento de proteínas de nueces, cereales y leguminosas ha sido realizada por diferentes autores en base a su solubilidad en diferentes solventes (4-6). Si la calidad de una proteína es importante, le sigue en importancia la digestibilidad, pues no todas las proteínas son digeridas, absorbidas y utilizadas en la misma medida por el organismo humano. Las diferencias de digestibilidad entre las proteínas pueden deberse a diferencias inherentes a la naturaleza de las mismas (configuración, unión de los aminoácidos), a la presencia de componentes no proteicos con influencia en la digestión (fibra dietaria, taninos y fitatos), a la presencia de factores antinutricionales o a las condiciones de procesamiento de los productos que las contienen que pueden interferir con los procesos enzimáticos de liberación de los aminoácidos. Aún cuando ya se ha establecido la importancia nutricional y tecnológica de la harina de nuez de Barinas, no se han llevado a cabo la determinación de la digestibilidad in vitro y la separación y caracterización de las diferentes fracciones proteicas de la misma; razón por la cual surge la necesidad de realizar este estudio.

MATERIALES Y MéTODOS

Preparación de la muestra:

Las nueces de Caryodendron orinocense K., obtenidas en la región de Calderas, Edo. Barinas, Venezuela, fueron descascaradas manualmente y posteriormente molidas en un equipo Modelo 43A F.J. (Stokes Machine Company, Filadelfia, USA). La harina obtenida fue desecada en una estufa con extractor de aire Modelo 38B (Stokes Machine Company, Filadelfia, USA) a 45 °C por un período de 24 h y desgrasada en un extractor de Soxh let Vari-Heat, Chicago, USA, utilizando como solvente hexano grado analítico, evaporándolo luego en un rotavapor Heidolph VV 2011 (Heidolph-Elektro Kelheim, Germany). La harina así obtenida se hizo pasar a través de un tamiz de 60 micras de diámetro, para obtener un material uniforme, que se almacenó en bolsas plásticas, a vacío a 0 °C, hasta su posterior tratamiento y evaluación.

Fraccionamiento de proteínas:

Las proteínas de la harina desgrasada fueron extraídas, de acuerdo a su solubilidad según el esquema de la Fig. 1, en una relación de (1:10) durante 30 min con agi tación constante, realizando la extracción con cada solvente dos veces, para obtener en el agua (albúminas), en solución de NaCl al 5% (globulinas), en NaOH 0,02N (glutelinas) y en alcohol al 70% prolaminas (7). Luego del período de extracción se centrifugó a 3000 x g durante 30 min y los sobrenadantes del mismo solvente se combinaron, se precipitaron las proteínas en su pun to isoeléctrico y los precipitados se lavaron con agua has ta neutralidad (pH 7) para luego liofilizarlos, pesarlos, almacenarlos en viales cerrados a -20 oC hasta la realización de los ensayos.

Determinación de proteínas

El contenido de nitrógeno presente en la harina de nuez de Barinas, y en cada sobrenadante y fracción liofilizada obtenidos durante el proceso de extracción se de terminó por el método de micro-Kjeldahl (8), para obtener las proteínas presentes multiplicando el resultado por el factor 6,25. Se calculó el porcentaje de recuperación o rendimiento del proceso de extracción tomando en cuenta el porcentaje de proteínas de la harina de nuez de Barinas y el porcentaje de proteínas presentes en el volumen total de sobrenadante de cada proceso de extracción. El porcentaje de pureza se calculó como el porcentaje de proteínas presentes en cada precipitado liofilizado.

Figura 1. Esquema de fraccionamiento de las proteínas de la harina de Caryodendron orinocense K.

Electroforesis:

El rango de peso molecular de las proteínas se obtuvo por SDS-PAGE en geles miniatura (7 x 7 cm) de po liacrilamida y comparación con las proteínas de la harina de soya (9). Se pesaron 1g de harina de soya y 2g de harina de nuez de Barinas, se agregó buffer fosfato de sodio pH 7,3. Las muestras se agitaron 1 min., se centrifugaron y filtraron.

Se tomaron 200 µl del filtrado y se añadieron 200µl del buffer de muestra (Tris-HCl 0,5M, pH 8,8 12,5%, glicerol 10%, dodecil sulfato de sodio (SDS) 2%, mercaptoetanol 5% y azul de bromofenol 0,00125%), se llevó a ebullición 5 min y se enfrió a temperatura ambiente. Es ta preparación se conservó bajo congelación hasta el momento de su uso. Alícuotas de 5µl se tomaron y se colocaron en las cavidades de los geles. La electroforesis se efectuó en geles de SDS-poliacrilamida al 12% total. El rango de peso molecular de la mezcla proteínas es tándar fue de 6.500 a 205.000 Daltons.

DIGESTIBILIDAD in vitro

Se realizó de acuerdo al método multienzimático (10). Las enzimas utilizadas fueron tripsina, quimotripsina y peptidasa. La digestibilidad se correlaciona con el descenso del pH después de 10 min. de la suspensión de proteína a pH 8 y 37 ºC, usando como patrón la caseína.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Todas las determinaciones realizadas fueron hechas por triplicado, y los resultados se calcularon sobre base seca, expresándose como promedio y desviación estándar.

RESULTADOS

En la Tabla 1 se puede observar que la fracción de al búminas fue la más abundante en la harina de nuez de Ba rinas, seguida de las prolaminas mientras el porcentaje total de proteína extraída fue de 92,15% (% de recuperación o rendimiento). Los valores de pureza de las frac ciones de proteínas variaron entre 94,01% para las globulinas y 70,86% para las prolaminas. La determinación de pesos moleculares por electroforesis SDS-PAGE (Tabla 2) indica la presencia de 2 ban das de proteínas de bajo peso molecular en la muestra de harina de nuez de Barinas (C. orinocense K.) iguales a las de proteínas de harina de soya y otras 3 bandas diferentes a las de soya, lo cual se presenta en un rango de PM de 6.500 - 45.000 daltons en la nuez de Barinas.

Tabla 1 Contenido y pureza de las fracciones de proteínas de la harina de nuez de Barinas (C. orinocense K.)

Tabla 2 Peso molecular de proteínas presentes en harina de nuez de Barinas (C. orinocense K.) y soya (Glycine max)

El estudio de la digestibilidad de la harina de nuez de Barinas (C. orinocense K.) in vitro presentó un valor de 75,5±0,2%.

DISCUSIÓN

El mayor contenido de albúminas y de prolaminas diferencia la harina de nuez de Barinas (C. orinocense K.) de otras leguminosas que son ricas en albúminas y prin cipalmente globulinas como es el caso del Phaseolus vulgaris (11) y lupino (Lupinus mutabilis) (12). La variación en el contenido de albúminas en leguminosas ha sido ampliamente reportada y de acuerdo con Bhatty (13) esto se debe al proceso de extracción, temperatura y el pH utilizado. Un rendimiento o porcentaje de recuperación de 92,15% se puede considerar alto, si se compara con un 42,4% obtenido para las proteínas del Phaseolus lunatus (14). La harina de nuez de Barinas contiene baja cantidad de glutelinas como las leguminosas pero se diferencia de estas por su contenido en prolaminas (15). El alto contenido de prolaminas la hace más cercana a las harinas de cereales que tienen como fracción proteica principal a las prolaminas.

En las determinaciones de pesos moleculares de las proteínas presentes por SDS-PAGE de las muestras analizadas (Tabla 2) se indica la presencia de 2 bandas de bajo peso molecular (20.000 y 36.000 Daltons) iguales a las presentadas por la harina de soya y además otras 3 bandas diferentes a la soya pero también de bajo peso molecular (6.500, 14.200 y 29.000 Daltons).

Los resultados de los porcentajes de pureza de las fracciones proteicas, que fueron relativamente altas con excepción de las prolaminas, indican que el proceso de extracción fue adecuado bajo las condiciones programadas; dos extracciones sucesivas durante 30 min. cada una con agitación constante, pues el aumento del tiempo de extracción a 60 min no arrojó diferencias significativas en el porcentaje de recuperación y pureza.

La digestibilidad in vitro de la harina de nuez de Barinas (C. orinocense K.) presentó un valor de 75,5±0,2%, valor similar al encontrado para el concentrado de lupino (Lupinus mutabilis) (16) y menor que el de aislado de soya (88.4%) (17). En general los aislados y concentrados proteicos presentan una mayor digestibilidad debido al proceso de obtención de los mismos que elimina parcial o totalmente algunos de los constituyentes no proteínicos (18).

Se ha demostrado que la harina de nuez de Barinas (C. orinocense K.) no contiene inhibidores de tripsina y presenta un contenido de fibra dietaria de 2.5 % (2), Sin embargo, es importante resaltar este valor de la digestibilidad (75,5%) porque estudio realizado en la harina de Canavalia ensiformis (leguminosa) se encontró una digestibilidad mucho menor 49,87% (19), por lo tanto una mayor digestibilidad significa una ventaja de la harina de C. orinocense K.

Como conclusión se puede inferir que la harina de nuez de Barinas (C. orinocense K.) tiene potencial como in grediente en la formulación de alimentos para niños y ancianos, por las características fisiológicas que presentan estos grupos etarios y tomando en consideración los resultados obtenidos de bajo peso molecular de las proteínas y alta digestibilidad.

REFERENCIAS

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