Cultivo de tejidos y transformación genética de café Cultivo de tejidos y transformación genética de café

Rafael Fernández ⁽¹⁾, Zoraya De Guglielmo ⁽²⁾, Andrea Menéndez ⁽³⁾

⁽¹⁾ Universidad de Carabobo (Departamento de Biología). rafaelfer2103@hotmail.com

⁽²⁾ Instituto de Oncología y Hematológica-UCV. zdegugli@gmail.com

⁽³⁾ Instituto de Biología Experimental (IBE-UCV). amenendez@cantv.net

RESUMEN

Se presenta una revisión sobre el cultivo del café, uno de los más importantes en el mundo, resaltando las técnicas de cultivo in vitro e ingeniería genética dirigidas a su mejoramiento, con las cuales se persigue obtener cultivares altamente productivos y resistentes a estrés biótico (enfermedades y plagas) o abiótico. En este sentido, se ha logrado ha logrado establecer eficientes sistemas de regeneración in vitro, particularmente por embriogénesis somática indirecta a partir de secciones foliares, destacando la ventaja potencial de la embriogénesis somática secundaria en la regeneración de plantas transgénicas. La transformación genética se realliza tanto por métodos directos como indirectos, permitiendo ya en campo la obtención de plantas transformadas con el gen cry, el cual confiriere resistencia al ataque del minador de la hoja. Este es un trabajo de apoyo a fitomejoradores en café, pudiendo ser más eficaces en el logro de nuevos cultivares con características agronómicamente importantes.

Palabras clave: Café; transformación genética; cultivo in vitro

Tissue culture and genetic transformation of coffee

ABSTRACT

Review about coffee, one of the most important plants on the world, highlighting the in vitro culture techniques and genetic engineering aimed at its improvement, in order to obtain highly productive cultivars resistant to biotic (diseases and pests) or abiotic stress. In this sense, it has managed to establish efficient in vitro regeneration systems, particularly for indirect somatic embryogenesis from leaf sections, emphasize the potential advantage of secondary somatic embryogenesis on the regeneration of transgenic plants. Genetic transformation has been achieved by both direct and indirect methods, to stand out in field the production of plants transformed with the cry gene, which confers resistance to attack leaf miner. In this context, this work will be of great help to breeders in coffee, may well be more effective in achieving new cultivars with agronomically important characteristics.

Key words: Coffee; genetic transformation; in vitro cultur

INTRODUCCIÓN

Café es el nombre común de las semillas provenientes de los arbustos del género Coffea, de la Familia de las Rubiáceas. De la treintena de especies que comprende este Género, solo tres son económicamente importantes: Coffea arabica (tetraploide 2n=44), la cual produce aproximadamente el 90% del café comercializado en el mundo, seguido por Coffea canephora (café robusta, diploide 2n=22) y Coffea liberica (diploide 2n=22), que producen un aproximado de 9% y 1% respectivamente (Ascanio, 1994; Jaramillo, 1996).

Su cultivo es de gran importancia agronómica y comercial, por lo que ha sido blanco de mejoramiento mediante ingeniería genética. Este mejoramiento por medio de técnicas moleculares ha sido combinado con el mejoramiento tradicional (basado en cruzamientos) para facilitar la obtención de variedades mejoradas, debido a que esta planta es semi perenne y tomaría más de 30 años mediante el mejoramiento clásico obtener cultivares tolerantes a estrés biótico y abiótico que la afectan (Etienne, et. al, 2002).

Considerando la importancia histórica y económica del café, así como su potencial futuro como fuente de ingresos para Venezuela, en este trabajo se exponen aspectos relacionados al cultivo y la aplicación de técnicas de transformación genética a esta planta, con el fin de apoyar futuras investigaciones en el campo.

MÉTODO

Se refiere a una investigación de tipo documental fundamentada en una extensa revisión bibliográfica sobre el tema, para lo cual se seleccionaron revistas científicas especializadas nacionales e internacionales considerando como criterios para su selección los puntos a tratar y los autores e investigadores reconocidos en el área. La información histórica y estadística que se presenta se obtuvo de la revisión y procesamiento de la información en páginas Web de portales oficiales de la República Bolivariana de Venezuela.

RESULTADOS

El café constituye la segunda mercancía comercializada en el mundo, después del petróleo. El mayor productor es Brasil, especialmente el estado de Sao Paulo, donde se sitúa el primer puerto cafetalero del mundo, el puerto de Santos, seguido por Colombia y Vietnam, este último el productor más importante del café robusta.

Según Purseglove (1968), el café es originario del continente africano, la planta fue llevada por mercaderes a la península arábiga en fechas no conocidas, probablemente en el siglo XIII o el siglo XV d C (Sondahl y Lauritis, 1992; Coffee Universe -World of Coffee, 2002). La bebida revistió tal importancia que se abrieron establecimientos públicos denominados “cafés” para su consumo. El primer “café” fue abierto en Constantinopla (Estambul actual), alrededor de 1475 y en 1615 llega por primera vez al Continente Europeo, específicamente a Venecia, por intermedio de los mercaderes venecianos que visitaban el Medio Oriente. Hacia 1650, en Roma, el Papa Clemente VIII permite su consumo en Italia (Hill, 1965; Coffee Universe -World of Coffee, 2002).

Se cree que el café llegó a Norte América en 1607, cuando el Capitán John Smith establece la Colonia de Virginia en Jamestown. En 1723, el joven oficial naval francés Gabriel Manthieu de Clieu trasladó plántulas de cafeto desde París hasta la isla de Martinica. Desde esta isla, el cultivo fue llevado por misioneros Jesuitas franceses al resto de las Antillas y, de allí, a América Central y del Sur, a mediados del siglo XVIII. A Brasil, el café llega desde la Guyana Francesa en 1720 y a Colombia, es introducido desde las Antillas Francesas en 1808 (Coffee History, 2002; Coffee Universe/Coffee Universe-ity/A brief History of Coffee, 2002). El cafeto llega a Venezuela en 1730, proveniente de Cayena y es el misionero Jesuita Gumilla quien establece plantaciones en las misiones de su Orden, en las riberas del río Orinoco. Para 1783 se lleva al Valle de Caracas, específicamente en lo que hoy se conoce como Chacao, estableciéndose las famosas haciendas Chacaeñas: “Blandín”, “San Felipe” y “La Floresta”, pertenecientes a Bartolomé Blandín (MAT, 1994). Posteriormente, en 1798, se llevó el cafeto a las Vegas, Estado Táchira, donde el cultivo se dispersa por los Andes y el resto del país (op cit, 1994; Jaramillo, 1996; Coffee Universe/World of Coffee, 2002). El café fue el primer producto de exportación desde 1820 hasta 1925, cuando fue desplazado por el petróleo; no obstante, siguió siendo el principal rubro agrícola de exportación y segundo en producción después del maíz (Bustillo, 1998; Briceño, 1999), existiendo varios cultivares en Venezuela (ver Cuadro 1).

Cuadro 1. Principales cultivares de café presentes en Venezuela Cultivar

La superficie cultivada de café, por Entidad Federal, se distribuye de la siguiente manera: Lara (40.416 ha), Táchira (32.665 ha), Portuguesa (33.327 ha), Mérida (28.648 ha) y Trujillo (28.220 ha); en cuanto al rendimiento (Kg/ha), el primer lugar es del Estado Lara (544), seguido por Trujillo (436), mientras, que Táchira rinde 351 Kg/ha y Mérida 343 Kg/ha (MAT, 2008; OCEI, 2000).

Composición del grano y ecología del café

El grano de café crudo contiene aproximadamente 6% de ácidos cafeicos y clorogénicos, ácido tánico, trigonelina (que se transforma en ácido nicotínico durante el proceso de torrefacción), 8% de azúcares diversos, alrededor de 15% de lípidos y 1 a 2% de cafeína, según las especies (Cartay y Ablan, 1997).

Según el nivel de cafeína (% de peso seco), el café se ha organizado en tres grupos: alto (1.61-2,2%), representado por C. canephora; medio (0.74-1.09%), representado por C. arabica, C. dewevrei, C. racemosa; y bajo (0.57-0.23%), que incluye las especies C. eugenoides, C. liberica y C. salvatrix (Mazzaferaet, et. al., 1997).

La rentabilidad del cultivo de café depende de una serie de factores agroclimáticos: macroclima, microclima y topoclima. El primero está determinado por la altitud, latitud, precipitación y temperatura, mientras que el segundo se refiere a los factores que inciden directamente en la plantación y, por último, el topoclima se relaciona con la configuración del terreno (plano, inclinado, cóncavo, convexo, etc) (Jaramillo, 1996).

El café se cultiva en lugares con una precipitación que varía desde los 750 mm anuales (7.500 m3/ha) hasta 3000 mm (30.000 m3/ ha), con altitudes de 1300 a 1700 metros y temperatura media anual de 16ºC a 22ºC. El cultivo requiere una lluvia (o riego) abundante y uniformemente distribuida desde comienzos de la floración hasta finales del verano para favorecer el desarrollo del fruto y de la madera. Después es conveniente un período de sequía que induzca la floración del año siguiente (Agroinformación, 2004).

La planta del café se propaga en gran escala por medio de semillas, o vegetativamente por medio de injertos o estacas que prosperan en un suelo profundo, bien drenado, que no sea ni demasiado ligero, ni demasiado pesado. Los limos volcánicos son ideales. La reacción del suelo debe ser más bien ácida. Además, los diferentes niveles de clorofilas, carotenoides, alcaloides, etc., se ven modificados en función de las temperaturas, de la humedad y de la intensidad lumínica (Damatta, et. al., 1997). La producción es mayor a plena exposición solar, siempre y cuando se lleven a cabo correctas prácticas culturales (emplear otras plantas que proporcionen sombra parcial, con el fin de atenuar la intensa evaporación de agua del suelo).

Con el fin de controlar la incidencia del gran número de enfermedades y plagas que afectan al café, es necesario implementar un programa de control riguroso de tipo preventivo, químico, biológico y biotecnológico. El control preventivo representa esencialmente a las prácticas culturales, el químico representa la aplicación de pesticidas (insecticidas, nematicidas y fungicidas), mientras que el biológico se fundamenta en la utilización de competidores o patógenos específicos de las plagas o agentes causales de las enfermedades. El recurso biotecnológico incluye las técnicas de cultivo de tejidos y la transformación genética, permitiendo obtener cultivares tolerantes o resistentes a diferentes patógenos o plagas, como la roya y o el minador de la hoja del café respectivamente.

Cultivo de tejidos en café

A diferencia de las técnicas de propagación tradicional, las de cultivo de tejidos permiten la micropropagación clonal de un determinado genotipo vegetal en un tiempo relativamente corto, útil en programas de mejoramiento genético convencional o por transformación genética. Estas técnicas también son poderosas herramientas para el estudio fisiológicos, de crecimiento y desarrollo, morfogénesis, criopreservación, producción de semillas artificiales, producción industrial de diferentes compuestos químicos, preservación del germoplasma de genotipos élite o la producción de metabolitos secundarios (Menéndez-Yuffá y García, 1998).

El cultivo in vitro de distintas especies de cafeto está registrado a partir de tejidos aislados de todos los órganos, con excepción de la raíz (Baumann y Neuenschwander, 1990) (ver Cuadro 2).

Cuadro 2. Explantes utilizados para el cultivo in vitro de Coffea spp

La propagación in vitro del café puede ser por organogénesis (microesquejes) o embriogénesis somática (Dublin, 1984; García y Rafael, 1989), siendo la última la principal vía de regeneración, ya que presenta la mayor tasa de multiplicación (Baumann y Neuenschwander, 1990); la cual se establecido a partir de distintos explantes, tales como secciones de tallo, hojas, ovarios y estambres (Dublin, 1981).

El primero en establecer exitosamente la regeneración in vitro del café fue Staritsky (1970), a partir de secciones de tallo de brotes ortotrópicos utilizando el proceso de embriogénesis somática indirecta. El primer señalamiento de regeneración por embriogénesis somática en C. arábica, a partir de secciones de hoja, fue presentado por Söndahl y Sharp (1977), encontrándose que, a diferencia de otros explantes, las secciones foliares tenían una mayor frecuencia embriogénica (Sondahl & Monaco, 1981). Las hojas más cercanas al ápice de la rama (último par) son las que poseen el mayor potencial embriogénico, según lo señalan Londoño y Orozco (1986a) y Noceda et. al. (1998).

El desarrollo embriogénico se presenta tanto en secciones foliares de vitro-plantas como en plantas de invernadero, aunque el rendimiento es mayor en las primeras (Menéndez-Yuffá y Hermoso, 1998; Hermoso y Menéndez, 2000). El callo puede ser de dos tipos: embriogénico y no embriogénico. El primero es friable y de color amarillo, y el segundo puede ser de color blanco o marrón (Dublin, 1981), observándose que en la mayoría de los casos los embrioides se diferencian a partir del marrón (García y Menéndez, 1987).

El callo se forma por proliferación de células en la zona de corte del explante, desarrollándose en la zona periférica de las células del parénquima esponjoso después de seis días (Söndahl, et. al., 1979), o del mesófilo esponjoso. Es importante destacar que el rendimiento del proceso regenerativo estará influenciado por el genotipo (Bieysse, et.al., 1993) y que el origen de los embriones en café es unicelular, tal como lo señalan Menéndez-Yuffá y García (1997) y Quiroz-Figueroa, et. al., (2002).

Los embriones que se forman por embriogénesis somática pasan por los estadios embriogénicos típicos de los embriones cigóticos: globular, corazón y torpedo. Generalmente se pueden observar todos los estadios simultáneamente sobre la superficie lisa del callo, por lo cual la diferenciación de éstos es asincrónica. También se puede observar con frecuencia el desarrollo de nuevos embriones sobre la superficie de los embriones somáticos de mayor desarrollo, tal como lo señala Marques (1993), específicamente en la zona basal del hipocotilo, lo que pone en evidencia la gran capacidad de embriogénesis somática secundaria de este cultivo (Menéndez-Yuffá y García, 1997; Menéndez-Yuffá , et al.,1994).

En general, la inducción de embriogénesis somática requiere que el medio tenga la combinación de una auxina (ácido 2,4-diclorofenoxiacético: 2,4-D) y una citoquinina (cinetina: KIN; ó Bencilaminopurina: BAP), siendo ésta última la de mayor concentración, incrementándose la frecuencia embriogénica al emplear BAP (García y Menéndez, 1987; Neuenschwander y Baumann, 1992; Berthouly y Michaux-Ferriere, 1996). Sin embargo, Yasuda, et al., (1985); Hatanaka, et al., (1991, 1995); Fuentes, et, al., (2000); Fernández, et al., (2005) y Giridhar, et. al., (2004) obtuvieron una alta frecuencia de embriogénesis somática empleando como único regulador de crecimiento una citoquinina (KIN, BAP, iso-pentiladenina o Tidiazuron (TDZ).

Los embriones somáticos formados bajo estas condiciones pasan por un proceso directo (sin la formación previa de callo), a partir de las células mesofilares en las zonas de corte del explante foliar (Quiroz- Figueroa, et.al., 2006; Gatica, et. al., 2007; Pereira, et. al.., 2007; Costa de Rezende et. al., 2008), mientras que al utilizar dos hormonas (auxina 2,4-D y citoquina KIN) se distingue una embriogénesis indirecta (Quiroz- Figueroa, et. al., 2002).

Por otra parte⁴, Lanaud (1981) logró obtener plantas haploides por embriogénesis somática a partir de óvulos de C. canephora. Sin embargo, se ha obtenido más éxito en la regeneración de haploides a partir de anteras, sometiendo los callos a bajas temperaturas (5°C) por 24-48 h (Ascanio y Arcia, 1994). También se ha incrementado la eficiencia del proceso suplementando el medio de cultivo con 16% de agua de coco (Neuenschwander y Baumann, 1995) y trabajando con microsporas, al pre-tratarlas por 48 h con colchicina (Herrera, et al., 2002).

Cultivos en suspensión, metabolitos secundarios y sistemas de inmersión temporal

Los cultivos en suspensión son de gran interés, ya que se puede ejercer un mejor control en las condiciones de cultivo, permitiendo dos potenciales aplicaciones: la producción de metabolitos secundarios y la generación de embriones somáticos en gran escala (Menéndez-Yuffá y García, 1998).

La concentración de los gases es importante para el logro de una alta regeneración por embriogénesis somática a partir de suspensiones embriogénicas de C. arábica. En cuanto a la concentración de oxígeno, se ha encontrado que a un 80% de oxígeno se obtiene gran cantidad de agregados de células embriogénicas, embriones en estadio globular y corazón, mientras que a bajas concentraciones (50%), las formas globulares y corazón disminuyen, pero se incrementan los niveles de embriones tipo torpedo (Jiménez y et. al., 1998). Este proceso se optimiza empleando biorreactores, en donde se asegura con alta eficiencia la regeneración de plantas completas por embriogénesis somática (Afreen, et. al., 2002; Ethienne, et. al., 2001; Ethienne. et.al., 2002), obteniéndose hasta un 75% de conversión de plantas normales (Albarrán, et.al., 2005). En el caso del dióxido de carbono, Barbón, et .al., (2008) señalaron que a una concentración de 2,5% de CO2 es posible encontrar la mayor proliferación de embriones somáticos.

Otras condiciones que influyen en un mayor rendimiento en la producción de embriones somáticos son la consistencia del medio y la incidencia de la luz. En este sentido, se ha encontrado una gran proporción embriogénica con un medio semisólido (2% gelrite), en oscuridad contínua o a dieciséis horas de fotoperiodo (Gatica, et. al., 2008a).

Con respecto a la producción de metabolitos secundarios en café, se ha producido cafeína a partir del cultivo de callo de C. arabica luego de doce a trece días de iniciado (Frischknecht, et. al., 1977; Frischknecht y Baumann, 1980; Baumann y Rohrig, (1989), mientras que a partir de cultivo en suspensión inmovilizado en cubos reticulados de poliuretano, se ha logrado eficientemente la transformación de tebromide en cafeína (Furuya, et. al., 1991).

Sin embargo, mediante la utilización de biorreactores se produce el metabolito con mayor eficiencia (más de nueve veces), tomando en consideración el tamaño del inóculo, la concentración de oxígeno y la tasa de recirculación de los gases solubles (Baumann y Neuenschwander, 1990; Dubuis, et. al., 1995). A través del cultivo en suspensión también se pueden obtener protoplastos, los cuales constituyen un material que puede utilizarse para el intercambio de material genético, ya sea por hibridación somática o por ingeniería genética mediante métodos directos o indirectos (Potrykus y Shillito, 1988; Puite, 1992; Cocking, 2000).

Otra vía para obtener altos rendimientos en la producción de embriones somáticos de Coffea arabica es el sistema de inmersión temporal (IT), a partir del cual se obtienen embriones torpedo que se desarrollan rápidamente (seis semanas) en plántulas, en un substrato estéril (no especificado); de éste modo se evita el paso de germinación in vitro en medios con agar, lo cual minimiza la vitrificación y reduce el costo en medios y mano de obra (Ethienne-Barry, et. al., 1998, 1999).

Efectos de las condiciones del cultivo in vitro

Se ha señalado que la adaptación a tierra de las plantas de café obtenidas in vitro es exitosa y que el crecimiento es igual al de las plantas obtenidas a partir de semilla (Peña, 1983; Peña y Serna, 1984). Sin embargo, Barry, et. al., (2002) indican que la fase de aclimatación ex vitro puede ser problemática y ocasionar pérdidas. Es posible que esto se relacione al uso excesivo de reguladores de crecimiento, lo que a su vez pudiera causar alteraciones en el material genético de las vitro-plantas y afectar negativamente el proceso de adaptación ex vitro. Otra causa de variantes somaclonales es la edad del cultivo celular, observándose que a medida que se hace más viejo, se obtienen de 80-90% de variantes (Etienne y Bertrand, 2003). Asimismo, su potencial embriogénico está concatenado a la variación del ADN nuclear, tal como se demostró mediante citometría de flujo (Zoriniants et. al., 2003).

Cabe mencionar que para evaluar eventos morfo-genéticos en el proceso regenerativo in vitro se utilizan técnicas moleculares como RFLP, AFLP y RAPD, así como análisis de isoenzimas y patrones de proteínas (Menéndez-Yuffá, et. al., 1994; Menéndez-Yuffá y García, 1996; Rani, et. al., (2000).

Cultivo in vitro, criopreservación y bancos de germoplasma

El cultivo in vitro es muy importante para la preservación del germoplasma, ya que las semillas de café tienen la desventaja de perder su viabilidad con el tiempo. Estos métodos permiten mantener el germoplasma en espacios reducidos, transportarlo fácilmente y garantizar un alto grado de limpieza desde el punto de vista fitosanitario (Menéndez- Yuffá y García, 1998). Se ha logrado criopreservar eficientemente (con nitrógeno líquido) embriones cigóticos de C. arabica y C. canephora, (Esquivel, et. al., 1992). También se han producido semillas artificiales, encapsulando embriones cigóticos de C. arabica en una solución de 6% de alginato de sodio, logrando de 20-30% de supervivencia y regeneración por embriogénesis somática (Muniswamy y Sreenath, 2000).

Antecedentes de la transformación genética de café

A pesar del éxito reportado por diversos investigadores, en relación a la introducción de genes foráneos (reporteros y/o de selección) en café utilizando diferentes métodos de transformación, el registro de regeneración del material transformado y la obtención de plantas transgénicas es limitado. Es solo en los últimos años, después de diferentes pruebas y modificaciones que se han realizado en las distintas metodologías, cuando se ha logrado la regeneración del material sometido a transformación genética.

En cuanto a la transformación por Agrobacterium, se han utilizado las especies A. tumefaciens y A. rhizogenes, así como los genes gus, nptII, hpt, csr1 y cry1ac (Spiral, et. al., 1993; De Peña, 1995 en Carneiro, 1999; Ribas, et. al., 2006). Hatanaka, et. al., (1999), LeRoy, et. al., (2000), Perthuis, et. al., (2005) y Kumar, et. al., (2006) reportan regeneración del material transformado con evaluación positiva al nivel de fenotipo y mediante PCR.

En la transformación por electroporación se han empleado los genes gus y bar (van Boxtel, 1994 en Fazouli, et. al., 2000); destaca el trabajo de Fernández y Menéndez (2003), quienes reportan la regeneración del material transformado con resultados positivos en la reacción GUS y en la PCR para los genes mencionados. La transformación por biobalística se ha llevado a cabo con los genes gus, bar, nptII y ahas, con resultados positivos en la expresión transitoria del gen gus y en la PCR para los genes introducidos (Van Boxtel, et. al., 1995; Noceda, et. al., 1998; Barros, et. al., (2001); Ribas, et. al., 2005).

Mas recientemente se ha logrado la transformación de C. arábica cv Catimor mediante biobalística con el gen cry 1ac de Bacillus thuringiensis utilizando un plásmido completo y un bloque o casette genético constituído por la secuencia promotora, el gen cry 1ac y la secuencia terminadora; con este tipo de construcciones es menor la cantidad de genes o secuencias foráneas que se introducen en el material bombardeado y se disminuye o elimina el posible riesgo de transferencia (horizontal o vertical) de genes de resistencia a antibióticos o herbicidas usados como genes marcadores de selección en el procedimiento de transformación, lo cual es ventajoso al nivel de la bioética y la bioseguridad (De Guglielmo, et. al., 2010).

Dentro de la transformación por biobalística Rosillo, et. al., (2003) bombardearon suspensiones celulares de C. arábica cv. Colombia con varios plásmidos de la serie pCAMBIA (Centre for the Application of Molecular Biology to International Agriculture-Canberra, Australia); los autores lograron la expresión transitoria del gen reportero gus, sin embargo, no reportan la regeneración de plantas. Gatica-Arias y col. (2008b) también bombardearon agregados de suspensiones celulares de C. arabica cvs Caturra y Catuaí con el gen gus, y lograron la regeneración vegetal vía embriogénesis somática indirecta.

Las técnicas de Ingeniería Genética también se han usado en café para modificar el contenido de cafeína; Ogita, et. al., (2004), mediante la tecnología del ARN de interferencia (ARNi) inhibieron la expresión del gen CaMXMT1 que codifica a la N-metiltransferasa teobromina sintetasa, involucrada en la biosintesis del alcaloide, reduciendo el contenido final de cafeina en un 70% y entre 65-85% en C. canephora y C. arabica, respectivamente.

En relacion al control de la maduracion del grano de cafe, proceso fundamental a nivel de la calidad y el valor del producto, se han clonado dos genes que codifican enzimas involucradas en la sintesis de etileno, la amino 1-ciclopropano carboxilico sintetasa o ACC sintetasa y la amino 1-ciclopropano carboxilico oxidasa o ACC oxidasa, los cuales se perfilan como elementos claves para el establecimiento de sistemas de transformacion genetica de cafe con el objetivo de controlar el proceso de maduracion del grano (Pereira, et. al., 2005).

Respecto a la tolerancia a estres abiotico (condiciones de sequia, salinidad, fitotoxicidad por metales y frio) se han producido plantas transformadas con factores de transcripcion que, inducidos por cualquiera de estas condiciones, activan una familia de genes que incrementan la tolerancia del cafe; esta familia incluye los genes cor15a, cor6.6, rd29A, kin1 y rd17 (Kasuga, et. al., 1999).

En la transformacion genetica del cafe se han utilizado promotores de origen viral, como el CaMV35S del virus del mosaico del coliflor, asi como de origen vegetal, incluyendo el promotor de la ubiquitina del maiz, el EF1a de A. thaliana, el de la actina de arroz y promotores propios del cafe, incluyendo el promotor de la ƒ¿-tubulina (nro. de accesion al Genbank AF363630) y de la proteina de almacenamiento 11S de C. arabica (nro. de accesion al Genbank AF055300). Con estos ultimos se han obtenido resultados similares a los registrados con promotores foraneos en cuanto a la expresion de los genes de interes introducidos, pero con las ventajas que ofrece el uso de secuencias propias de la planta al nivel de bioseguridad (Rosillo, et. al., 2003).

Finalmente, en relacion a las pruebas en campo de plantas transgenicas de cafe, el primer reporte fue con la resistencia al minador de la hoja del cafe (LeRoy, et. al., 2000). En invernadero, realizaron bioensayos exponiendo las plantas seleccionadas en base a la resistencia al agente de selección, detección de la proteína cry1ac en extractos foliares mediante Western Blot y evaluación positiva al nivel de ADN (PCR y Southern Blot), a las larvas del insecto, encontrándose una considerable reducción en el número de minas y en la defoliación en las plantas transgénicas, en comparación a lo observado en las no transgénicas (plantas controles). Las plantas que mostraron alta resistencia al minador en las pruebas realizadas en invernadero, fueron seguidamente evaluadas en campo en la Guayana Francesa durante cuatro años consecutivos, encontrándose que el 70% de las plantas fue resistente a la plaga en estas condiciones. No se evidenciaron diferencias entre el crecimiento de estas plantas con respecto al de las plantas controles durante el periodo de estudio. Sin embargo, el experimento fue interrumpido forzosamente debido a la acción de grupos ecologistas (CIRAD, 2001; Perthuis, et. al., 2005).

De la misma manera, Perthuis, et. al., (2005) reportan un estudio de cuatro años consecutivos en un campo plurianual de la Guayana Francesa, donde sembraron plantas de Coffea canephora transformadas mediante A. tumefaciens y A. rhizogenes con el gen cry 1ac y han llevado a cabo seis infecciones con el minador de la hoja, encontrando una reducción significativa en el número de minas observadas en las plantas transformadas, en comparación al control (café robusta no transformado). Esto indica la expresión de resistencia estable a la plaga durante el periodo de estudio. Los investigadores señalan la necesidad de prolongar el periodo de evaluación y la realización de investigaciones complementarias en estas plantas de café.

CONCLUSIONES

El café representa un gran potencial económico a nivel mundial, lo que ha determinado la búsqueda constante del mejoramiento de su rendimiento como cultivo. Para ello se han utilizado diversas técnicas biotecnológicas que abarcan desde el cultivo in vitro hasta la transformación genética.

La revisión documental de la información y análisis de los trabajos de investigación seleccionados sobre el café, su historia, cultivos y elementos de su transformación genética representa un aporte como recurso referencial para docentes y estudiantes en los diferentes cursos de Biología.

De igual forma, representa un aporte para el establecimiento de novedosos programas de investigación y mejoramiento dirigidos a la obtención de nuevos cultivares con características agroecológicamente importantes en países productores de café, como Venezuela, ya que se sintetizan aspectos relevantes requeridos para tal fin.

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