Recibido: marzo 2014. Aprobado: junio 2014. Versión final: julio 2014.

INTRODUCCIÓN

Las coloraciones diferenciales de fluorescencia, en el estudio microscópico de los frotis, se aplican desde que Kronvall y Myhre (1977), introdujeron el fluorocromo naranja de acridina para la detección de bacterias. En el año 2002, Fazii et al. observaron que bacterias grampositivas y gramnegativas teñidas con naranja de acridina eran decoloradas diferentemente con alcohol etílico-acetona, ideando así un método de coloración diferencial para la detección y distinción de bacterias grampositivas y gramnegativas por fluorescencia. Ellos utilizaron dos fluorocromos: naranja de acridina y fluoresceína de sodio; las bacterias grampositivas se tiñen de amarillo fluorescente y las gramnegativas de verde fluorescente. La hipótesis que manejaron para explicar el mecanismo de tinción se fundamentó en la interacción del naranja de acridina con componentes de la pared celular, tales como polisacáridos y lipopolisacáridos. Probablemente, en las bacterias gramnegativas, al decolorar con alcohol etílico-acetona se desestabiliza la membrana externa rica en lipopolisacáridos, removiéndose parcialmente el naranja de acridina e incorporándose la fluoresceína y así se tiñen de color verde. Sin embargo, el alcohol etílico-acetona produce poco cambio en las bacterias que retienen el naranja de acridina (grampositivas), éstas se observan de color amarillo cuando al fluorocromo rojo, naranja de acridina, se le añade el segundo fluorocromo verde, fluoresceína de sodio. Los investigadores la aplicaron en extendidos de secreciones uretrales de pacientes con cultivos positivos para N. gonorrhoeae y los gonococos se visualizaron verdes fluorescentes.

Posteriormente, Flores et al. (2008), publicaron un estudio que evaluó la coloración diferencial de fluorescencia, introduciendo una modificación en el pH de la solución colorante de fluoresceína, con el propósito de mejorar la fluorescencia emitida por las bacterias. Detectaron que los diplococos emitieron un tinción distinta a la referida por Fazii et al. (2002), observándose anaranjados fluorescentes, no obstante, esta variación en la tinción no se han dilucidado, sugiriendo que podría estar relacionada al proceso de transcripción de ARN durante el ciclo celular. A propósito de la modificación de la técnica, se ha publicado que la coloración diferencial de fluorescencia modificada representa una contribución significativa como herramienta en el diagnóstico de gonorrea en muestras perianales y uretrales, teniendo mayor capacidad discriminatoria que la tinción de Gram, especialmente, en los pacientes asintomáticos, lo que sería importante para el control de la enfermedad (Flores y Albarado 2009a).

Basado en la similitud entre las propiedades moleculares del ADN y ARN de células eucariotas y procariotas, en el presente estudio se plantea una hipótesis para explicar la reacción de coloración del método de tinción diferencial de fluorescencia modificada. Ésta se fundamenta sobre los principios químicos de coloración, por lo que, la hipótesis sobre las variaciones de color es apoyada con el trabajo de Darzynkiewicz (1990), quien señala que el naranja de acridina es un colorante catiónico y metacromático, que emite fluorescencia cuando interactúa con los ácidos nucleicos. Con el ADN se intercala produciendo una coloración verde fluorescente y con el ARN interactúa expresando una tonalidad rojo fluorescente. Las variaciones de color observadas con la tinción diferencial de fluorescencia modificada, posiblemente, se fundamentan en los procesos de síntesis de ADN y ARN en el ciclo celular bacteriano, naturaleza química y mecanismo de acción del naranja de acridina sobre los ácidos nucleicos, de manera que, en esta investigación, se planteó como objetivo evaluar las características tintoriales de N. gonorrhoeae obtenidas por la coloración diferencial de fluorescencia modificada y asociarlas con la presencia de ADN y ARN antes y después de tratamiento con ADNasa y ARNasa, con el fin de aportar una evidencia sobre el mecanismo de reacción de la coloración de fluorescencia modificada en N. gonorrhoeae, ya que se ha demostrado que es útil en el diagnóstico oportuno de pacientes asintomáticos; así como ofrecer la técnica como una herramienta complementaria en los estudios del ciclo celular bacteriano.

Para lograr que las células de un cultivo alcancen la fase de crecimiento óptimo para desarrollar los experimentos, se inoculó una colonia a partir del cultivo primario, en agar GC de la estirpe a trabajar, en 3 mL de caldo infusión cerebro corazón (BHI) enriquecido con sangre humana al 5%, incubándolo a 37ºC en ambiente de microaerofilia, entre 16 y 18 h (Salguero 2007, Li et al. 2014).

Sobre la base de estudios de crecimiento de N. gonorrhoeae en medio líquido, se estima que la fase de crecimiento exponencial se inicia en la primera hora después de haber sido transferido un cultivo a otro medio de composición idéntica y continúa durante las siguientes 7 h (Jones y Talley 1976), de modo que, para obtener esta fase de crecimiento y una población bacteriana sincrónica para el estudio del ciclo celular, se transfirieron cinco gotas del cultivo BHI enriquecido con 5% de sangre humana, a un caldo fresco del mismo medio de cultivo, incubándose por 1 h a 37ºC. A partir de este cultivo, se realizó el ciclo celular, tomando alícuotas para realizar los extendidos desde el tiempo 0 min hasta los 120 min, a intervalos de 5 min.

Para el control de las diferentes tinciones se utilizaron las cepas Staphylococcus aureus ATCC 25923 como control de bacteria grampositiva y Escherichia coli ATCC 25922 como control de bacteria gramnegativa. Estas cepas se procesaron del mismo modo que los aislamientos de N. gonorrhoeae evaluados y, adicionalmente, se les realizaron cultivos sincronizados, los cuales están compuestos por células donde todas se encuentran en la misma etapa del ciclo celular, permitiendo estudiar la sucesión de eventos que se llevan a cabo en una sola célula (Brooks et al. 2002). El método excelente de selección para obtener cultivos sincrónicos es la técnica de Helmstetter-Cummings (HC), basado en el hecho que algunas bacterias se adhieren fuertemente a las membranas de filtros de nitrato de celulosa (Stainer et al. 1991).

Se construyeron tablas de 2 x 2, para expresar las frecuencias observadas. Asimismo, se aplicó la prueba de McNemar, para asociar la reactividad tintorial por el método de coloración diferencial de fluorescencia modificada antes y después del tratamiento con ADNasa y ARNasa en los aislamientos de N. gonorrhoeae (Pértega y Pita 2004).

Con la coloración de fluorescencia modificada, las células que se tiñeron de anaranjado o amarillo, después del tratamiento con ADNasa y ARNasa, se colorearon verdes ligeramente fluorescentes o verdes casi imperceptibles. Para determinar la asociación entre la reactividad tintorial por fluorescencia con presencia de ADN y ARN, mediante la degradación con las enzimas ADNasa y ARNasa, se seleccionaron aquellos tiempos donde los mono y diplococos presentaron, exclusivamente, una intensidad de fluorescencia antes del tratamiento: amarillo ligera o intensamente fluorescente, y anaranjado ligera o intensamente fluorescente. De manera que, se seleccionó un total de 75 tiempos con tinción amarilla, de los cuales 67 tiempos presentaron células con intensidad de fluorescencia ligera y ocho fueron intensamente fluorescentes. Del mismo modo, se seleccionaron 63 tiempos con bacterias anaranjadas, 52 ligeramente fluorescentes y 11 fluorescentes.

En la asociación entre la reacción de tinción amarillo ligera o intensamente fluorescente con presencia de ADN hubo 61 pares de tiempos discordantes, en donde el 98,36% (60/61) de los pares de tiempos presentó mono y diplococos con tinción amarillo ligera o intensamente fluorescente y cambiaron a verde ligeramente fluorescente o fueron poco perceptibles después del tratamiento con ADNasa. En la asociación con presencia de ARN, se obtuvo 53 pares de tiempos discordantes, en donde el 98,11% (52/53) de los pares de tiempo, mostró células que se colorearon anaranjado ligeramente fluorescente o fluorescente y presentaron cambio después del tratamiento, existiendo asociación estadísticamente significativa (p < 0,05) entre el color amarillo ligeramente fluorescente o fluorescente y la presencia de ADN y ARN (Tabla 1).

Con respecto a la asociación entre la tinción anaranjado ligera o intensamente fluorescente con presencia de ADN, se obtuvo 37 pares de tiempos discordantes, en donde en el 94,59% (35/37) de los pares de tiempo, las células que se colorearon anaranjado ligeramente fluorescente o fluorescente se visualizaron verde ligeramente fluorescente o fueron poco perceptibles después del tratamiento con ADNasa.

En la asociación con presencia de ARN, hubo 49 pares de tiempos discordantes, en donde en el 100% (49/49) de los pares de tiempos, las células que se colorearon anaranjado ligeramente fluorescente o fluorescentes cambiaron de color después del tratamiento con ARNasa, existiendo asociación estadísticamente significativa (p < 0,05) entre el color anaranjado ligeramente fluorescente o fluorescente y presencia de ADN y ARN (Tabla 2).

El control grampositivo S. aureus ATCC 25923 y el gramnegativo E. coli ATCC 25922, mostraron el mismo patrón tintorial de fluorescencia, que los desarrollados en N. gonorrhoeae, durante el ciclo celular. Se halló asociación estadísticamente significativa (p < 0,05) entre la tonalidad amarilla y anaranjada con síntesis de ADN y ARN.

El fluorocromo naranja de acridina doble sal hemi (C17H20ClN3HCl.1/2ZnCl2), de carácter fuertemente básico, presenta mayor afinidad por estructuras de carga negativa, como los ácidos nucleicos de la célula, impidiéndose la remoción del colorante naranja de acridina con el alcohol etílico-acetona en aquellas bacterias donde la síntesis de ARN sea mayor, la fluoresceína a baja concentración no ejercería el efecto diferencial, adquiriendo, por lo tanto, una coloración anaranjado fluorescente. Por otro lado, las bacterias que no se encuentran en proceso de síntesis de ARN son decoloradas completamente tras la aplicación del alcohol-acetona, manifestando una tinción verde fluorescente o de baja fluorescencia, que puede estar asociada a síntesis de ADN. La tinción amarilla se produce dado que el naranja de acridina es removido parcialmente, pudiendo este hecho estar relacionado con una síntesis no tan activa de ARN, y al incorporar la fluoresceína de sodio se forma el sistema rojo/verde (Flores et al. 2008).

Las variaciones de tinción por el método de coloración de fluorescencia modificado, también se han reportado en otros géneros bacterianos como Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus y Enterococcus (Albarado y Flores 2008, Flores y Albarado 2009b). Albarado y Flores (2008) proponen por primera vez un patrón de tinción por fluorescencia asociado a fases del ciclo celular bacteriano, sobre la base de que dicho ciclo comprende una secuencia de acontecimientos interconectados, como la fase B, que es el período en el que ocurre una activa síntesis de ARN y proteínas, además, de otros componentes celulares; una fase C, caracterizada por la replicación del ADN cromosómico y una fase D que es el tiempo entre la finalización de la replicación y terminación de la división. Los investigadores sugirieron, que el color verde correspondía a la fase C, y que dicho color se presentaba, posiblemente, como producto de la intercalación del naranja de acridina al ADN. La tonalidad amarilla de baja fluorescencia, tal vez, representa a la fase D, así como también a la B, ya que observaron un incremento paulatino de la tonalidad amarilla a medida que transcurría el tiempo en el ciclo celular y la presencia de estructuras redondas amarillas, las cuales sugirieron que se trataban de nucleoides, lugar donde se inicia el proceso de síntesis de ARN; infirieron también que la tonalidad amarilla de baja fluorescencia se debe a una menor cantidad de ARN; por último la tonalidad anaranjada fluorescente, corresponda a la fase B en donde pueda existir un alto contenido de ARN y que al interactuar con el naranja de acridina se produzca dicho color.

Los cambios de color visualizados por la tinción de fluorescencia representan fases del ciclo celular bacteriano, sugiriéndose, asociación del color anaranjado a una síntesis activa de ARN (Flores et al. 2008). En esta investigación se obtuvo que en un alto número de pares de tiempos discordantes (49) se observaron células anaranjadas con intensidad de fluorescencia variable, confirmándose su asociación con la presencia de ARN. Después del tratamiento con ADNasa, aunque, en un menor número de pares de tiempos (35), se advirtió que desapareció el color anaranjado, constatándose asociación con la presencia de ADN. Se explica que el ADN induce metacromasia sobre el naranja de acridina, cuando el polímero de ADN de doble cadena cambia a cadena simple (Pal y Ghosh 1973). En los procesos de síntesis de ADN y ARN, hay tres momentos en donde el ADN puede estar en la configuración de cadena simple. En la replicación a nivel del origen de replicación, el ADN de doble cadena se convierte en ADN de cadena simple, al romperse los enlaces de hidrógeno por la acción de proteínas y enzimas. En la transcripción, en la etapa de iniciación se forma la burbuja de transcripción, en la cual se produce un desenrollamiento de la molécula de ADN en, aproximadamente, 20 pares de base, y en la fase de terminación de la transcripción, se produce el desenrollamiento del complejo ARNm-ADN por el factor rho (ρ) (Prescott et al. 2004). Es posible que, cuando el naranja de acridina interactúa con el ADN, lo esté haciendo con cadenas simples de ADN, de allí la asociación, entre el color anaranjado con ADN, sin embargo, no se puede especificar, cuál de estos momentos corresponde, requiriéndose de más estudios para ello.

Se concluye que la secuencia de color del método de tinción diferencial de fluorescencia modificada en el ciclo celular de N. gonorrhoeae es amarillo, anaranjado y verde, el color predominante es el anaranjado ligeramente fluorescente y, el ADN y ARN participan en el carácter tintorial amarillo y anaranjado ligeramente fluorescente o fluorescente en el ciclo celular de N. gonorrhoeae.

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