HSP60 expression in experimental murine infections by Trypanosoma evansi

ABSTRACT

Heat shock protein induction has been related to organism defense in diverse kinds of infection. This investigation examines Hsp60 accumulation in Mus musculus infected ex - perimentally with Trypanosoma evansi isolated from horse. This parasite is the causal agent of the “derrengadera” in Venezuelan planes. Normal and immunosupressed (cyclophosphamide( 250 mg/kg).) NMRI mice (♂; 20 gr body weight) were intra-dermal inoculated with 1 trypomastigote/ gr body weight; control groups were injected with distillated water in the same conditions. Hsp60 accumulation was analyzed by Western blot with a monoclonal antibody in plasma samples obtained each four days post-inoculation. Parasitemia levels were also registered. We observed a differential accumulation of Hsp60, which correlates with pa - rasitemia and immune conditions of the host. These results suggest an immunological control of Hsp60 expression that depends on the physiological condition of the host and parasitemia.

Keywords: Trypanosoma evansi, Hsp60, cyclophospha - mide.

INTRODUCCIÓN

Trypanosoma evansi (Kinetoplastida: Tripanoso matidae) es un tripanosomatideo salivario que infecta ocho órdenes de mamíferos en América, Europa y Asia (1) y es el agente etiológico de la tripanosomosis equina en los Llanos venezolanos (2), importante patología que afecta al ganado equino utilizado en labores de ganadería bovina extensiva en nuestro país (3). La sintomatología de la “Derrengadera”, voz coloquial para tripanosomosis equina, comprende cuadros febriles y anémicos que generalmente son de desarrollo terminal (3,4).

Por su parte, las proteínas de choque térmico (Hsp por “Heat Shock Proteins”) son una clase de proteínas re lacionadas funcionalmente, cuya expresión se incrementa cuando las células están sometidas a diversos tipos de estrés (5). Las Hsp aparecen involucradas en la tolerancia y la citoprotección (6,7) y su participación ha sido investigada en la patogénesis, la prognosis y el tratamiento de diversas patologías; a pesar de lo que los mecanismos asociados no han sido determinados adecuadamente (8,9). Las Hsps se encuentran en formas, intracelular y extracelular (7). La expresión intracelular, ha sido relacionada con sus funciones en el plegamiento, estabilización, transporte, translocación y degradación proteica (10). Sin embargo, el origen y la función de la expresión extracelular aún debe ser investigado. Sin embargo, se estima que puede provenir de la liberación del contenido ce lular durante la necrosis y que debido a su detección en individuos normales, también pudiera estar vinculado a funciones regulatorias (11).

Como moléculas antigénicas, las Hsps extracelulares pueden estimular el sistema inmune, particularmente influenciando la respuesta inflamatoria, induciendo la producción de citoquinas e median do en la presentación de antígenos (7,11). La familia Hsp60 ha sido vinculada con mecanismos involucrados en la defensa molecular del hospedador frente a infecciones por Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia trachomatis, Toxoplasma gondii, Leishmania major, Trypanosoma cruzi y Tripanosoma brucei (13-15). En algunos casos, su inducción también ha sido asociada al cambio de condiciones ambientales durante el paso de un parásito desde hospedador mamífero al vector invertebrado (16). Sin embargo, el rol de las Hsps en la tripanosomosis equina se desconoce. En este trabajo se determina la acumulación de Hsp60 en Mus musculus inmunocompetentes e inmunoincompetentes, infectados experimentalmente con aislados venezolanos de Trypanosoma evansi de origen equino.

MATERIALES Y MÉTODOS

El material infectante para los experimentos, provino del aislado equino MEQH/VE/96/Mant de T. evansi (17). Ratones (♂) Balb-C inmunosuprimidos con ciclofosfamida (18), fueron inoculados con sangre del equino infectado naturalmente. Al cuantificarse niveles de parasitemia del orden de 104, los animales fueron desangrados por punción cardiaca y la sangre colectada se mezcló con EDTA, se cuantificó el número de parásitos y se preparó una solución madre de T. evansi en buffer fosfato glucosado. De acuerdo a lo establecido por Perrone-Carmona y col. (19) se seleccionaron ejemplares de Mus musculus (♀, NMRI, 20 gramos) del bioterio del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas que se mantuvieron en jaulas provistas de viruta de arroz, alimento concentrado y agua ad libitum. Los roedores fueron distribuidos en 4 grupos experimentales: 10 inmunocompetentes inoculados i.d. con 1 tripomastigote/gr. de peso ratón; 10 inmunoincompetentes inoculados i.d con 1 tripomastigote/gr. de peso ratón; 10 inmunoincopetentes inoculados i.p. con buffer fosfato glucosado; y 10 inmunocompetentes inoculados i.d. con buffer glucosado. Los ejemplares inmunoincompetentes fueron inoculados i.p. con 250 mg/kg ciclofosfamida (18).

La inyección se repitió cada 4 días, hasta la muerte de los ratones infectados. Los grupos control fueron inoculados con buffer fosfato glucosado en condiciones idénticas a los tratados. A partir de la vena caudal, interdiarimante y hasta la muerte de los ratones infectados se obtuvieron muestras de sangre (100μl); 5μl se emplearon en el cálculo de la parasitemia (20), el resto de la sangre (95μl) fue colectada en tubos heparinizados que se utilizaron en la determinación del hematocrito por el método estándar (PCV) y separación de plasma. Las muestras de plasma fueron separadas electroforéticamente por SDS-PAGE por duplicado (21) con cantidades iguales de proteínas (7μg). Un gel fue teñido con Coomassie Brilliant Blue G-250 que permite confirmar la equivalencia de las concentraciones cargadas en cada bolsillo y la adecuada preparación de la muestra y el otro transferido a una membrana de nitrocelulosa (0,45μm) (22), posteriormente se procedió a la inmunodetección con un anticuerpo policlonal de conejo anti-Hsp60 (1/1000, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, EEUU). Luego de lavados sucesivos, la membrana fue incubada con IgG de cabra anti-conejo acoplado a peroxidasa de rábano (1/5000, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, EEUU).

Las bandas inmunoreactivas fueron detectadas por un kit de detección de quimioluminiscencia (Pierce). Los inmunoblots fueron analizados en un densitómetro GS-800 (Bio-Rad) con el software Multi- Analyst Program. Una vez corroborada la normalidad de los datos, así como la independencia y la homogeneidad de varianza, se procedió con el Análisis de la Varianza de una cola (ANOVA) para cada una de las variables consideradas. Esta investigación se realizó cumpliendo con las normas establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por el Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (23).

RESULTADOS

Tanto la inmunosupresión como la infección parasitaria mostraron efecto sobre la supervivencia. El menor porcentaje se observó en el grupo inmunosuprimido e infectado con T. evansi, sin sobrevivientes a los 17 días post-inoculación (Fig 1). El ANOVA señaló diferencia significativa en la sobrevivencia en los grupos tratados respecto al grupo control (p < 0.05). La figura 2 muestra que el periodo prepatente de la parasitemia fue de 7 días en los animales inmunosuprimidos y de 11 días en los inmunocompetentes, con una tasa de incremento similar en ambos grupos. Los animales controles permanecieron negativos durante todo el ensayo.

El ANOVA señaló diferencia significativa de la parasitemia en los grupos infectados respecto al grupo control (p < 0.05). El análisis densitométrico de las bandas de reconocimiento de Hsp60 post-inoculación, mostró un patrón diferencial de acumulación del polipéptido, con disminución de la expresión en los grupos tratados. La menor expresión se observó en el grupo inmunosuprimido-infectado con T. evansi. Mientras que en el inmunocompetenteinfectado el día trece se observa un leve incremento (Figura 3).

El desarrollo de la anemia durante la infección fue analizado a través del cambio en el hematocrito (Figura 4). Paralelamente al incremento de parasitemia, la anemia aumentó progresivamente como se evidencia en el descenso de los valores de hematocrito en los grupos infectados. El ANOVA señaló una diferencia significativa en los grupos tratados respecto al grupo control (p < 0.05).

DISCUSIÓN

En este trabajo se presentan, por primera vez, observaciones experimentales de la expresión de HSP60 en la respuesta de defensa de un sistema murino ante dos situaciones de estrés, potenciales factores de riesgo de la homeostasis del sistema biológico como son infección parasitaria por T. evansi y supresión de la respuesta inmunológica celular por ciclofosfamida. En infecciones experimentales, la expresión de Hsp60 ha sido fuertemente vinculada a la presencia de células T (24) lo que sugiere un control inmunológico en la regulación de la expresión de estas proteínas. Las células T tienen la capacidad de identificar células del hospedador en presencia de estrés, por trauma, inflamación, infección o transformación (25).

En el caso particular de Hsp60, se ha evidenciado la existencia de células T Hsp60-específicas (26). En tal sentido, la posible alteración de la función de las células T por efecto de la ciclofosfamida debe ser considerada entre las posibles explicaciones de la menor acumulación de Hsp60 en individuos inmunosuprimidos encontrada en el presente trabajo. Estudios previos han reportado que la exposición a agentes alquilantes, como la ciclofosfamida, inhibe la transcripción y la traducción (27). La alteración de la maquinaria transcripcional como resultado del daño del DNA, podría vincularse al descenso en la expresión genética, incluyendo los genes de HSPs y particularmente de Hsp60 como ha sido descrito en otros sistemas biológicos (28). Específicamente, la alquilación del ADN y las proteínas por efecto de la ciclofosfamida podría inducir la formación de enlaces cruzados. Tales enlaces cruzados representan regiones del cromosoma, donde pueden ocurrir pausas o la paralización de la actividad de la polimerasa del ARN, afectando adversamente la transcripción y expresión de genes (28). Por otra parte, la respuesta celular el estrés proteotóxico está estrechamente relacionada con la expresión de Hsps (29). En este sentido, el inmunosupresor puede alterar la conformación de las proteínas directamente por su unión y la formación de enlaces cruzados proteína-ADN (28). El descenso en la expresión de las Hsp60 sugiere que la capacidad de las células de reparar los péptidos dañados o la síntesis correcta de proteínas también puede estar afectada.

La Hsp60 del hospedador como la del tripanosoma, en el caso de T. brucei, tienen alta similitud de secuencia, lo que sugiere que puede inducir auto-reconocimiento y formación de autoanticuerpos (15). Durante la infección, tanto el patógeno como el hospedador, responden con un aumento de expresión de las Hsps (12). Durante la infección experimental con T. bruceise genera respuesta inmune contra los epítopes de Hsp60 derivados del tripanosoma y un reconocimiento autoreactivo de los epítopes de la proteína del hospedador (15). Estos anticuerpos podrían funcionar como transportadores de Hsps que trasladarían péptidos inmunogénicos a células presentadoras de antígeno (29). En este sentido, tal cual ha sido descrito en infecciones experimentales por T. congolense (30), no se observó incremento estadísticamente significativo en la expresión del polipéptido protector en los grupos inmunocompetentes infectados con el parásito. No obstante, la variación en la acumulación de Hsp60 en relación con el incremento de la parasitemia podría vincularse a la  capacidad del hospedador para resistir un estrés sostenido por la presencia de T. evansi con el desarrollo de termotolerancia (5) o por la producción de autoanticuerpos como ocurre en el caso de T. brucei. Sin embargo, los efectos inmediatos en la acumulación de Hsp60 y su relación con la citoprotección previa quedan por determinarse. Adicionalmente, en todos los grupos tratados se observó disminución en el porcentaje de supervivencia siendo mayor en el grupo sometido a ambos tipos de estrés (T. evansi y ciclofosfamida). La disminución de la supervivencia está relacionada tanto con los efectos del parásito sobre el hospedador, que entre otros, incluye anemia severa (4, 32), así como con el efecto de la inmunosupresión. Asimismo, la disminución del hematocrito ha sido observada previamente en otras infecciones experimentales por T. evansi (33,34) caracterizadas también por la anemia severa. El entendimiento de los procesos relacionados con la termotolerancia mediada por la expresión de Hsps podría tener aplicaciones útiles en el aprovechamiento de los mecanismos endógenos de protección en tratamiento de la tripanosomosis equina por T. evansi.

AGRADECIMIENTO

El presente trabajo fue apoyado por Laboratorios Elmor de Venezuela.

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