Características del semen de trucha arcoiris de diferentes edades, bajo condiciones de cultivo en Mérida, Venezuela

Hilda Bastardo* Carlina Guedez y María León²

¹Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA Mérida). Mérida, Venezuela. *Correo electrónico: hbastardo@inia.gov.ve

²Universidad de los Andes. Mérida, Venezuela.

Resumen

La biología reproductiva de machos y hembras de trucha difiere en diferentes aspectos, entre ellos la edad de maduración; en los machos ocurre al año, mientras que en las hembras a los dos años. El objetivo fue estudiar algunas características del semen de las truchas en relación con la edad. Se utilizaron machos de dos, tres, cuatro y cinco años. De cada uno se tomó una muestra de diez ejemplares, se determinó peso corporal y algunas características macroscópicas y microscópicas del semen. El volumen del semen de las truchas de dos años de edad fue significativamente menor que el de tres, cuatro y cinco años. El espermatocrito de los ejemplares de dos y tres años fueron similares entre si y significativamente más altos que los de cinco años. Se encontró una relación lineal positiva entre el espermatocrito y la concentración de esperma con un r = 0,648. Los ejemplares de dos años de edad presentaron una concentración significativamente mayor que los de tres, cuatro y cinco años, la cual osciló entre 4,341 x 109 en los de cuatro años y 9,978 x 109 espermatozoides/mL en los de dos años de edad. Los espermatozoides con cabeza normal incrementaron desde la edad de dos años hasta cuatro, para descender abruptamente a la edad de cinco años. Las células espermáticas con características de cabeza amorfa fueron similarmente bajas en las truchas de dos, tres y cuatro años, mientras que las de cinco años presentaron un porcentaje más alto. Las células espermáticas con cabeza pequeña y cabeza alargada no presentaron diferencias significativas entre los diferentes grupos de edad.

Palabras claves: Trucha, semen, espermatozoides, reproducción.

Semen characteristics of the rainbow trout of different ages under culture conditions in Mirada, Venezuela

Summary

The female and male of the rainbow trout have different maturity age of the gonads; the female maturation is at two years old, while the mature age male is at one year old. The objective of this research was to study some semen characteristics of the rainbow trout related to age. We evaluated two, three, four, and five years old male trouts. A sample of ten trouts of different age were weighted and some macroscopic and microscopic semen characteristics were observed. The semen volume of the two year old trout was significantly smaller than that of three, four, and five year old trouts. Spermatocrit of the two and three year old trout were similar and significantly higher than the five year old trout. We observed a lineal relationship between spermatocrit and sperm concentration (r=0.648). Sperm concentration of the two year old trout were significantly higher than three, four, and five years old trouts (4.341 x 109 on four year old, and 9.978 x 109 spermatozoid/mL on two year old trout). Spermatozoids with normal head increased from two year old to four year old trout, and then declined in abrupt way on five year old trout. Spermatic cells with amorphous head were significantly higher on five year old trout, and the ones with small and elongated head did not show significant difference among the different age groups.

Key words: Trout, semen, sperm, reproduction.

Recibido:07/06/04           Aceptado:23/06/04

Introducción

La trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) es una especie utilizada en actividades de acuicultura en todo el mundo, por su facilidad para aceptar alimento artificial y adaptarse a cambios de temperatura. Su introducción a Venezuela se remonta al año 1934 con la importación de ovas embrionadas para poblar cuerpos de agua en el estado Mérida ubicados a alturas superiores a los 1.500 msnm (León, 1975). A partir del año 1959 se inició su explotación comercial con la creación de la truchicultura Moconoque (Bastardo y Alvarado, 1982).

La explotación comercial de este salmónido necesita de un suministro permanente de ovas embrionadas y/o alevines que aseguren la producción de la trucha ración (250 g). Para ello es necesario mantener un plantel de reproductores con una alta fertilidad que asegure la producción de huevos fértiles y alevines requeridos por este sistema productivo.

La biología reproductiva de machos y hembras de trucha difiere en diferentes aspectos, entre ellos la edad a la cual maduran sus gametos; en el caso de los machos ocurre al año de edad, mientras que las hembras maduran a los dos años. Igualmente, las hembras maduran una sola vez por año y los machos lo hacen varias veces durante un ciclo anual (Bastardo, 1999).

La espermatogénesis de los peces está relacionada con la estructura testicular, es diferente en aquellos con estructura tubular y los que presentan estructura lobular, por esta razón se distinguen diferentes patrones en salmónidos (lobular) y ciprinidos (tubular). En los salmónidos los dos principales eventos del ciclo testicular, espermatogenesis y espermiación, están temporalmente separados por un estadio de maduración de los espermatozoos, durante el cual estos sufren cambios fisiológicos. La iniciación de un nuevo ciclo de espermiación solo es posible cuando los espermatozoos han sido liberados desde los testículos, bien sea por un proceso normal o por reabsorción intratesticular; esto ilustra la independencia espacial de la espermatogenesis y la espermiación (Billard et al., 1982).

La estructura de los espermatozoos de los salmónidos, y de muchos peces teleósteos, difiere de la de los mamíferos. Ellos carecen de acrosoma, parte anterior de la cabeza, el cual hace contacto con el huevo libera lisina para disolver localmente la membrana del huevo favoreciendo la penetración y fertilización. El huevo de los salmónidos está rodeado por un corion particularmente fuerte, pero puede ser penetrado vía micropilo, poro a través del cual los espermatozoos nadan hasta alcanzar la membrana más delicada del huevo (Cohen, 1977).

Scott y Baynes (1980) indican que el semen de los salmónidos y de muchos otros animales es inmóvil dentro del testículo y en el semen no diluido, la actividad solo se inicia por dilución con agua, solución salina o fluido ovárico. Boitano y Omoto (1991) señalan que la movilidad del esperma de la trucha se inhibe por una alta concentración de potasio extracelular y puede ser activada por dilución de ella, lo cual sugiere regulación del potencial de la membrana. Estos autores demostraron que el esperma de la trucha también puede ser activada añadiendo cationes divalentes, aún en presencia de la concentración inhibitoria del potasio, esto se explica por la habilidad de los cationes de ocultar la superficie de la membrana y alterarla en una membrana sensorial de voltaje. El modelo sugerido por estos autores propone una membrana hiperpolarizada como el desencadenante de la activación del esperma y no el incremento del pH intracelular que si activa el esperma de los mamíferos y otros peces pero no el de las truchas.

Otro aspecto importante de la motilidad del esperma de los salmónidos es la brevedad de mantener la actividad después de haber sido diluido en un medio isotónico, en contraste con otros animales en los cuales el esperma mantiene su movilidad por al menos varias horas. Christen et al. (1987) explicaron las razones de la brevedad del movimiento estudiando la relación entre el metabolismo del esperma de la trucha y la activación de su motilidad bajo dilución. Encontraron que la motilidad no se inició cuando la dilución del medio contenía una elevada concentración de potasio, pero en una solución isotónica de cloruro de sodio el movimiento se inició inmediatamente y los espermatozoos nadaron vigorosamente. La motilidad disminuyó 15 segundos después de la dilución y el movimiento fue lento y en círculos; después de 20 a 30 segundos se inmovilizaron. Cuando al medio diluido se le agregó calcio el movimiento no paró abruptamente y solo lo hizo uno a dos minutos después. Los autores explican que la presencia de calcio permite que la concentración de ATP disminuya a muy bajo nivel y permanezca baja hasta cierto tiempo; ellos concluyeron que la máxima duración de la motilidad de los espermatozoos (dos minutos) se debió a una baja capacidad de fosforilización oxidativa mitocondrial.

Ciereszko y Dabrowski (1995) indican que la calidad del semen (motilidad y concentración) está influenciada por el contenido de ácido ascórbico en la dieta, una deficiencia reduce tanto la concentración como la movilidad de los espermatozoos, afectando la fertilidad de la trucha arcoiris.

Scott y Baynes (1980) señalan que el semen de las truchas presenta una alta concentración, la cual oscila entre 9 y 26 x 109 espermatozoos / mL. Billard et al. (1974) y Moccia y Munkittrick (1987) señalan que para obtener una optima tasa de fertilización, con un semen de buena calidad, se requiere aproximadamente, 1-2 x 105 espermatozoos por huevo. Conociendo estas características de las truchas se puede operar un criadero con pocos machos sin que afecte el potencial productivo del mismo.

El objetivo de la presente investigación fue estudiar algunas características macroscópicas y microscópicas del semen de las truchas en relación a cuatro grupos etarios.

Materiales y métodos

Esta investigación se realizó en el Campo Experimental Truchícola La Mucuy, perteneciente al INIA, ubicado en el Parque Nacional Sierra Nevada a 2.300 msnm, en Mérida, Venezuela, y en el Departamento de Bioanálisis de la Facultad de Farmacia de la Universidad de los Andes.

El agua utilizada es de origen glaciar y nace en la Sierra Nevada de Mérida a una altitud superior a los 4.000 msnm. Por transcurrir a través de un fuerte gradiente altitudinal se encuentra sobresaturada de oxígeno durante todo el año. La temperatura alcanza su máximo valor en el mes de mayo, a partir del cual desciende por debajo de 13°C y se mantiene con este valor hasta diciembre. La precipitación presenta un patrón bimodal con un máximo en abril (770 mm) y otro en noviembre (550 mm), mientras que el valor más bajo se encuentra en enero y febrero (35 mm).

Se utilizó el 10% de los machos maduros de una población de dos, tres, cuatro y cinco años de edad, compuesta cada una de ellas por 100 ejemplares. No se evaluaron los reproductores de 6 años por no disponer de una muestra representativa de machos maduros. Estos reproductores corresponden al plantel del Campo La Mucuy los cuales se utilizaron durante el pico de maduración correspondiente al año 2003 (Septiembre-Diciembre).

El semen se extrajo manualmente por suave presión de la zona abdominal. De cada grupo de edad se tomó una muestra de diez ejemplares, se determinó peso corporal y se determinaron algunas características macroscópicas y microscópicas por cada grupo. En el estudio macroscópico se determinó el volumen del semen utilizando un cilindro graduado de 5 a 50 mL. La licuefacción se estimó tomando una muestra de semen, la cual se dejó en reposo a temperatura ambiente, durante 60 minutos, y por observación directa se determinó la presencia de coágulos o grumos gelatinosos, tomándose el tiempo de aparición de los coágulos.

El aspecto del semen se determinó por observación macroscópica. El semen normal es homogéneo, cremoso y blanco lechoso.

La viscosidad se evaluó aspirando la muestra con una pipeta de 5 mL, luego se dejó caer y se observó el filamento. Normalmente el semen debe caer gota a gota o formar una filancia no mayor de 2 cm de longitud; cuando la filancia es mayor de 2 cm se considera anormal.

El pH se determinó dentro de la hora de extracción utilizando papel para pH graduado en décima de unidad (6.1 a 10).

Los parámetros evaluados a través del estudio microscópico fueron: movilidad, viabilidad, concentración, espermatocrito y citomorfología.

La movilidad se determinó colocando en una lamina portaobjeto 0,05 μl de la muestra, y sobre ella se colocó una laminilla de 22 x 22 mm. El preparado se observó al microscopio con lente de 100 X, eligiendo de 8 a 10 campos, prefiriendo la parte central de la lamina, nunca los bordes y una vez obtenido el campo se diferenciaron las categorías de movimiento contando los espermatozoides que las presentaron hasta llegar a contar 100. Los resultados se presentan en porcentaje. El movimiento se clasificó en 4 categorías:

A) movimiento progresivo lineal rápido;

B) movimiento progresivo lento;

C) movimiento in situ;

D) y inmóviles.

La viabilidad se determinó cuantificando los espermatozoos inmóviles, observándose cuantos estaban vivos y muertos. La proporción de espermatozoos vivos se estimó utilizando el principio de exclusión del colorante. La coloración que se empleó fue el Test de Eosina Y. Se mezclaron 0,05 μl de semen sobre una lamina portaobjeto con un volumen igual de solución de Eosina Y al 5%, se cubrió el preparado con una laminilla y se esperó de uno a dos minutos para luego observar al microscopio con 100 X. Se contaron los espermatozoos no coloreados como vivos y los coloreados como muertos, hasta un total de 100 células. Más del 50% de espermatozoos no coloreados fue considerado como normal.

La determinación de la concentración de espermatozoos se realizó utilizando el método por medio del cual se efectúan los recuentos de las células sanguíneas. Las células espermáticas se inmovilizaron utilizando un liquido diluyente compuesto por bicarbonato de sodio (5 g), formol (1ml) y agua destilada (100 mL).

Se realizó la dilución de acuerdo a la cantidad de espermatozoos observados en el examen preliminar. La dilución empleada fue 1:50 (20 μL de semen y 980 μL de diluyente), una vez realizada la dilución, se llenaron las dos cámaras del Hematimetro de Neuvauer (de 10 a 20 μL por cámara). Se cubrió con una laminilla y se dejó reposar durante 5 minutos. A través de la observación al microscopio con aumento de 100 X, se contaron solo los espermatozoos maduros, es decir los que presentaban cabeza y cola. Para ello, se ubicó el campo visual en el cuadrado central y cuando el número de espermatozoos en uno de los 25 cuadrados fue menor de 10 se contaron todos los espermatozoos presentes en el cuadrado central, es decir en los 25 cuadrados. Cuando el numero fue entre 10 a 40 se contaron 10 de los 25 cuadrados y cuando se observaron más de 40 se contaron 5 de los 25 cuadrados.

Para determinar la concentración (mL) se dividió la cantidad de espermatozoos por los factores de corrección que se indican en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Dilución y factores de corrección utilizados.
Dilución	Factores
1:10	10	4	2
1:20	5	2	1
1:50	2	0,8	0,4
No. de cuadrados contados	25	10	5
El resultado obtenido se multiplicó por 1.000.000

El espermatocrito se determinó llenando dos tubos capilares por cada grupo de edad. Los tubos se colocaron por diez minutos en la centrífuga para hematocrito y posteriormente se leyeron en el lector de hematocritos y se promediaron los valores de las dos muestras por cada grupo de edad.

La morfología se valoró por recuento diferencial de los tipos de espermatozoos normales y anormales. El estudio citomorfológico se realizó con un objetivo de 4100 X y se observaron por lo menos 100 espermatozoos en un extendido coloreado con Giemsa. Los espermatozoos se agruparon de la siguiente manera:

1. Espermatozoos normales.

2. Defectos de la cabeza: cabezas pequeñas, cabezas amorfas, cabezas alargadas, forma de pera (en ingles, tapering).

3. Defectos de cola.

Una muestra de semen se consideró con morfología normal cuando se encontró más de 30% de formas normales y anormal cuando se encontró menos de 30% de formas normales.

Las muestras se analizaron utilizando análisis de varianza de una sola vía, se utilizó la prueba de Scheffe para establecer las diferencias entre las medias (P<0,05).

Resultados y discusión

Los resultados de esta investigación indicaron que las características macroscópicas del semen de todos los grupos de edad presentaron un aspecto homogéneo y blanco lechoso; así mismo, la viscosidad fue normal en el 50% de las truchas de dos y tres años y aumentó en las de cuatro y cinco años de edad (70% y 90%, respectivamente). El tiempo de licuefacción fue bajo en las truchas de dos años de edad (39 minutos), mientras que en las de tres, cuatro y cinco años fue de 60 minutos.

La viabilidad fue similarmente alta en todos los grupos etarios; así mismo, el pH fue básico y osciló entre 8, en los de dos años, y 8,2 en los otros tres grupos de edad. Tampoco se observaron diferencias en los grupos de edad en cuanto a la inmovilidad. En promedio todos los grupos presentaron una inmovilidad de 16,28% con una desviación estándar de 11,45%.

En la Figura 1 se representa los grupos de edad con movimiento progresivo lineal (MPL). Se observa que las truchas de tres y cuatro años presentaron espermatozoos con un mayor MPL (superior de 80%) que las de dos y cinco años en las que el MPL se ubicó por debajo de 50%. Estos resultados indican que los espermatozoos de los machos más jóvenes y los más viejos disminuyen el MPL, lo cual podría afectar el éxito del encuentro óvulo-espermatozoos en las truchas de esos grupos de edad. Sin embargo, este efecto no fue estudiado en el presente trabajo.

Figura 1. Espermatozoos de trucha arcoiris con movimiento progresivo lineal (combinación de movimiento rápido con lento, MPL) en los grupos de edad de dos, tres, cuatro y cinco años, en el Campo Experimental Truchícola La Mucuy, Mérida, Venezuela.

El volumen del semen de las truchas de dos años de edad fue significativamente menor que el volumen del semen de los machos de tres, cuatro y cinco años (P<0,05), mientras que entre estas últimas edades no se encontraron diferencias (Cuadro 1). Bastardo (1992) encontró que los machos jóvenes (dos y tres años) presentaron un volumen de semen significativamente más bajo que los de cinco años. Esa investigación se realizó a lo largo de un ciclo reproductivo anual, evaluando los mismos reproductores, así un macho de cinco años presentó un volumen total de 113,10 mL

Los valores más bajos de espermatocrito se encontraron en el grupo de cinco años de edad (14,4%), observándose una clara tendencia a disminuir con el incremento de la edad de los machos. El análisis de varianza de una sola vía indicó que el porcentaje de células espermáticas de los ejemplares de dos y tres años de edad fueron similares entre si y significativamente más altos que los de cinco años, mientras que los de cuatro años no presentaron diferencias significativas con las otras edades (Cuadro 2). Se encontró una relación lineal positiva entre el espermatocrito y la concentración de esperma con un r = 0,648.

Cuadro 2. Peso, volumen, espermatocrito, concentración y viabilidad del semen de machos de trucha arcoiris en relación a cuatro grupos etarios, en el Campo Experimental Truchícola La Mucuy, Mérida Venezuela.
Edad, años	Peso, g	Volumen, mL	Espermatocrito, %	Concentración, millones/mL	% Viabilidad
2	495±73,4†	4,16±2,9	22,3±6,0	9.977,5±4.384	73,0±9,5
3	592±121,4	10,13±3,3	23,8±4,1	6.361,3±1.954	85,6±13,7
4	1.333±177,9	11,97±5,8	18,8±5,1	4.340,5±1.559	79,5±12,9
5	1.525±561,8	10,81±4,4	14,4±6,4	5.697,2±3.469	78,9±9,3
† Medias ± DE.

Las truchas de dos años de edad presentaron una concentración de espermatozoides significativamente mayor que las de tres, cuatro y cinco años (P<0,05). Se encontró que la concentración osciló entre 4,341 x 109 en los de cuatro años y 9,978 x 109 espermatozoides/mL en los de dos años de edad (Cuadro 2). Scott y Baynes (1980) informan sobre el número de espermatozoos (mL) reportados por diferentes autores, observándose una gran variación entre los valores encontrados por ellos y aun por un mismo autor, estos oscilaron entre 9 y 26 x 109 espermatozoos/mL. El valor mínimo encontrado por estos autores corresponde al valor máximo observado en el presente trabajo; estas diferencias pueden deberse a la edad de las truchas utilizadas en ambos trabajos.

Liley et al. (2002) encontraron resultados similares a los de este trabajo en relación a la concentración del esperma. Estos autores investigaron esta variable en truchas precoces y adultas y encontraron que los machos jóvenes presentaron una concentración mayor que los adultos (uno y tres años, respectivamente). Iguales resultados fueron informados por VladiĆ et al. (2002) en estudios realizados en el salmón, pariente cercano de las truchas, quienes encontraron que los machos parr (jóvenes) presentaron valores más altos de espermatocrito que los machos adultos, mientras que la longevidad de estos peces no estuvo relacionada con la morfología de las células espermáticas.

Ciereszko y Dabrowski (1995) encontraron una disminución en la fertilidad de esta especie relacionada con la calidad del semen. Esto se observó en machos alimentados con una dieta deficiente en ácido ascórbico, por lo que estos autores indican que la vitamina C es importante para la reproducción de los machos de este salmónido.

Finalmente, en el Cuadro 2 se observa que la viabilidad de todos los grupos de edad fue igualmente alta, no encontrándose diferencias significativas entre ellas (P<0,05).

La Figura 2 muestra la morfología de las células espermáticas de las truchas de diferentes edades, se observa que los espermatozoides que presentaron cabeza normal incrementó desde la edad de dos años hasta cuatro, para descender abruptamente a la edad de cinco años. El análisis de varianza demostró diferencias significativas entre las de dos años y cuatro y las de tres y cinco años, siendo similares las de dos y tres años. Las células espermáticas con características de cabeza amorfa fueron similarmente bajas en las truchas de dos, tres y cuatro años, mientras que las de cinco años presentaron un porcentaje más alto, observándose diferencias significativas con los otros tres grupos de edad. Las células espermáticas con cabeza pequeña y cabeza alargada no presentaron diferencias significativas entre los diferentes grupos de edad.

Figura. 2. Citomorfología del semen de la trucha arcoiris en cuatro grupos etarios, en el Campo Experimental Truchícola, La Mucuy, en Mérida Venezuela.

En general, se observaron diferencias significativas en el grupo de cinco años en cuanto a la calidad del semen, así el espermatocrito y la concentración fueron más bajos en este grupo etario. Mientras, que la citomorfología anormal, particularmente cabeza amorfa, incrementó significativamente a esa edad.

Estos resultados pudieran indicar que los machos de cinco años de edad constituyen un alto costo dentro del sistema productivo por el efecto negativo que pudieran tener estas características del semen en la fertilidad de las truchas; sin embargo, en este trabajo no se realizaron pruebas de fertilidad por lo que la presenta investigación no sustenta estas observaciones.

Conclusiones

• Las características macroscópicas, entre ellas, aspecto, viscosidad y licuefacción del semen de las truchas no están influenciadas por la edad.

• Las características microscópicas, entre ellas, motilidad, espermatocrito, concentración y citomorfología están influenciadas por la edad de las truchas.

• Los resultados de esta investigación indican que desde el punto de vista productivo es más beneficioso mantener los machos de trucha hasta los cuatro años de edad, ya que ejemplares más viejos presentan un descenso en la calidad del semen.

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