CARACTERIZACIÓN DE AISLADOS DE ESCHERICHIA COLI O157:H7 EN CANALES DE BOVINOS Y PORCINOS MEDIANTE PCR.

Miguel Gallegos¹, Alberto Morales²*, Genoveva Álvarez ², Jesús Vásquez ³, Lilia Morales⁴, Irma Martínez ⁴ y Jesús Maldonado⁵

¹Facultad de Agricultura y Zootecnia, Universidad Juárez del Estado de Durango.

²Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) hasta 31 de diciembre del 2007, actualmente Consorcio Técnico del Noreste, A. C. UGRNL. Teléfono y Fax: 01 81 83674487 Ext. 132. Km 4.5 carretera a Reynosa, Guadalupe, N. L. México.

³Facultad de Ciencias Químicas, UJED.

⁴Facultad de Ciencias Biológicas, UANL.

⁵Laboratorio de Diagnóstico Molecular,Núcleo “Héctor Ochoa Zuleta”, Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”, Venezuela.*E-mail: alberto.morales@labmty-cfppnl.org.mx 

RESUMEN

Muchos de los brotes causados por Escherichia coli O157:H7 se han asociado al consumo de carne bovina mal cocida, pero también se ha reportado su presencia en la carne de otros animales domésticos. En México existe poca información sobre la presencia de este patógeno en canales de res y de cerdo. El objetivo de este estudio fue determinar la presencia de E. coli O157:H7 en canales de res y cerdo y su caracterización mediante PCR. De un total de 18 aislados, 12 fueron positivas por PCR para los genes rfbE y fliC que determinan el serotipo O157:H7. De estos 12, uno de canal de res y tres de canales de cerdo fueron positivos por PCR para los genes stx1, stx2 y eaeA, por lo que fueron considerados como enterohemorrágicos. Las diferencias encontradas en el número de canales positivas para los genes caracterizados no fueron estadísticamente significativas, y los resultados señalan que E. coli O157:H7 puede ser encontrada en ambos tipos de canal, representando un riesgo para la salud, por lo que se deben tomar medidas más estrictas de higiene y manejo para evitar que canales que no cumplan con el carácter de inocuidad lleguen a los consumidores finales.

Palabras clave:  Bovinos, cerdos, E. coli O157:H7, enterohemorrágica, caracterización molecular, PCR.

Characterization of Escherichia coli O157:H7 Isolates Obtained from Bovine and Porcine Carcasses.

ABSTRACT

Many Escherichia coli O157:H7 outbreaks have been associated to consumption of undercooked beef, but the presence has also been reported in the meat of other domestic animals. In Mexico, little information exists on the presence of this pathogen in bovine and pork carcasses. The objective of this study was to determine the presence and/or absence of E. coli serotype O157:H7 in bovine and pork carcasses and their characterization by means of PCR. Of 18 isolates, 12 were positive by PCR to rfbE and fliC genes, which determine O157:H7 serotype. Of these 12, one from bovine carcass and three of pork carcasses were positive by PCR to stx1, stx2 and eaeA genes, therefore, they were considered enterohemorrhagic strains. The differences found in the positive carcass number to any of the genes were not statistically significant. The results show that E. coli O157:H7 could be found in both carcasses types, representing a risk for the health, so strict hygienic and handling measures should be taken in order to avoid that carcasses which do not fulfill the food safety aspect might arrive to the final consumers.

Key words: Bovine and pork carcasses, E. coli O157:H7, enterohemorrhagic, molecular characterization, PCR.

Recibido: 22 / 02 / 2007. Aceptado: 08 / 03 / 2008.

INTRODUCCIÓN

Escherichia coli O157:H7 ha emergido como un patógeno transmitido por alimentos y es considerado de importancia en salud pública, ya que está implicado en brotes de colitis hemorrágica y posible aparición posterior del síndrome urémico hemolítico (SUH) [19]. Una característica de E. coli O157:H7 es el bajo número de células requeridas para desarrollar la enfermedad de 10 a 100 células [11] por lo que la no detección por los métodos tradicionales microbiológicos no es certeza ni sinónimo de seguridad del alimento. E. coli O157:H7 puede estar presente en una gran variedad de animales silvestres y domésticos entre los cuales se encuentran bovinos (Bos taurus-indicus), porcinos (Sus scrofa domestica) y ovinos (Ovis aries) [18], siendo principalmente los rumiantes y sus heces fecales un reservorio natural de este patógeno [17, 20]. Se ha reportado que la transmisión de E. coli O157:H7 a los humanos en forma directa o indirecta puede ser por contaminación de los alimentos a partir de material fecal, agua contaminada, y contacto con personas o animales enfermos [4]. Por otro lado, microorganismos patógenos para el humano como E. coli O157:H7, que habita naturalmente en el tracto digestivo del ganado bovino, puede eventualmente contaminar la canal durante el proceso de evisceración o en el manejo posterior de la misma [25]. Aunque el serotipo de E. coli O157:H7 es determinado por los genes rfbE y fliC que codifican respectivamente para la biosíntesis del lipopolisacárido O157 y la flagelina, lo que a su vez determina respectivamente los antígenos O y H, la patogenicidad se debe a la expresión de varios genes que codifican para factores de virulencia. Entre estos se encuentran los genes stx1 y stx2 que codifican para las verotoxinas 1 y 2, respectivamente, los cuales se encuentran en un bacteriófago integrado al cromosoma bacteriano y que han sido asociados al desarrollo del SUH, particularmente stx2 [21]. Otro de los genes de virulencia localizado en el locus LEE (locus de efusión en enterocitos) es el gen eaeA que codifica para la intimina y que es necesario para el proceso de la adherencia íntima a las células epiteliales del intestino humano [12, 20, 22]. En México existen algunos reportes de la presencia de E. coli O157:H7 en muestras comerciales de carne de res, pero no se define si la carne venía contaminada desde el matadero o se contaminó en el manejo posterior [6], y siendo México un país con una producción promedio en los últimos cinco años de 1.473.650 t de carne de bovino y de 1.050.311 t de carne de cerdo [24] y un volumen de exportación combinado de ambos tipos de carne de 38.677,2 t [23], es importante determinar la calidad sanitaria de la canal al momento de salir del matadero. El objetivo del presente estudio consistió en caracterizar cepas de E. coli del serotipo O157:H7 aisladas de canales de bovinos y porcinos en plantas procesadoras de productos cárnicos de la Comarca Lagunera, México.

MATERIALES Y MÉTODOS

Diseño del estudio

El estudio fue de tipo longitudinal prospectivo y el período comprendió de febrero a marzo del 2004. Se seleccionaron dos plantas procesadoras de productos cárnicos, una de cerdo (I) y una de bovino (II) de la Comarca Lagunera, México. Los muestreos se realizaron en dos fechas para cada planta, 20/02/2004 y 15/03/2004 para la planta I y 02/03/2004 y 24/03/2004 para la planta II. A partir de estos se obtuvieron los aislados de E. coli.

Obtención de las muestras

La toma y manejo de las muestras se realizó conforme a lo especificado por la Norma Oficial Mexicana NOM-109 SSA1-1994 y con modificaciones a lo propuesto por Gill y Jones [15]. Las canales se muestrearon inmediatamente a su arribo al área de inspección y sellado (15 y 10 minutos en promedio después del inicio del sacrificio del animal hasta la toma de las muestras, respectivamente para canal de bovino y cerdo). En cada planta procesadora se procedió a la selección de 15 canales al azar, para el análisis de superficies vivas, de las cuales se recolectaron las muestras con esponja estéril NASCO^®, Whirl-Pak, Speci-Sponge, B01324WA (5x10x1 cm) (Nasco EUA) en tres sitios diferentes: falda (sitio A), costado (sitio B) y cuello (sitio C), para un total de 45 muestras por planta. De las 15 muestras de cada sitio de la canal (A, B, C) se formaron tres grupos de cinco muestras cada uno, para tener nueve muestras compuestas por planta, lo que dio un tamaño final de 18 muestras compuestas.

Aislamiento y confirmación de E. coli O157:H7 en muestras compuestas

Cada muestra compuesta se pasó a enriquecimiento en caldo Reveal (NEOGEN^®, EUA) y se incubó durante 8 h a 42°C, luego de este tiempo se tomaron 120 µL y se depositaron sobre la placa de lectura del kit. Después de 15 minutos se realizaron las lecturas y de las muestras presuntivas se tomó una asada y se estrío en medio cromogénico CHROmagar^® O157 (CHROmagar, Francia). Las colonias características se confirmaron con pruebas bioquímicas utilizando el API^® 20 E (Biomereux, Francia) y el serotipo utilizando un kit de serología Difco™ E. coli Antiserum (DIFCO, EUA). En las muestras que se confirmó la presencia de E. coli O157:H7 se procedió a realizar la obtención de ADN para la caracterización molecular mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

Cepa de referencia, condiciones y medio de cultivo

La cepa de referencia de E. coli O157:H7 que se usó como control positivo en los ensayos de PCR fue proporcionada por el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) a través del Centro Nacional de Servicios de Constatación en Salud Animal (CENAPA), México. La cepa fue activada en caldo infusión cerebro corazón a 35°C por 24 h.

Extracción del ADN

Los aislados de E. coli O157:H7 se incubaron en caldo infusión cerebro corazón por 24 h a 37°C. Después de la incubación y a partir de este medio se tomó tres veces 1 mL y se centrifugó a 3000 rpm durante 1 min (Centrifuga Sigma 1-15K, Alemania) para formar una pastilla en tubos Eppendorf de 1,5 mL y hacer la extracción de ADN con el método CTAB [7] pero omitiendo el uso de polivinilpirrolidona y 2b-mercaptoetanol.

Reacciones de PCR

Las reacciones de PCR se realizaron utilizando los oligonucleótidos mencionados en la TABLA I. Primero se realizó una reacción para amplificar simultáneamente dos fragmentos correspondientes a los genes rfbE y fliC [5, 13]. En los aislados que resultaron positivos para los genes anteriores, se realizaron reacciones por separado para amplificar un fragmento en cada uno de los siguientes genes: stx1, stx2 y eaeA [1, 14]. Las reacciones de PCR se realizaron en volúmenes de 25 µL, utilizando 1 µL (25 pmoles) de cada uno de los oligonucleótidos, 2,5 µL de los dNTP´s (200 µM) (GIBCO-BRL), 0,5 µL de MgCl₂ (1,5 mM), 2,5 µL de buffer para PCR (10X) (200 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM KCl), 2,5 unidades de la enzima Taq-DNA polimerasa (Bioline) y 1 µL de ADN (100 ng). El control negativo de la PCR tenía los mismos ingredientes, excepto el ADN, sustituyéndose este volumen con agua miliQ estéril. La amplificación se llevó a cabo en un termociclador PCR Express (ThermoHybaid, Reino Unido) y las condiciones de corrida para los genes rfbE y fliC fueron de un ciclo de 1 min a 95°C, seguido de 35 ciclos de tres pasos: desnaturalización a 95°C por 30 s, alineamiento a 66°C por 30 s y una extensión a 72°C por 75 s, con una extensión final de 10 min a 72°C. Para los genes stx1 y stx2 se modificó el paso de alineamiento a 58°C durante 30 s. Para el gen eaeA se modificó el paso de alineamiento a 64°C por 30 s. Las demás temperaturas y tiempos fueron iguales. Los productos de PCR fueron visualizados en geles de agarosa al 1,5% teñidos con bromuro de etidio (0,5 µg mL^–1), y visualizados en un transiluminador de luz UV (Spectroline, EUA). Posteriormente fueron fotografiados con una cámara polaroid (película A667, EUA) adaptada con filtro para luz ultravioleta.

Prueba estadística

Se usó la prueba de Ji cuadrado [3] para probar si las diferencias observadas en el número de canales positivas al patógeno de cerdo y de bovino eran estadísticamente significativas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

De un total de 18 muestras (nueve de cerdo y nueve de res), seis de cerdo (66,66%) y seis de bovino (66,66%) fueron positivas por PCR para la presencia de E. coli serotipo O157:H7, demostrándose así que este patógeno puede estar presente en ambos tipos de canal (TABLA II y FIG. 1). E. coli O157:H7 se ha encontrado en una gran variedad de alimentos, tanto de origen vegetal como animal, pero se ha asociado particularmente a la carne del ganado bovino, ya que esta especie se ha considerado como un reservorio natural de este patógeno. Sin embargo existen reportes que mencionan su presencia en otras especies animales como cerdos, ovejas, caballos (Equs caballus), venados, perros (Canis familiaris) y aves [2, 8, 16]. En relación con la planta I, en su primera fecha de muestreo (20/02/2004) se encontró que, si bien dos aislados resultaron positivos para los genes que codifican para los antígenos O157 y H7, éstos no eran portadores de ninguno de los dos genes que codifican para las verotoxinas; sin embargo, en la segunda fecha de muestreo (15/03/2004), de cuatro aislados positivos para los genes rfbE y fliC, tres fueron positivos para los genes de las verotoxinas 1 y 2 y el de la intimina. Es importante mencionar que cada uno de estos tres aislados fueron encontrados en cada uno de los tres diferentes sitios de muestreo en la canal, es decir, uno en la cadera, otro en el costado y otro en el cuello, lo que plantea la posibilidad que se tratara de un mismo animal, o bien de animales diferentes pero procedentes de una misma granja o lugar y en la cual existe la presencia de E. coli O157:H7 enterohemorrágica.

Respecto a los seis aislados que fueron encontrados en la planta II y que amplificaron por PCR para los genes que codifican para los antígenos O157 y H7, cuatro fueron portadores del gen de la verotoxina 1, y de estos sólo uno fue portador del gen de verotoxina 2 y el de intimina, y fue obtenido del cuello del animal.

Si bien lo anterior señala el riesgo de encontrar a este patógeno en ambos tipos de canal y representa un riesgo para la salud, no necesariamente implica que el animal sea el portador, sino que pone de manifiesto la ineficiencia de las buenas prácticas higiénicas en el manejo de la canal, puesto que un animal sano puede portar el patógeno en su pelo, piel y tracto intestinal [2]; o bien la canal contaminada en el proceso de sacrificio contamine a otras canales debido a un deficiente proceso de evisceración. A pesar que el proceso de sacrificio del ganado bovino y porcino es diferente, las diferencias observadas entre el número de canales positivas de cerdo y bovino para cualquiera de los genes no fueron significativas estadísticamente (TABLA III), lo que sugiere la posibilidad de encontrar a E. coli O157:H7 enterohemorrágica indistintamente en ambos tipos de canal, sin embargo, estos datos deben considerarse con reserva, dado el tamaño de muestras analizadas a pesar que se tiene concordancia con otros autores [4] quienes mencionan la posibilidad que los cerdos sean hospederos biológicamente competentes para E. coli O157:H7 y otras cepas de E. coli verotoxigénicas.

En algunos países como Estados Unidos de Norteamérica, la presencia del serotipo O157:H7 en los alimentos, no importa si es o no verotoxigénica, es motivo de preocupación por el riesgo que ello implica en la salud de los consumidores. Por lo tanto, además de determinar la presencia de E. coli O157:H7 en los alimentos es muy importante caracterizarlos en relación con otros factores de patogenicidad. La importancia clínica que tiene E. coli O157:H7 como patógeno radica en el hecho que puede ser portadora de uno o ambos genes que codifican para las verotoxinas, así como el gen de la intimina lo que determina que la cepa sea considerada enterohemorrágica [19]. La FIG. 2 muestra los productos de PCR a partir del gen stx1 de aislados que fueron positivos para los genes rfbE y fliC. Se observa que no todos los aislados presentaron este gen, sólo siete de ellos, correspondiendo cuatro a aislados obtenidos a partir de canales de bovino y tres a partir de canales de cerdo. Puesto que los genes stx1 y stx2 se encuentran cada uno en un bacteriófago temperado lisogénico, los cuales integran su ADN al cromosoma de E. coli O157:H7 [26], se puede explicar porque algunas de las cepas de E. coli O157:H7 expresaron sólo una o ambas verotoxinas, lo cual ya ha sido documentado [22].

En otro estudio [10] sobre la presencia de E. coli O157:H7 en cerdos, se encontró además del genotipo O157:H7 portador de los genes stx1, stx2 y eaeA, la presencia del genotipo portador de stx1 y los genes de virulencia eaeA y hly, o bien, genotipos portadores de eaeA, stx1 y stx2, pero no con los cuatro genes stx1, stx2, eaeA y hly. Así mismo otros autores reportaron en canales de bovino, un aislado de E. coli O157:H7 que fue negativa por PCR para los genes stx pero positiva para los genes de virulencia ehx y eaeA [9]. De los aislados que fueron caracterizados como portadores del gen stx1, cuatro fueron portadores del gen stx2, siendo tres de los aislados obtenidos de canales de cerdo y uno de canal de bovino (FIG. 3). No obstante se ha reportado una mayor proporción de cepas portadoras del gen stx2 que del gen stx1 [9], en el presente trabajo no se encontró la misma proporción, pero sí hubo coincidencia con otros reportes [16] donde mencionan que la mayoría de las cepas portadoras del gen stx2, también lo son para el gen eaeA, ya que los cuatro aislados portadores del gen stx2 también fueron portadores del gen eaeA (FIG. 4).

CONCLUSIONES

Las canales de bovino y las de cerdo pueden ser portadoras de E. coli O157:H7, lo que refleja la habilidad de este patógeno para colonizar también a la especie porcina. Los resultados obtenidos en este trabajo a través de la PCR constituyen un aporte valioso en materia de inocuidad alimentaria y salud pública al demostrar la presencia de E. coli O157:H7 enterohemorrágica en estos tipos de alimentos. De gran utilidad resultó la PCR para determinar el grado de virulencia de los aislados ya que permitió identificar los que fueron portadores de los genes de virulencia verotoxinas 1 y 2 y del gen de la intimina, siendo además muy importante desde el punto de vista epidemiológico el hecho de haber encontrado cepas portadoras de los factores de virulencia por ser consideradas patógenas al humano. Debido a que no se obtuvieron muestras ambientales, ni de los trabajadores dentro de los mataderos, así como de las herramientas de corte que ellos utilizan, serán necesarios estudios posteriores para descartar la existencia de fuentes externas de contaminación, así como la posibilidad de contaminación cruzada al momento de la evisceración. De acuerdo con los resultados encontrados, se abre la posibilidad para realizar estudios más a fondo del destino que tendrían el tipo de cepas de E. coli O157:H7 sobre la incidencia de enfermedades transmitidas por los alimentos, o si bien, el proceso de cocción es suficiente para eliminar el riesgo de contaminación al momento del consumo de la carne contaminada con dicha bacteria.

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