COMPARACIÓN ENTRE EL MÉTODO KJELDAHL TRADICIONAL Y EL MÉTODO DUMAS AUTOMATIZADO ( N CUBE ) PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS EN DISTINTAS CLASES DE ALIMENTOS

COMPARISON BETWEEN KJELDAHL TRADITIONAL METHOD AND AUTOMATED DUMAS ( N CUBE ) METHOD FOR DETERMINA TION OF PROTEIN S IN SEVERAL KINDS OF FOOD

JOSÉ GREGORIO LANZA , PEDRO CÉSAR CHURIÓN , NÉSTOR GÓMEZ

Instituto Nacional denutrición, Laboratorio de Análisis Físicoquímico, Caracas, Venezuela E - mail: joseglanza82@gmail.com

RESUMEN

Los métodos de Kjeldahl y de Dumas son aplicados en el laboratorio de análisis físico químico del Instituto Nacional denutrición de Venezuela, para determinar el contenido denitrógeno en alimentos. Se realizó un estudio comparativo de ambos métodos para determinar si existen diferencias estadísticamente significativas entre sus resultados. Se analizaron veinticuatro muestras de alimentos diferentes por ambas técnicas, observándose queno existen diferencias relevantes (α = 0,05), entre los reportes de ambos ensayos. En virtud que los análisis de proteínas en laboratorios de alimentos son de orden rutinario, se recomienda emplear el método de Dumas como una alternativa para la realización de este ensayo, por ser confiable, rápido y seguro, tanto para el operador como para el ambiente.

PALABRAS CLAVE : Nitrógeno, combustión.

ABSTRACT Kjeldahl and Dumas methods are applied in the Laboratory of physicochemical analysis of the Venezuelan National Institute of Nutrition. A comparative study was made for both methods to determine the existence of statistically significant differences between their results. Twenty four (24) different food samples wer e analyzed by both techniques, showing that there wereno significant differences between reports from both tests ( α = 0.05). Since analys e s of proteins in food laboratories are routinely made , the use of Dumas method is recommend as an alternative for con ducting this essay , being reliable, fast and safe for both the operator and the environment.

Key words : Nitrogen, combustion.

Recibido: diciembre 2014 . Aprobado: enero 2016 . Versión final: marzo 2016.

INTRODUCCIÓN

En la actualidad los requerimientos de los laboratorios de análisis de alimentos y de sus usuarios, en cuanto a tiempos de respuesta , confiabilidad de los resultados y relación costo - servicio - beneficio, son más frecuentes y necesarios. Esto obliga a optimizar procesos analíticos para lograr dar respuesta a la demanda. Por esta razón, actualmente muchos laboratorios están incluyendo en su plantilla de análisis la metodología Dumas en sustitución del tradicional Khjeldal para el análisis de proteínas, debido a que los tiempos de respuesta son más rápidos, sus resultados son reproducibles y no utiliza reactivos como NaOH y H₂SO₄, que suelen incrementar costos y son potenciales contaminantes al ambiente . Tomando en cuenta esto, surgen discusiones a nivel técnico sobre cuál sería la mejor metodología para determinar nitrógeno ( y por consiguiente proteínas ) en matrices de alimentos (Bellomonte et al . 1987, Watson y Galliher 2002 , Cruz et al . 2007) .

La metodología Kjeldhal número 2.062 de AOAC ( AOAC 1984 ), actualmente, sigue siendo el método oficial más usado. Éste emplea una digestión ácida (con ácido sulfúrico y catalizadores) y requiere un tiempo significativo de hasta 10 horas. Por lo general, la digestión se realiza a 420ºC. La reacción forma sulfato de amonio, que en exceso de hidróxido de sodio genera amoniaco, el cual se destila y se titula para determinar el contenido de nitrógeno en la muestra a estudiar. Desde el punto de vista operativo, es un método complejo que necesita tiempo, costos e involucra una serie de puntos críticos que pueden ser fuentes de error. Por otra parte, la metodología Dumas número 990.03 de AOAC ( AOAC 2005) se fundamenta en el principio de destrucción de la materia orgánica a través de una combustión bajo un suministro de oxígeno controlado, a muy altas temperaturas. Consta de cuatro etapas , en la primera etapa se genera una combustión, donde la muestra es incinerada alrededor de 900 ºC en presencia de oxígeno. La siguiente etapa es una reducción, donde el óxido nítrico producido por la combustión es reducido por el tungsteno a nitrógeno molecular. Luego pasa por una etapa de purificación, donde una serie de absorbentes adecuados ( lana de plata y tungsteno ) remueven los constituyentes interferenciales tales como los haluros de hidrógeno y los óxidos de azufre del flujo de la mezcla gaseosa. El vapor de agua resultante es condensado y retenido por un agente desecante ( pentóxido de fó sforo) , posteriormente al proceso de reducción , donde procede un secado fino . Finalmente, la detección del nitrógeno se realiza con un detector de conductividad térmica el cual mide el nitrógeno total remanente en un flujo de gas transportador. En la metodología de Dumas, utilizando tecnología automatizada, el tiempo de análisis es de aproximadamente 7 minutos . Es un sistema cerrado ( el operario no está expuesto a éste) y no utiliza ácidos, por lo tanto no produce desechos peligrosos y no tiene riesgos operativos para el personal ( Etheridge et al . 1998, Cruz et al . 2007) . En vista que ambos métodos se aplican en el Laboratorio de Análisis Físico Químico del Instituto Nacional denutrición, se procedió a realizar una comparación entre ambos para determinar si existía una correlación significativa entre ambos métodos de análisis, para lo cual se evaluaron 24 muestras correspondientes a distintas matrices de alimentos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras evaluadas

 Papelón ( 1 ), harina de yuca ( 2 ), harina de cambur ( 3 ), harina de maíz precocida (4), arroz entero ( 5 ), pasta tipo spaghettis ( 6 ), descascarillado de cacao ( 7 ), harina de trigo ( 8 ), pasta tipo canelón ( 9 ), pasta tipo tallarines ( 10 ), bebida achocolatada (11), jamón endiablado ( 12 ), pasta tipo lasaña ( 13 ), licor de cacao ( 14 ), pasta tipo espiral ( 15 ), bebida con base en arroz ( 16 ), sardinas ( 17 ), caraotas ( 18 ), arvejas (19 ), leche en polvo completa Marca I ( 20 ), lentejas ( 21 ), leche en polvo completa Marca II ( 22 ), alimento para animales ( 23 ), polvo de cacao ( 24 ).

Métodos

La determinación del N total para las 24 muestras de alimentos se realizó por dos metodologías. ( 1 ) Método Kjeldahl número 2.062 de AOAC (AOAC 1984 ): digestión con ácido sulfúrico y posterior destilación y titulación con equipo semiautomático (Tecator 1.030). ( 2 ) Método de Dumas número 990.03 de AOAC (AOAC 2005 ) : combustión de las muestras a alta temperatura (900ºC) y posterior detección con un Detector de Conductividad Térmica (DCT), para lo cual se utilizó un analizador N elementar ( rapid N cube , Elementar Analysensysteme Gmbh , V3.4.3 . Hanau, Alemania ). El equipo fue calibrado utilizando un estándar de ácido L-aspártico al 98% de pureza (Sigma - Aldrich, Nº A9256) . El factor de conversión utilizado para obtener el porcentaje de proteína fue de 6,25; con excepción de las muestras de leche polvo donde se empleo 6,38 ( el factor permite transformar el porcentaje denitrógeno en porcentaje de proteínas presente en las muestras tomando en cuenta que la mayoría de las proteínas tienen 16% denitrógeno).

Pruebas e stadísticas

Las pruebas estadísticas se realizaron utilizando la función de análisis de datos en Microsoft Excel ® 2007 (Microsoft Corporation, Redmon, W.A.). El análisis de regresión se realizó para caracterizar el efecto del método Dumas como una función del método Kjeldahl para diferentes tipos de muestras. La repetitividad y reproducibilidad de las mediciones se determinaron mediante la evaluación estadística de la dispersión de los resultados obtenidos a través de un análisis de varianza (ANAVAR), tomando en cuenta las fuentes de variación, que incluían los efectos de los tipos de muestras, las replicas por día y sus interacciones .

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos para el porcentaje de proteínas por ambos métodos de análisis, se presentan en la Tabla 1. El método de Kjeldahl genera mayores desviaciones en el contenido de proteínas en las muestras de alimentos analizadas, en comparación con las obtenidas por el método de Dumas, lo que conduce a una mayor dispersión en los resultados. La dispersión generada por la aplicación del método de Kjeldahl, puede ser atribuida a que este procedimiento tiene un mayor número de factores y procesos, en donde el error humano y los procedimientos de pre-tratamiento de las muestras son puntos críticos y pueden generar un aumento o disminución en la dispersión de los resultados obtenidos. De igual manera las desviaciones son muy bajas para ambos métodos, presentando un máximo de 0,096 por el método Kjeldahl y 0,050 por el método automatizado, Dumas.

La Tabla 2 muestra el resumen estadístico del análisis de regresión de los datos del contenido de proteínas obtenido por ambos métodos sobre las mismas muestras. Para los cálculos los datos correspondientes al método de Dumas se han representado en el eje de las y; los obtenidos por el método de Kjeldahl en el eje x , por ser el método de referencia. Los resultados muestran que el valor del coeficiente de correlación múltiple es 0,99843. Es importante indicar que este cálculo se hace a sumiendo que los errores sistemáticos y aleatorios correspondientes al método Kjeldahl son despreciables.

 

El cálculo del análisis de varianza se presenta en la Tabla 3. De sus resultados se destaca el que la ordenada en el origen es de 0,1887 con límites de confianza (95%) inferior y superior de - 0,2222 y + 0,5995 respectivamente , este intervalo incluye el valor ideal de cero. La pendiente de la gráfica, llamada “Kjeldahl” debido a que este método representa el eje x , es 1,0276, con un intervalo de confianza ( 95% ) inferior y superior de 1,0021 a 1,0531; este intervalo es muy próximo a 1,0 que es el ideal. El contraste F aplicado sobre las sumas de los cuadrados es sumamente grande ( 6986,19 ) en comparación con el valor crítico ( 4,91E - 029 ) , lo cual indica la relación obvia entre los 2 métodos analíticos debido al promedio de los cuadrados de la regresión, el cual es mucho más grande que el promedio cuadrático de los residuales. En la Figura 1 se presenta la curva de regresión ajustada que indica que tanto el método Kjeldahl como el equipo N - elementar (método Dumas) presentan valores análogos denitrógeno.

El análisis realizado indica coeficientes de correlación y regresión próximos a la unidad, un error típico cercano a cero. La recta de regresión cuyas características son la de tener una intercepción cercana a cero y una pendiente a uno, lo cual indica que no existen diferencias significativas entre lo que reportan ambos métodos, por lo tanto, los puntos correspondientes a las mediciones realizadas por el método de Dumas están en torno de la recta ajustada de regresión, tal como puede observarse en la Figura 1 . Por otra parte, es importante destacar que los tiempos de análisis requeridos por el método de Dumas son significativamente menores que para Kjeldahl, además no requiere digestión con ácido sulfúrico, por lo tanto se puede considerar el método de Dumas como una alternativa para muestras de rutina en el laboratorio.

Algunos estudios reportados en la literatura llegan a la conclusión obtenida en esta investigación, en concordancia con la buena correlación que existe entre ambos métodos (Cruz et al . 2007, Reussi et al . 2008) . Tal es el caso de la investigación desarrollada por Simonne (1997), donde se evaluaron más de 100 tipos de muestras y se determinó que el método Dumas podía reemplazar al método Kjeldahl para la determinación denitrógeno total, entregando ambos métodos, un valor confiable denitrógeno total. Por otra parte, dependiendo de la muestra del alimento y del momento en que se realice el análisis la diferencia puede variar entre 1 a 3% favorable a Dumas. En otras palabras, si se realiza un análisis foliar y su resultado denitrógeno arroja un 2,5% con la metodología Dumas , en el peor de los casos, en Kjeldahl, se obtendría un 2,4% aproximadamente ( Simonne et al . 1997, Etheridge et al . 1998, Miller et al . 2007 ) .

CONCLUSIONES

No existen diferencias significativas entre los análisis realiza dos mediante el método Kjeldahl y el método de Dumas, lo que demuestra que ambos procedimientos entregan resultados denitrógeno total comparables para las diferentes matrices de muestras evaluadas . Tomando en cuenta que los análisis de determinación denitrógeno en el laboratorio de análisis físico químico del Instituto Nacional denutrición (así como en cualquier otro laboratorio de análisis de alimentos) son de orden rutinario , además de todas las ventajas expuestas en esta investigación, se recomienda emplear el método Dumas como una alternativa para determinación de proteínas totales empleando el factor de conversión adecuado para cada alimento.

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