Dimensionamiento de los sistemas de microfiltración y ultrafiltración para la producción de la Toxina Diftérica elaborada en el Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”

José G Santiago D¹, Katiuska D Pineda¹ y Gabriel Olmo²

1 Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”, Division de Producción de Vacunas Bacterianas

2 Pall Corporation, Puerto Rico.

RESUMEN

Se evaluó el uso de la tecnología de Flujo de Filtración Tangencial (FFT), para obtener la toxina diftérica a partir de cultivos de la bacteria Corynebacterium diphtheriae, usando el proceso de Microfiltración (MF), para eliminar el paquete celular y posteriormente, a partir del filtrado obtenido, concentrar y diafiltrar la toxina diftérica usando el proceso de Ultrafiltración (UF). Se determinaron características de los filtros, condiciones de trabajo y dimensionamiento de los equipos a adquirir para la producción industrial de Toxina Diftérica. Se evaluaron el flujo, tiempo, rendimiento del proceso y las características del producto obtenido, utilizando cultivos con Toxina Diftérica en un equipo de filtración de laboratorio, diseñado para producir el efecto de FFT. Seseleccionó las membranas tipo cassettes, formato Médium Screen, porosidad 0,2 μm, como las adecuadas para el proceso de MF, ya que mostraron 100% de transmisión de la Toxina Diftérica, ausencia de restos celulares y flujo promedio de filtrado de 9.16 L/m2h. Así mismo, se seleccionaron las membranas tipo cassettes, formato Omega, porosidad 10 y 30 kDa, como las adecuadas para el proceso de UF, ya que mostraron 100% de recuperación de la toxina, ausencia de toxina en el filtrado y adecuados flujos de filtrado (97,5 y 125,9 L/m2h, respectivamente), Estos resultaron permitieron dimensionar, considerando las variables a utilizar en la producción industrial (Volumen 650 a 950 Litros, Tiempo de Procesos, 3 a 5 horas), el área de filtración de los equipos de MF y UF a adquirir, estimados en 20m2 y 5m2, respectivamente.

Palabras clave: Toxina diftérica, separación celular, microfiltración, concentración de proteínas, ultrafiltración.

Microfiltration and ultrafiltration sistems dimension for using in Difteria Toxin production in the Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”

ABSTRACT

Tangential Flow Filtration (TFF) technology was evaluated to process diphtheria toxin which is produced by Cory ne - bacterium diphtheriae bacterium. Microfiltration (MF) is used to retain cells while allowing passage of the toxin to the filtrate stream. The filtrate is collected and further pro - cessed by Ultrafiltration (UF) to concentrate the toxin and to maximize the wash of small species by a Diafiltration step. Both, MF and UF processes were evaluated to specify the filters and corresponding critical process parameters to scale-up the application. As part of the evaluation, flow rate, processing time, yield and product attributes were characterized. The cell harvest containing the diphtheria toxin was processed using a laboratory scale TFF system designed to product the TFF effect. The evaluation demonstrated that a cassette in medium screen format and membrane with 0.2 μm pore is the right selection for the MF step. It showed 100% of toxin transmission without the presence of cellular debris and average process flux of 9.16 L/m2h. The UF step was conducted using the same laboratory equipment with cassettes in medium screen format with pores of 10 and 30 kD. It showed 100% retention of the toxin with a process flux of 97,5 and 125,9 L/m2h, respectively. These results were used to scale-up the application to process the industrial volume of 650 a 950 liters between 3 to 5 hours of processing time. Membrane area sizing of MF and UF to be acquired is estimated in 20 m2 and 5m2, respectively.

Key words: Diphtheria toxin, cell separation, microfiltration, protein concentration, ultrafiltration.

Recibido: 30 de enero de 2009 / Aprobado: 24 de marzo de 2011

INTRODUCCIÓN

La Toxina diftérica es una proteína de Peso Molecular de 62 KDaltons, la cual es producida por la bacteria Cory nebacterium diphtheriae, causante de la difteria. Su toxicidad puede ser inhibida agregando formaldehído al cultivo sin destruir la estructura de la proteína y así obtener el Toxoide Diftérico (1), a través de una reacción inicial, completamente reversible, con las moléculas de las proteínas presentes en la solución, mediante un ataque nucleofílico a los grupos e-amino de la lisina (2). El toxoide diftérico, una vez purificado, es utilizado como antígeno para la formulación de la Vacuna Combinada DPT (Toxoide Diftérico, Vacuna Pertussis y Toxoide Tetánico), producida en el Instituto Nacional de Higiene “Rafael Ran gel” (INHRR) (3). Con el fin de incrementar la capacidad de producción, actualizar la tecnología e incursionar en nuevos mer cados, el INHRR está construyendo una nueva planta para la producción de Vacunas Simples y Combinadas inactivadas en base a la Vacuna DPT, con una capacidad de producción estimada en 42.000.000 de dosis anua les de Toxoide Diftérico.

Esto implica un aumento significativo en la producción, un cambio de tecnología y por ende una selección de los equipos a utilizar para la separación celular y concentración de la proteína, a objeto de dimensionar el equipamiento adecuado cónsono con los criterios de calidad internacionales que rigen la producción de Biológicos. Para la obtención de la Toxina diftérica, es necesario realizar dos procesos consecutivos posteriores al proceso de producción en fermentadores: el primer proceso consiste en la eliminación de los restos de bacterias producto de la lisis celular en el cultivo a través de un proceso denominado MF y en el segundo proceso, consiste en la eliminación de proteínas de bajo peso molecular y concentración de la toxina diftérica, a través de un proceso denominado UF (4). En este sentido, se realizaron pruebas piloto utilizando diferentes formatos de membranas elaboradas con Polyetersulfona (PES), con el fin de determinar el flujo y tiempo de proceso, rendimiento y características del producto obtenido y de esta manera dimensionar el área de filtración de los equipos para la realización de los procesos de MF y UF de la Toxina diftérica, a ser adquiridos para la Nueva Planta de Producción de Vacunas del INHRR.

MATERIALES Y MÉTODOS

Toxina Diftérica:

Se utilizó la cepa liofilizada Park Williams, Toronto No 8, de la bacteria Corynebacterium diphtheriae, para la producción de la Toxina diftérica siguiendo los procedimientos descritos por Luciani (4). Se utilizaron los sublotes 10/06 y 12/06 para las pruebas de MF y el filtrado obtenido, se utilizó para las pruebas de UF.

Concentración de la Toxina

La concentración de Toxina diftérica se determinó utilizando la técnica de Floculación (5), la cual se expresa en Lf (Limite floculante) por ml, (Lf/ml), donde el valor de Lf se define como la cantidad de Toxina que al combinarse con una unidad de Antitoxina produce una mezcla de proporciones óptimas para la floculación o formación de un complejo antígeno-anticuerpo, el cual precipita y puede verse a simple vista o magnificándolo a través de una lupa convencional.

Transmisión de Células al Filtrado

La presencia de células en los procesos de filtración fue evaluada observando las muestras en un microscopio óptico a 100x. Es importante señalar, que esta prueba no fue realizada para determinar pureza del cultivo sino transmisión de células a través de las membranas.

Presencia de la Toxina

La presencia de la Toxina obtenida a partir del filtrado recuperado durante el proceso de UF se determinó realizando Electroforesis en Geles de SDS-PAGE en fase de gradiente de gel 8-25 y tinción de plata (6). Se colocaron 50ug/ul de proteína por bolsillo. Como control se utilizó una muestra del lote 134 Toxoide Diftérico Purificado (TDp-134).

Pureza de la Toxina

La pureza de la Toxina obtenida del proceso de UF se determinó según la Técnica de Kjeldahl (7) para la determinación de Nitrógeno Proteico Total. Como control se utilizó una muestra del TDp-134. JO.

Pruebas de MF y UF

Las pruebas de MF y UF se realizaron en un equipo de laboratorio Centramate, suministrado por la empresa Pall Corporation, compatible con todos los formatos de membranas de las principales firmas comerciales del mercado, el cual es diseñado y construido para producir el efecto de FFT en membranas, formato tipo cassettes, con un área de filtración de 0.1 m2 por cassette. Se seleccionaron membranas nuevas de diferentes formatos y porosidades de la firma Pall, en virtud que no se tiene experiencia en Latinoamérica en el uso de estas membranas para la producción de toxina diftérica, siguiendo las condiciones de trabajo que se especifican en la tabla 1. Para realizar cada prueba de MF se tomaron 6 Litros del cultivo obtenido directamente del proceso de producción de la toxina diftérica a una concentración de 90 Lf/ml, y a partir del sobrenadante obtenido en ésta prueba, se tomaron 4 litros para la realización de las pruebas de UF a una concentración de toxina diftérica de 85 Lf/ml.

Para la realización de las pruebas de MF y UF, se ensambló un sistema como se observa en la figura 1. Se colocó el producto a filtrar en el envase correspondiente y por medio de una bomba peristáltica, se hizo pasar dicho producto a través de la unidad de filtración, donde se instalaron los diferentes formatos de los filtros a probar. Por la línea de producto filtrado, debe pasar el producto que ha atravesado el filtro (transmisión) y por la Línea de Producto Retenido debe retornar al envase inicial, el producto que no pudo ser filtrado. La Presión de Entrada (PE) se estableció con el manómetro instalado en la línea de alimentación, entre la bomba y el módulo del filtro. La presión de Retorno (PR) se estableció con el manómetro instalado en la Línea de Producto Retenido, entre el filtro y la válvula de retorno. La Diferencia de Presión (DP) es la resta entre PE y PR. La Presión de Filtrado (PF) se estableció con el manómetro instalado en la Línea de Producto Filtrado, entre el filtro y la válvula de filtrado. La Presión Transmembrana (PTM) se estimó como el resultado obtenido al promediar los valores de las PE y PR y restarlo al valor obtenido en el manómetro ubicado en la Línea de Filtrado. El flujo del filtrado se determinó dividiendo el valor obtenido en el flujómetro instalado en la Línea de Producto Filtrado, entre el área de filtración del cassette. El Flujo Promedio de Filtrado se calculó promediando los valores del flujo del filtrado obtenidos durante el proceso de filtración.

Las pruebas a realizar consistieron en determinar el efecto del tiempo y de la PTM sobre el flujo de proceso, para lo cual se recirculó todo el sistema, colocándose las Líneas de Retorno de Productos y de Filtrado de Producto en el Envase de Producto a Filtrar, estableciéndose las condiciones según lo indica cada ensayo. Posteriormente y con el valor de la PTM establecido, se realizó el efecto de la concentración del Producto a Filtrar sobre el flujo de proceso, lo que constituye el proceso de filtración de la Toxina Diftérica.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Microfiltración

Para la obtención de la proteína diftérica una vez culminado su proceso de producción en fermentadores, es necesario realizar en primer lugar, la eliminación de los restos de bacterias producto de la lisis celular en el cultivo. Este proceso puede realizarse de diferentes maneras: usando centrifugas de flujo continuo, filtración convencional con cartuchos o membranas, ó filtración usando la tecnología FFT. Esta última consiste en someter al cultivo a un proceso de filtración de forma tangencial (no de forma directa como en el caso de la filtración convencional), lo cual permite que las membranas no se colapsen por el taponamiento prematuro producto de la formación de depósitos celulares que ocurren durante la interacción con la membrana (polarización), debido al limitado espacio que hay en los canales por donde circula el fluido. Con la FFT es posible utilizar mayores cantidades de volúmenes de producto por área de filtración, con velocidades constantes de flujo de trabajo en el tiempo. La incorporación de esta tecnología permite realizar el proceso de separación celular de forma más limpia, segura y en menor tiempo, en virtud que es posible conectar el equipo con Tecnología de FFT en un circuito cerrado con el fermentador y de esta manera minimizar los riesgos de contaminación del producto o del operario durante la manipulación del proceso, lo cual es una condición indispensable para el cumplimiento de las Buenas Prácticas de Manufactura en la producción de Biológicos (8).

Para la realización de las pruebas de MF, se seleccionaron las membranas Supor (rango de trabajo desde 0.1 hasta 1.2μm), fabricadas en PES, formatos Medium Screen (0.2 y 0.65 μm) y Suspended Screen (0.2 μm). Las membranas de polyetersulfona (PES) son membranas construidas con polímeros de PES pura. Este material permite eliminar partículas durante los procesos de filtración general y sus características hidrofílicas y de baja fijación de las proteínas las hacen especialmente apropiada para su uso en aplicaciones biomédicas (9). El formato MS permite el procesamiento de fluidos clarificados de mediana o baja viscosidad, en cambio el formato SS, permite el procesamiento de fluidos no clarificados como cosechas celulares provenientes de fermenta dores, así como también soluciones con detritos o partículas no solubles y de alta viscosidad. El efecto de suspendido se crea incorporando al diseño de construcción del cassette, un espaciador de poliofelina (180 μm), entre la malla de poliéster (Screen) y la membrana (9). Los resultados del efecto del tiempo sobre el flujo de proceso (ver gráfico 1), mostraron una disminución proporcional del flujo de proceso a medida que transcurrió el tiempo de corrida, para todos los formatos de membranas probados. Ello es debido a la polarización de la membrana, lo cual disminuyó progresivamente sus capacidades de filtración, siendo el formato SS 0.2 μm, el que mostró mejor comportamiento en el tiempo.

Por otra parte, a medida que se incrementó la PTM, desde 0.25 hasta 1.25 Bar (ver gráfico 2), se observaron leves incremento del Flujo de Proceso para las membranas formato MS y una leve disminución del Flujo de Proceso para la membrana SS. Este comportamiento reflejó el efecto de la polarización observado en el gráfico 1, pues a medida que aumenta la PTM, debería incrementarse el Flujo de Proceso. Se pudo establecer el rango de trabajo para el parámetro de la PTM, entre 0.8 y 1.0 Bar, ya que es donde se observaron valores altos y constantes en el Flujo de Proceso. Para realizar el procesos MF, se establecieron las condiciones de PTM y DP en un (1) Bar para el formato MS y, en 0.75 Bar y 0.5 Bar para el formato SS, respectivamente, a objeto de determinar cómo se afecta el Flujo de Proceso a medida que se va concentrando el producto en el Envase de Producto a filtrar, como consecuencia del retorno de las células al mismo. En el grafico 3, se puede observar que para los formatos MS, a medida que se va concentrado el producto a filtrar, su capacidad de filtración disminuye dramáticamente por la polarización de la membrana, llegando incluso a colapsarse casi de inmediato, por lo que para el formato MS 0.2 μm, se disminuyó la PTM hasta 0.5 Bar a fin de alcanzar la finalización del ensayo. Este efecto no se observó en el formato SS 0.2 μm, el cual disminuyó levemente su capacidad de filtración logrando alcanzar el factor de concentración de 20 veces fácilmente.

Los resultados obtenidos indicaron que el cassette, formato MS 0.65 μm, fue rechazado por su bajo flujo promedio de filtrado (9.82 L/m2h), poco nivel de clarificación y la presencia de restos celulares en el filtrado. Este comportamiento se atribuye a la alta densidad celular y presencia de componentes insolubles de fosfato y calcio en el cultivo, los cuales interaccionan con la membrana y se depositan, generando una elevada polarización y dificultando la filtración. Por otra parte, el cassette, formato SS 0.2 μm, aunque presentó el mejor flujo promedio de filtrado (35.72 L/m2h), también fue rechazado por la presencia de restos celulares en el filtrado y poco nivel de clarificación atribuible también a la alta densidad celular y la presencia de componentes insolubles. El cassette, formato MS 0,2 μm, mostró el mas limitado flujo promedio de filtrado (9.16 L/m2h), pero una excelente clarificación y ausencia de restos celulares en el mismo, indicando que desde el punto de vista de la porosidad y compatibilidad, cumple con las especificaciones requeridas, aunque ello implique que el tiempo de proceso sea razonablemente mas largo (5 horas), a fin de evitar el colapso del filtro. Todos los formatos de cassette mostraron un 100% de transmisión de Toxina Diftérica hacia el filtrado. Se realizó una prueba con el formato de Fibra Hueca, conocido como Microza, (datos no reportados) y también fue descartado al no poderse producir una dinámica de fluido operable. Esto ocurre cuando las características del fluido no son compatibles con el diseño modular-encapsulado de este formato. Estos resultados demostraron que la membrana, formato MS 0,2 μm, es la seleccionada para realizar el procedimiento de separación celular de la toxina diftérica. En este sentido y tomando en consideración los resultados obtenidos, se dimensionó el área de filtración para el equipo de MF de acuerdo a la siguiente formula:

Donde: Volumen total a procesar en la nueva planta de producción de difteria, considerando 50 L Inoculo, 500 L Medio Fermentador, 5 lavados a razón de 20 L cada uno 100 L, Total: 650 L. Tiempo de procesamiento deseado: 5 h. Flujo promedio de trabajo estimado por este estudio para la membrana, formato MS 0.2 μm: 9.16 L/m2h. Por lo tanto, el área de filtración calculada para el equipo de MF es de: 14.19 m2, tomando un factor de seguridad del 20% de área, quedaría: 17.30 m2. Entonces, y considerando que la máxima concentración posible a obtener de la toxina diftérica en Bioreactores es 120 Lf/ml, el equipo de MF a ser adquirido por el INHRR para realizar el proceso de separación celular de la Toxina Difteria, debe ser un modelo de sistema de MF diseñado y construido para un área máxima de filtración de 20.00 m2.

Ultrafiltración

Para la obtención de la proteína diftérica, una vez culminado el proceso de eliminación de los restos de bacterias producto de la lisis celular en el cultivo, es necesario concentrar y dializar el medio líquido que con - tiene la toxina, a fin de eliminar, en primer lugar la presencia de otras proteínas, en particular las de bajo peso molecular y en segundo lugar, realizar una primera etapa de purificación en la cual se sustituye el medio de cultivo por una solución amortiguadora estéril (8). Este proceso puede realizarse de diferentes maneras: usando filtración convencional con cartuchos o membranas, o filtración usando la tecnología FFT. Para la realización de las pruebas de UF, se seleccionaron las membranas Omega (rango de trabajo desde 1 kDa hasta 1000 kDa), fabricadas en PES, formato MS, diseñadas para fluidos clarificados de mediana o baja viscosidad y con porosidades de 10 y 30 kDa, considerando la relación de tres a cinco veces el Peso Molecular de la proteína a recuperar, la toxina diftérica, partiendo del filtrado obtenido en la prueba de Microfiltración satisfactoria realizada, el cual presentó una concentración de Toxina Diftérica de 85 Lf/ml. Los resultados del efecto del tiempo sobre el flujo de procesos (ver gráfico 4), mostraron un flujo de proceso estable durante el tiempo de corrida de 15 minutos para las dos membranas probadas. Por otra parte, a medida que se incrementó la PTM, desde 0.25 hasta 1.75 Bar (ver gráfico 5), se observaron incrementos significativos en el Flujo de Proceso para las dos membranas. Este comportamiento demostró que el medio liquido que contiene la toxina diftérica, no polarizó las membranas y permitieron el proceso de filtrado sin algún tipo de limitación, pues a medida que aumentó la PTM, aumentó proporcionalmente el Flujo de Proceso. En ambas pruebas se observó un mejor Flujo de Proceso para la membrana de 30 kDa. Para realizar el proceso UF, se establecieron las condiciones de PTM en 1.75 Bar y DP en 0.5 Bar, con el fin de determinar como se afecta el Flujo de Proceso a medida que se va concentrando la Toxina Diftérica en el Envase de Producto a filtrar, por consecuencia del retorno de la Toxina al mismo. En el gráfico 6, se pudo observar que ambas membranas disminuyeron levemente su capacidad de filtración a medida que se fue concentrando la toxina diftérica, sin generar ningún efecto de polarización y lográndose alcanzar, en ambos casos, hasta un factor de concentración de 20x.

Los resultados obtenidos indicaron que ambas membranas presentaron excelentes Flujos Promedio de Filtrado (10 kDa, 97,5 L/m2h y 30kDa, 125,9 L/m2h), 100% de recuperación de la toxina y no se detectó presencia de toxina diftérica en el filtrado. Se observó un aumento de 40% del Flujo Promedio de Filtrado con la membrana de 30 kDa y el producto retenido, la toxina diftérica, presentó una coloración más clara respecto al retenido obtenido con la membrana de 10 kDa, además de una pureza antigénica superior (ver tabla 2 y figura 2), indicando la potencialidad de la membrana de 30 kDa en la eliminación de residuos provenientes del medio de cultivo y de otras proteínas con pesos moleculares cercanos al de la toxina diftérica, confirmando los resultados obtenidos por Cardoso (11).

Estos resultados demostraron que ambas membranas pueden ser utilizadas para realizar el procedimiento de concentración y diafiltración de la toxina diftérica, sin embargo, para los cálculos del dimensionamiento del área de filtración del equipo de UF, se consideraron los resultados obtenidos en la membrana de 10 kDa, en virtud que este corte molecular es el estándar utilizado en la producción de difteria de otras Instituciones Interncionales similares (Instituto Finlay, Cuba e Instituto Butantan, Brasil). En este sentido y tomando en consideración los resultados obtenidos, se dimensionó el área de filtración para el equipo de UF de acuerdo a la formula 1, donde: Volumen total a procesar en la nueva planta de producción de difteria, considerando 650 L de MF y 15 lavados a razón de 20 L cada uno (300 L), Total: 950 L. Tiempo de procesamiento deseado: 3 h. Flujo promedio de trabajo estimado por este estudio para la membrana, formato MS 10 kDa: 97.5 L/m2 h. Por lo tanto, el área de filtración calculada para el equipo de UF es de: 3.24 m2, tomando un factor de seguridad del 20% de área, quedaría: 3.89 m2. Entonces, el equipo de UF a ser adquirido por el INHRR para realizar el proceso de concentración y diafiltración de la Toxina Difteria, debe ser un modelo de sistema de UF diseñado y construido para un área máxima de filtración de 5.00 m2. Con los resultados obtenidos en este trabajo y la experiencia de los actuales procesos de producción en vacunas similares desarrollados en los Institutos Finlay (Cuba) y Butantan (Brasil), se probaron las membranas específicas usadas por dichas instituciones, tanto en MF como en UF de otras firmas comerciales reconocidas, obteniéndose resultados similares a las membranas seleccionadas en este trabajo (datos no reportados), lo que permitió identificar los formatos específicos de todas las membranas de las firmas comerciales reconocidas, que son compatibles con la producción de la toxina diftérica elaborada en el INHRR, a objeto de disponer de diferentes opciones técnicas y económicas en el momento de adquirir dichas membranas.

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