Aspectos ultraestructurales de los estadios inmaduros de Micropygomyia (Sauromyia) trinidadensis (Diptera: Psychodidae, Phlebotominae)

Ultrastructural aspects of immature stages of Micropygomyia (Sauromyia) trinidadensis (Diptera: Psychodidae, Phlebotominae)

Dalmiro Cazorla-Perfetti¹, Milagros Oviedo²

¹ Universidad Nacional Experimental “Francisco de Miranda”, Decanato de Investigaciones, Centro de Investigaciones Biomédicas (CIB), Laboratorio de Entomología, Parasitología y Medicina Tropical (LEPAMET), Coro, Venezuela, ² Universidad de Los Andes, Núcleo Universitario “Rafael Rangel”, Instituto Experimental “José Witremundo Torrealba”, Laboratorio Biología de Lutzomyia e Insectario “Pablo Anduze”, Trujillo, Venezuela. E-mail: lutzomyia@hotmail.com / cdalmiro@gmail.com

Resumen

Los sistemas de clasificación de la subfamilia Phlebotominae se basan principalmente en características de imagos, observadas mayormente bajo microscopía de luz. La Microscopía Electrónica de Barrido (MEB) proporciona información adicional sobre caracteres morfológicos para la identificación de estadios inmaduros e imagos en los sistemas de clasificación de los flebotominos. En el presente artículo se identificaron y describieron características ultramorfológicas externas de huevos, larvas estadio IV y pupas de Micropygomyia (Sauromyia) trinidadensis, obtenidas en condiciones de laboratorio a partir de hembras flebotominas capturadas en Trujillo, región Andino-Venezolana. El estudio ultramorfológico reveló que los huevos de Mi. (Sau.) trinidadensis poseen un patrón de esculpido exo-coriónico poligonal, mientras que las larvas IV pueden colocarse en el Grupo 4 de las especies flebotominas del Neotrópico que se caracterizan por antenas con segmento basal corto y el distal ovoide; la mayoría de las setas analizadas de las pupas son simples y espiniformes, y las pre-alares son largas y delgadas con puntas afiladas. Se discute la importancia de estos hallazgos ultraestructurales en el contexto de la taxonomía y sistema de quetotaxia de la subfamilia Phlebotominae.

Palabras clave: Flebotominos, morfología, Insecta, Microscopía Electrónica de Barrido.

ABSTRACT

The classification systems of the subfamily Phlebotominae has been mainly based on morphological characters of adult stages, and mostly studied under light microscopy. Scanning Electron Microscopy (SEM) provides additional information for the identification of pre-imaginal and imaginal stages in phlebotomine sand flies classification systems. In the present study, outer ultramorphological characteristics of laboratory reared eggs, fourth instar larvae and puparium of Micropygomyia (Sauromyia) trinidadensis of Trujillo, Venezuelan Andes region, were identified and described. The ultramorphological study revealed a poligonal exo-chorionic sculpturing pattern of the eggs of M. trinidadensis, whereas the fourth instar larvae can be placed in Group 4 of the Neotropical phlebotomine which are characterized by antennae with a short basal segment and an ovoid distal segment; most of analysed puparium setae are short, smooth and spinniform, and the pre-alar ones long, thin and sharp. The importance of these ultrastructural findings to phlebotomine sandfly taxonomy and chaetotaxy system, is discussed.

Key words: Sand flies, morphology, Insecta, Scanning Electron Microscopy.

Recibido: septiembre 2014. Aprobado: febrero 2015. Versión final: marzo 2015.

INTRODUCCIÓN

Como ya se ha venido insistiendo en trabajos previos (Cazorla y Oviedo 1998, 2001, Cazorla 2001, Cazorla et al. 2010), el hecho que existan relativamente pocas descripciones de los estadios inmaduros (e.g., larvas, pupas) en los integrantes de la subfamilia Phlebotominae (Diptera: Psychodidae), ha resultado que los sistemas de clasificación taxonómica y sistemática se basen exclusivamente en caracteres y estructuras morfológicas de los adultos. Por lo demás, la mayoría de estas descripciones se encuentran basadas en observaciones hechas bajo microscopía de luz, quedando aún por describirse y determinarse la importancia taxonómica y sistemática de detalles ultraestructurales, especialmente bajo Microscopía Electrónica de Barrido (MEB), como por ejemplo, entre otros, de las sensilas del tegumento (Leite et al. 1991, Leite y Williams 1996, 1997).

Las especies flebotominas integrantes del género Micropygomyia Barreto 1962 (Tribu Phlebotomini Rondani 1840, subtribu Brumptomyiina Artemiev 1991, sensu Galati 2012), particularmente las de la Serie Oswaldoi Barreto 1962 del subgénero Sauromyia Artemiev 1991, no escapan a esta problemática planteada. En este sentido, en esta Serie que la integran actualmente alrededor de 21 especies (Galati 2012), sólo se han descrito el esculpido exo-coriónico y los estadios pre-imaginales de Mi. (Sau.) trinidadensis Newstead, 1922 (= Lutzomyia trinidadensis del Grupo Oswaldoi Theodor, 1965 sensu Young y Duncan 1994) (Hanson 1968, Feliciangeli et al. 1993, Fausto et al. 1998), y Mi. (Sau.) oswaldoi Mangabeira, 1942 (= Lu. oswaldoi del Grupo Oswaldoi, sensu Young y Duncan 1994) (Mangabeira 1942); sin embargo, mediante MEB solamente se ha descrito para Mi. (Sau.) trinidadensis, la superficie oval a partir de ejemplares capturados en el estado Carabobo, región Nor-central de Venezuela, y los espiráculos de larvas IV obtenidas igualmente en este último país (Feliciangeli et al. 1993, Fausto et al. 1998).

Mi. (Sau.) trinidadensis es una especie flebotomina ampliamente distribuida en países de la región Neotropical, incluyendo México, Belice, Guatemala, Honduras, Nicaragua, Costa Rica Panamá, Colombia, Trinidad, Surinam, Guyana Francesa, Ecuador, Perú, Bolivia y Venezuela (Galati 2012). En el territorio nacional exhibe un amplio rango de distribución altitudinal, pudiendo ser encontrada en hasta 21 entidades federales de Venezuela, desde los 0 hasta los 1.900 m (Scorza et al. 1979, Feliciangeli 1988). Esta especie flebotomina generalmente se le ha considerado de alimentarse preferentemente sobre lacertilios o lagartos (Squamata: Lacertilia), a los cuales les puede trasmitir el protozoario-flagelado Trypanosoma thecadactyli (Christensen y Telford 1972, Young y Duncan 1994). Sin embargo, otros investigadores refieren haber capturado a hembras de Mi. (Sau.) trinidadensis picando sobre humanos (Scorza et al. 1979, Zeledón et al. 1982), mientras que Bonfante-Garrido et al. (1990) la encontraron naturalmente infectada con promastigotes de Leishmania, aunque estos no pudieron ser identificados a nivel específico (Bonfante-Garrido et al. 1999). Para Feliciangeli (1991), estos hallazgos necesitan ser confirmados. Más aún, basado en estas observaciones, Williams (1988) arroja la posibilidad de considerar a los especímenes capturados por Scorza et al. (1979), que sólo fueron identificados a nivel de hembras, por sobre los 1.800 m de altitud en Trujillo, región andina de Venezuela, como una especie distinta a las consideradas como Mi. (Sau.) trinidadensis en las tierras bajas de Centro América, pudiendo conformar de este modo un complejo de especies crípticas.

A la luz de lo expuesto, en el presente trabajo se dan detalles morfológicos ultraestructurales bajo MEB del esculpido exo-coriónico de huevos, la quetotaxia de larvas de estadio IV y pupas de Mi. (Sau.) trinidadensis, obtenidas a partir de la colonización y cría de hembras capturadas en el estado Trujillo, región andinovenezolana. Con ello, se complementa los trabajos de Hanson (1968) con microscopía de luz en Panamá, y se confirma los ultraestructurales de Feliciangeli et al. (1993) y Fausto et al. (1998), en la región centro-norte de Venezuela.

MATERIALES Y MÉTODOS

Especímenes

Las hembras, grávidas y/o alimentadas, se capturaron por aspiración directa en huecos de árboles en los alrededores de la ciudad de Trujillo (Lat. 9°25´00”N, Long. 70°25´00”O), capital del estado Trujillo, ubicada a 960 m de altitud en los Andes de Venezuela. La región posee una zona de vida bioclimática correspondiente al bosque seco pre-montano (bs-pm), con temperatura media anual que oscila en el orden de los 23ºC, la precipitación media anual es de aproximadamente 870 mm, y la evaporación media anual de 1.350 mm (Ewel et al. 1976). Los huevos y las larvas de estadio IV y pupas se obtuvieron mediante técnica de colonización y cultivo propuesta por Añez y Oviedo (1985), cuya secuencia metodológica se describió en un trabajo previo (Cazorla y Oviedo 1998). Los especímenes de las hembras flebotominas se clarificaron en solución de Nesbitt a temperatura ambiente durante 24 horas y montados sobre láminas portaobjetos en líquido de Berlese. Para su identificación y clasificación taxonómica se siguió criterios y nomenclatura dados por Galati (2012), y los de Marcondes (2007) para las abreviaturas.

Microscopía Electrónica de Barrido (MEB)

Para el estudio ultraestructural por MEB, se tomaron los huevos, larvas y pupas transcurridas entre 48-72 horas después de la oviposición y muda de los estadios pre-imaginales, los cuales se transfirieron a viales pequeños. Las larvas y pupas se sacrificaron en agua caliente (70-80°C). Los huevos y los estadios inmaduros se fijaron en glutaraldehido al 3% a 4°C durante 2 h, y seguidamente se lavaron tres veces en solución tampón fosfato (0,1 M y pH 7,2) por 1 min cada vez; luego, se fijaron en solución de tetraóxido de osmio al 1% durante 1 h, y nuevamente lavados con solución tamponada; inmediatamente, se deshidrataron en serie alcohólica (etanol): 30, 50, 70, 80, 90 y 100 %, 5-10 min en cada alcohol. Después, se sometieron a secado por punto crítico de dióxido de carbono (CO₂) en cámara Hitachi modelo HCP-2 (Critical Point Dryer), y sombreado con una capa de oro (A_u) por ionización al vacío en cubridor iónico (Ion Coater) modelo Eiko Engeneering (IB-2). Finalmente, la toma de imágenes se hizo en el Microscopio Electrónico de Barrido (Hitachi S-2500), en el Centro de Microscopía Electrónica de la Universidad de Los Andes, Mérida, estado Mérida, Venezuela.

Se utilizó la nomenclatura empleada por Zimmerman et al. (1977) para la ultraestrucutura de los huevos. La descripción de las estructuras anatómicas y la quetotaxia de larvas IV y pupas se hizo siguiendo nomenclatura y sistema de numeración empleados por Forattini (1973). Para la descripción morfológica-ultraestructural de los componentes de los espiráculos se siguió trabajo de Fausto et al. (1998).

RESULTADOS

Huevos (Fig.1). Presentan forma oblonga, fusiforme (“forma de cigarro”) y extremos redondeados; el esculpido exo-coriónico posee un patrón básico de modelo poligonal (pentagonal, hexagonal), con alrededor de noventa células en la superficie exhibida (Fig. 1A); los polígonos se presentan conectados y de forma irregular (Fig. 1A, B, C); a mayor magnificación (Fig.1B, C, D), sus crestas son continuas y relativamente elevadas formando una red que se encuentra adherida a la superficie oval, aunque también se observan depresiones o hendiduras y varían en anchura.

Quetotaxia de larvas estadio IV (Fig. 2, 3, 4, 5)

Cabeza (Fig. 2, 3): Ovoidal. Dorso-ventralmente, la parte posterior del tegumento de la cabeza se encuentra recubierta con diminutas espinas, configurando formas poligonales conspicuas.

Piezas bucales: Setas 1 (epifaringe) y 2 (labro) dorsales, espiniformes. En la región dorsal de las mandíbulas se exhiben las setas espiniformes a, b y c, que no se incluyen en el sistema de numeración propuesto por Forattini (1973). En la región dorsal de las maxilas, se observa seta d espiniforme, la cual tampoco se incluye en el sistema de Forattini (1973), y la cerda espatulada o sensila (ce).

Setas 3-8 dorsales: Setas 3 y 8 filiformes. Las setas 4, 5, 6 y 7 plumosas, aunque 7 y 4 poseen menor pilosidad. Todas las setas se encuentran insertadas sobre tubérculos prominentes. Es significativo indicar que entre las antenas y la seta 4 se observó una posible sensila espiniforme (Fig. 2B).

Setas 9-12 ventrales: Espiniformes, insertadas sobre tubérculos prominentes. Antena relativamente corta, insertada sobre prominente tubérculo (ti). El primer segmento antenal corto (a₁), y el segundo de mayor longitud (a₂), de contorno elíptico, con surco a lo largo de la línea media, y con apéndice apical espiniforme; en la parte ventral se observa el órgano antenal (Fig. 3B).

Tórax (Fig. 4): El tegumento de todos los segmentos torácicos se encuentra recubierto dorso-lateralmente por tubérculos de forma estrellada, los cuales son más finos y de menor densidad en el protórax anterior.

Protórax anterior: Setas 1, 2, 3 y a dorsales, insertadas sobre tubérculos prominentes; 1-3 plumosas; seta accesoria a espiniforme. Seta 4 en posición ventrolateral; setas 5, 6 y 7 ventrales, plumosas aunque 5 y 6 de escasa pilosidad; todas se encuentran insertadas sobre tubérculos.

Protórax posterior: Región dorsal presenta tres setas (8, 9, 10) plumosas e insertadas sobre tubérculos prominentes. En la región ventral, las setas 12, 13 y 14 son plumosas y se encuentran insertadas sobre tubérculos; las restantes setas dadas en el sistema de Forattini (1973), no se pudieron observar por no contarse con electrongrafías de esta región ventral. El espiráculo anterior (SPA) se observa lateralmente entre setas 10 y 13; su porción periférica consta de 6 conspicuas papilas espiraculares.

Mesotórax y metatórax: Ambos segmentos presentan disposición de setas de manera similar. Todas las setas se encuentran insertadas sobre tubérculos. Setas 1, 2 y 3 dorsales; de las setas ventrales del sistema de Forattini (1973) (4, 5, 6, 7, 8, a, c y d), sólo se pudo observar la 4 y 8 por no contarse con electrongrafías ad hoc.

Abdomen (Fig. 5): El tegumento de los segmentos abdominales 1-7 se encuentra recubierto por tubérculos de forma estrellada, siendo estos más finos y de menor densidad en el dorso del segmento 8 y en todo el segmento 9.

Segmentos abdominales 1-7: Setas 1, 2, 3 y 01 dorsales, plumosas e insertadas sobre tubérculos. Región ventral posee seta 4 lateral, con forma plumosa e insertada sobre tubéculo; de las otras setas ventrales del sistema de Forattini (1973) (8, 9, 02 y b), no se contó con electrongrafías ad hoc.

Segmento abdominal 8: Setas 1, 2 y 3 plumosas; a espiniforme, y 3 en posición lateral. Todas las setas insertadas sobre tubérculos. Setas 4, 5, 6 y 7 ventrales e insertadas sobre tubérculos. 6 espiniforme, restantes plumosas con escasa pilosidad. El espiráculo posterior (SPP) se observa lateralmente entre setas 2 y 3; su porción periférica consta de 12 conspicuas papilas espiraculares.

Segmento abdominal 9: La región dorsal exhibe borde posterior de placa tergal con peine que consta de 20 - 21 dientes. Setas 1 y 3 plumosas e insertadas sobre tubérculos prominentes; la 1 con menor pilosidad. Setas caudales 2B y 2B insertadas sobre prominentes lóbulos (LO). Se detectó una seta no señalada en el sistema de Forattini (1973) (Fig. 5A). Setas 4, 5, 6, 7 y 8 ventrales, espiniformes, insertadas sobre tubérculos conspicuos.

Quetotaxia de pupa (Fig. 6)

Sólo se logró obtener electrongrafías de la región cefálica y protórax, observadas frontalmente. Se captó las setas 01 (pre-clipeal interna), 02 (pre-clipeal externa), 1 (clipeal), 2A (frontal inferior), 2B (frontal superior), 3 (vertical), 4 (post-ocular superior), 5 (post-ocular media), 6A (post-ocular interna), 6B (post-ocular inferior externa) y 10 (pre-alares). Las setas pre-alares son largas y delgadas con puntas afiladas; las restantes son simples y espiniformes.

DISCUSIÓN

El esculpido exo-coriónico de los huevos de Mi. (Sau.) trinidadensis obtenidos en el presente estudio a partir de hembras flebotominas de Trujillo, región andino-venezolana, muestra un patrón poligonal similar al observado por Feliciangeli et al. (1993) en ejemplares de la misma especie de San Esteban, estado Carabobo, región Central de Venezuela, ubicada a 85 m de altitud. Esto hace presumir la estabilidad de este carácter desde un punto de vista taxonómico para la identificación de esta especie flebotomina; sin embargo, en otras especies, e.g., Lu. (Tricholateralis) gomezi, se ha detectado diferencias intraespecíficas (Ward y Ready 1975, Zimmerman et al. 1977, Feliciangeli et al. 1993), e inclusive dos taxones paleotropicales de flebotominos de Kenia (Phlebotomus aculeatus y P. martini), no pudieron ser diferenciadas por sus patrones ovales exo-corionicos, mostrando también una amplia variedad intraespecífica, lo que no se pudo explicar como una variación geográfica, tal como se sugiere para Lu. (Trl.) gomezi (Zimmerman et al. 1977), toda vez que todas las hembras capturadas procedían de la misma localidad o región (Rogo et al. 1992). Al igual como se observó en el presente estudio, en huevos de poblaciones colombianas de las especies Pintomyia (Pifanomyia) youngi y Pi. (Pif.) evansi, Sierra et al. (2000) encontraron similares patrones de esculpido exo-coriónico a los detectados por Feliciangeli et al. (1993) en poblaciones de la misma especie muestreadas en Venezuela. Para Sierra et al. (2000), esta homogeneidad en el patrón exo-coriónico no pareciera reflejar las diferencias de microhábitas donde las hembras flebotominas oviponen, tal como se ha sugerido por ejemplo para otras especies (e.g., Psychodopygus panamensis, Bichromomyia flaviscutellata: Ward y Ready 1975) (Nyssomyia neivai, N. intermedia: Costa et al. 2012); esta presunción se basa en que los surcos y protuberancias superficiales del corión protegerían a los huevos de la desecación del medio externo, y funcionarían como un “plastrón” por donde éstos respiran, siendo por ello una adaptación eco-fisiológica (Ward y Ready 1975, Endris et al. 1987, Fausto et al. 2001, Costa et al. 2012). De toda esta discusión se deriva la apreciación de que cada taxón debe analizarse en particular, ya que para establecer pautas más amplias y generalizadas debe tenerse en cuenta los patrones exo-coriónicos de muchas más especies flebotominas; tarea nada fácil, debido a la dificultad para detectar y recolectar los huevos en la naturaleza, y los problemas y limitaciones de tipo técnico para la cría de flebotominos en condiciones de laboratorio.

Tomando en cuenta la morfología de las antenas, Leite y Williams (1996) propusieron agrupar las larvas estadio IV de los flebotominos neotropicales en cuatro categorías. Por lo que de acuerdo con este sistema, las larvas de Mi. (Sau.) trinidadensis se ubicarían en la categoría iv, por presentar un tubérculo antenal anular, un segmento basal corto y el distal ovoide (Leite y Williams 1996). Igual ubicación tendría Mi. (Sau.) oswaldoi, la otra especie de la Serie Oswaldoi hasta ahora descrita, de acuerdo con las observaciones hechas por Mangabeira (1942). Las observaciones ultramorfológicas dadas en el presente trabajo en las antenas de larvas IV de Mi. (Sau.) trinidadensis, coinciden con las descritas por Hanson (1968) bajo microscopía de luz en especímenes de Panamá; este último investigador observó que las larvas de Mi. (Sau.) trinidadensis son excavadoras en sus hábitos alimentarios, al formar túneles en el sustrato, por lo que las especies flebotominas que poseen este tipo antenal se consideran excavadoras (burrow); de allí que Mi. (Sau.) oswaldoi tendría similar actividad.

De acuerdo a las descripciones dadas por Mangabeira (1942), Hanson (1968) y las del presente trabajo, las diferencias más notorias en la quetotaxia entre Mi. (Sau.) trinidadensis y Mi. (Sau.) oswaldoi se observa en las setas 8 y 9 del protórax posterior, 1 y 2 del meso/ metatórax y segmentos abdominales 1-7, y la 2 del segmento abdominal 8, al ser estas obstensiblemente de mayor longitud.

La estructura ultra-morfológica de los espiráculos de Mi. (Sau.) trinidadensis obtenidos en el presente estudio de la región andino-venezolana, son similares al observado por Fausto et al. (1998) en ejemplares de la misma especie de la región central del país. Esto sugiere que se podría considerar un carácter taxonómico estable para este taxón. En varias especies flebotominas, el aspecto y número de papilas de los espiráculos muestra una amplia variedad, aunque aún se considera que existen muy pocas descripciones para llegar a conclusiones definitivas (Fausto et al. 1998, 1999, Pessoa et al. 2000). Se ha detectado que el tipo de espiráculos en la familia Psychodidae se encuentra íntimamente relacionado con las adaptaciones respiratorias de los estadios larvales a su medio; así, las larvas acuáticas poseen un sifón respiratorio, del cual carecen aquellas que se desarrollan en ambientes con materia orgánica en descomposición (Killick-Kendrick et al. 1992, Fausto et al. 1998, 1999). Como bien lo indican Fausto et al. (1998), es necesario determinar las características ecológicas de los hábitats de las larvas de muchas especies flebotominas, esto con la finalidad de establecer con certeza el siginificado adaptativo de la variabilidad morfológica observada en los espiráculos.

Es significativo resaltar el hallazgo en la región cefálica (Fig. 2B) de una posible sensila entre las antenas y la seta 4; y de que el órgano antenal (Fig. 3B) posea la función olfativa de los ascoides como en las antenas de los flebotominos adultos, tal como lo sugieren Pessoa et al. (2001). Mediante la MEB, cada vez se describen nuevas estructuras (papilas, sensilas, tubérculos, entre otros) en varias regiones anatómicas de los estadios inmaduros de la subfamilia Phlebotominae (Leite y Williams 1996, 1997, Pessoa et al. 2001), cuya significancia taxonómica y eco-fisiológica aún espera por dilucidarse. En este mismo sentido, mediante microscopía de luz, Arrivillaga et al. (1999) estudiando la morfología y quetotaxia de la cápsula cefálica de cinco especies de Lutzomyia spp., incluida Mi. (Sau.) trinidadensis, llegaron a la conclusión que se debe separar las setas de la cápsula cefálica de aquellas de la región bucal, ya que estas últimas poseen un valor adaptativo; ellos consideraron que “la confusion del procéfalo con la region gnatal por los diferentes autores probablemente ha sido la causa de los diferentes sistemas de quetotaxia propuestos y la poca uniformidad de dicha nomenclatura en larvas de flebótomos”. Estos autores inclusive detectaron nuevas estructuras, proponiendo un nuevo sistema para la quetotaxia de la cápsula cefálica, el cual deberá tomarse en cuenta para alcanzar un consenso.

A lo sumo se han descrito y caracterizado como máximo el 2% de los estadios inmaduros de especies Neotropicales de la subfamilia Phlebotominae; y aunque los caracteres pre-imaginales se consideran tan importantes como los imaginales (van Emden 1957, Pessoa et al. 2001), no obstante, para llegar a conclusiones definitivas o aproximaciones con relación a la relevancia de los hallazgos ultramorfológicos pre-imaginales sobre la taxonomía y sistemática de los flebotominos, pareciera existir un consenso general en que es necesario el estudio y descripción de un mayor número de especies.

Agradecimientos

Dr. Ernesto Palacios Prü†, Director del Centro de Microscopía Electrónica de la Universidad de Los Andes, Mérida, estado Mérida, Venezuela.

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