Susceptibilidad in vitro a los antifúngicos de Candida sp. y serotipos de Candiduafra albicans aisladas de pacientes con vaginitis primaria y resurrente

Panizzo, María Mercedes; Pérez, Carmen y Maniscalchi, María Teresa.

Departamento de Micología, Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”, Caracas.

Trabajo ganador del Tercer Premio en las Jornadas Científicas del Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”, octubre de 1999.

Palabras-clave: Susceptibilidad, antifúngicos, vaginitis, Candida albicans, Candida sp.

Resumen

La resistencia de las levaduras a los agentes antifúngicos fue por muchos años un problema de poca importancia, pero recientemente se ha reportado un incremento en la resistencia a estas drogas, especialmente entre las especies de Candida no-albicans, las cuales, a su vez, aparecen con mayor frecuencia en pacientes con Candidosis Vulvovaginal Recurrente. Con el fin de establecer diferencias en la susceptibilidad a los antifúngicos de Candida albicans (serotipos A y B), C. no-albicans y entre los grupos de pacientes con Candidosis Vulvovaginal Primaria y Recurrente, se realizó un estudio con un grupo de cepas obtenidas de un trabajo previo sobre el tema, que además poseía un grupo control asintomático. Se obtuvieron resultados estadísticamente significativos en la respuesta al itraconazol y al fluconazol en las especies de C. no-albicans y en C. albicans, mostrando las primeras mayores porcentajes de resistencia. Los hallazgos para la susceptibilidad entre los distintos grupos de estudio y entre los serotipos de C. albicans no fueron estadísticamente significativos. Se sugiere que el cultivo, identificación y pruebas de susceptibilidad para las levaduras tienen importancia en el establecimiento de una terapia adecuada. Las pruebas de susceptibilidad in vitro demostraron estar adecuadamente estandarizadas. Es necesario hacer estudios con mayor cantidad de aislamientos en cada grupo y con datos precisos sobre el tratamiento previo.

Summary

The yeast resistance to the antifungical agents was for many years a low importance problem, but recently, it has been reported an increase of resistance to such drugs, specially between Candida no-albicans species, which appear with more frequency in Recurrent Vulvovaginal Candidosis patients. In order to establish the differences in the susceptibility of Candida albicans (A and B serotypes), and between the Primary and Recurrent Vulvovaginal Candidosis patient groups to the antifungicals, a study was done with a stock group obtained from a previous work about this matter, which one has additionally an asymptomatic control group. Statistically significant results were gotten in answer to itraconazol and fluconazol in C. no-albicans and C. albicans, showing the first higher percentages of resistance. The susceptibility between the different study groups and the C. albicans serotypes were not statistically significant. It is suggested that the culture, identification and susceptibility tests of the yeasts have a great importance in establishing an adequate therapy.

The in vitro susceptibility tests showed to be standardize adequately. It is necessary to make studies with a higher quantity of isolations in each group with more precise data about the previous treatment.

Introduccion

Las infecciones vaginales en las mujeres con vida sexual activa son una de las causas más frecuentes de consulta en ginecología. La secreción vaginal anormal y otros síntomas relacionados son manifestaciones comunes en estas pacientes (1,2,3).

La flora normal de la vagina sana es compleja; su composición cambia con una multitud de sucesos en la vida de la mujer, entre los que se incluyen cambios hormonales, actividad sexual, uso de anticonceptivos orales, presencia de dispositivos intrauterinos, antibioticoterapia por infecciones locales o a distancia, uso de drogas inmunosupresoras y ciertas enfermedades de base como la diabetes mellitus, todos ellos considerados como factores de riesgo en la aparición de sintomatología. (5, 6, 7).

En condiciones normales, los lactobacilos constituyen el elemento predominante de la flora vaginal y junto con otros organismos (especies de anaerobios, E. coli y otros coliformes, bacilos difteroides, etc) mantienen una compleja interrelación de equilibrio e inhiben en la mayor parte de las mujeres el sobrecrecimiento de otros organismos potencialmente patógenos. Cuando este equilibrio es alterado, los organismos patógenos (Candida sp., Gardnerella vaginalis, algunas bacterias anaerobias, etc) son capaces de proliferar para producir síntomas.

Aproximadamente el 20% de las pacientes que acuden a las consultas de ginecología y obstetricia tienen síntomas de trastorno inflamatorio de la vía genital (2, 8).

Entre las entidades clínicas más comunes y que comprenden más del 90% de los casos de trastornos inflamatorios de la vía genital están la candidosis vaginal, la vaginosis bacteriana y la tricomoniasis. Las dos primeras se disputan el primer lugar de frecuencia (2, 12).

Observaciones clínicas indican que algunas mujeres nunca desarrollan una Candidosis Vulvovaginal (CVV) sintomática, un segundo grupo sufre de episodios aislados y un tercer grupo padece episodios repetidos y a veces infección crónica. Se ha estimado que aproximadamente el 75% de todas las mujeres experimentan al menos un episodio de candidosis vaginal en su vida (16), y de éstas el 20% experimentan un episodio posterior (17).

La Candidosis Vulvovaginal Recurrente (CVVR), definida como cuatro o más episodios anuales, se presenta en al menos el 5% de las mujeres que han experimentado un episodio de Candidosis Vulvovaginal Primaria Esporádica (CVVPE) (18, 19).

Se ha venido observando en estudios recientes el aumento del número de aislamientos correspondientes a especies de Candida no-albicans como agentes etiológicos de vaginitis, particularmente en la CVVR. La importancia de realizar cultivo e identificación de los aislados radica en el hecho de que algunas especies de Candida son resistentes naturales a ciertos imidazoles, como por ejemplo C. krusei, que es resistente natural al fluconazol (20), mientras que otras levaduras como C. tropicalis y C. glabrata presentan una mayor resistencia a los azoles en general (20, 21). Se piensa que el uso previo de imidazoles, especialmente el fluconazol, podría efectuar una selección de estas especies resistentes, e incluso podría inducir a la aparición de cepas mutantes de C. albicans resistentes a la terapia (22). Debido a esto, nuestro objetivo es estudiar la sensibilidad in vitro a los antifúngicos de un grupo de aislados correspondientes a pacientes con CVVP y con CVVR previamente estudiadas (33).

Materiales y Metodos

Cepas: Se estudiaron un total de 33 cepas de C. albicans y C. no-albicans, mantenidas en agar Sabouraud Dextrosa (SDA), provenientes de pacientes de las consultas de ginecología de los hospitales José Gregorio Hernández, de los Magallanes de Catia, Caracas, y José María Vargas, de Caracas. Dieciséis (16) cepas fueron aisladas de pacientes con CVVP, de las cuales 11 corresponden a C. albicans (8 serotipo A y 3 serotipo B) y 5 a Candida no-albicans. Once (11) cepas fueron aisladas de pacientes con CVVR, de las cuales 7 corresponden a C. albicans (6 serotipo A y 1 serotipo B) y 4 a C. no-albicans. Por último, 6 cepas procedían de pacientes asintomáticas (grupo control), de las cuales 4 corresponden a C. albicans (3 serotipo A y 1 serotipo B) y 2 a C. no-albicans.

Como cepas control se usaron Candida albicans 3153A y Candida tropicalis CTR2 del Instituto Pasteur de París.

Pruebas de Susceptibilidad: Se estudió por medio de las siguientes metodologías:

1) Técnica semi-automatizada ATB Fungus (BioMérieux): Permite realizar un antifungigrama en un medio semisólido listo para su uso. Se determina la susceptibilidad a los antifúngicos en condiciones muy próximas al método de referencia (dilución en agar). La presentación en forma de galerías permite medir la respuesta a 5-fluorocitocina, anfotericina B, nistatina, miconazol, econazol y ketoconazol.

A partir de un cultivo de 24 horas en SDA, se prepara un inóculo en agua destilada estéril de turbidez correspondiente a 2 McFarland, utilizando para ello un densitómetro provisto por la casa comercial. De allí, siguiendo las instrucciones del fabricante, se procede a inocular las galerías.

Estas poseen 16 cúpulas: 2 de ellas no tienen antifúngico y corresponden al control de crecimiento; los otros pares contienen los diferentes antifúngicos a 2 concentraciones, lo que permite obtener los resultados por concentración inhibitoria mínima (CIM). Las galerías se incuban por 24 horas a 30ºC en cámara húmeda, y posteriormente se someten a la lectura por intermedio del lector automático ATB Expression, para obtener los resultados empleando el programa ATB Plus (VER Tabla 1)

Antifúngico	Sensible
5-fluorocitocina	2-32
Anfotericina	B 1-4
Nistatina	2-4
Miconazol	3-4
Econazol	4-4
Ketaconazol	5-4

Tabla 1. Valores de referencia ATB Fungus (µg/m)

2) Concentración inhibitoria mínima (CIM): Es un método de microdilución en placa, en el cual las concentraciones crecientes del antifúngico son incorporadas a un medio líquido. Esta técnica fue estandarizada en el Departamento de Micología del Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”, siguiendo la metodología del Instituto Pasteur de París (34). Se usó para determinar la respuesta a fluconazol e itraconazol, debido a que estos dos antimicóticos no están incluidos en la metodología anterior, a pesar de su uso frecuente en la clínica. Este ensayo permite comparar un gran número de cepas y antifúngicos (8 cepas diferentes pueden ser ensayadas por placa para un antifúngico: 7 cepas más un control de reproductibilidad interna).

Se preparan soluciones madre de fluconazol al 2% en agua destilada estéril y de itraconazol en dimetilsulfóxido. A partir de ellas se prepara una serie de diluciones, desde 640 µg/ml a 0,125 µg/ml, en agua destilada estéril. Las diferentes concentraciones son distribuidas de menor a mayor en una microplaca para pruebas de ELISA, a razón de 20 µl por cada pozo. Estas placas sensibilizadas con los antifúngicos se pueden conservar a –20ºC.

A partir de un cultivo de 24 horas en SDA, se preparó un inóculo en agua destilada estéril de turbidez correspondiente a 0,5 McFarland. De aquí se preparó una suspensión en medio líquido de Casitone y se procedió a su distribución en las microplacas previamente sensibilizadas con los antifúngicos. Tras incubación a 35ºC por 24-48 horas, se realizó la lectura en un espectrofotómetro para placas de ELISA a 492 nm. Se consideró el punto final como la más baja concentración de la droga que reduce el crecimiento en un 80% con referencia al control de crecimiento, y se incluyó en la placa un control negativo. La interpretación de los resultados de la sensibilidad se realizó según los valores de referencia.

Tabla 2. Valores de referencia CIM (µg/ml)

Antifúngico	Sensible	Intermedio	Resistente
Itraconazol Fluconazol	0,125 8	0,25-0,50 16-32	1 64

Análisis estadístico: Se realizó mediante la prueba exacta de Fischer, con el fin de establecer diferencias en las respuestas a los distintos antifúngicos entre las cepas y entre los grupos de estudio.

Resultados

Para 5-fluorocitocina se observó que la mayoría de las cepas, tanto C. albicans como C. noalbicans, responden bien a la droga. La aparición de cepas resistentes de C. albicans se observó en los tres grupos de estudio, con un 25% para el grupo de asintomáticas, 18,2% para el grupo de CVVPE y 25% para el grupo de CVVR. Para las cepas de C. no-albicans la resistencia estuvo ausente en el grupo de asintomáticas, aparece en el grupo de CVVPE con un 20% y se incrementa en el grupo de CVVR, con un 25%. Las cepas de C. no-albicans que mostraron mayor porcentaje de resistencia a esta droga fueron: C. tropicalis (20% en el grupo de CVVPE) y C. torulopsis (25% en el grupo de CVVR). En cuanto a la respuesta de los serotipos de C. albicans según los grupos de estudio, se observó que en el grupo de asintomáticas el serotipo A fue 100% sensible y el serotipo B 100% resistente. En el grupo de CVVPE, la sensibilidad de ambos serotipos fue semejante (A: 87,5% y B: 66,7%) y en el grupo de CVVR el serotipo A presentó una sensibilidad de 83,3% y el serotipo B de 100%. Se obtuvieron cepas resistentes del serotipo A tanto en el grupo de CVVPE (12,5%) como en el de CVVR (16,7%) y cepas resistentes del serotipo B sólo en el grupo de CVVPE (33,3%).

No se presentaron cepas resistentes para anfotericina B ni en el grupo de asintomáticas ni en el grupo de CVVPE, apareciendo un 33,3% de cepas resistentes de C. albicans en el grupo de CVVR, todas ellas correspondientes al serotipo A. Para la nistatina se obtuvo una excelente respuesta por parte de las cepas de C. albicans y C. noalbicans en los tres grupos de estudio, observándose solamente un 9,1% de cepas resistentes de C. albicans en el grupo de CVVPE, siendo éstas pertenecientes al serotipo A.

En cuanto al miconazol, se observó que las cepas de C. albicans y C. no-albicans provenientes de pacientes asintomáticas fueron sensibles, mientras que en los grupos de CVVPE y CVVR aparecen cepas resistentes de C. albicans (36,4 y 42,8%, respectivamente). Los serotipos de C. albicans fueron 100% sensibles a esta droga en el grupo de asintomáticas, observándose resistencia de ambos en el grupo de CVVPE (25% serotipo A y 66,7% serotipo B) y sólo del serotipo A (33,3%) en el grupo de CVVR.

Para el econazol, se obtuvo un 50% de cepas resistentes de C. no-albicans en el grupo de asintomáticas (correspondientes a C. guilliermondii). En los grupos de CVVPE y CVVR, las cepas resistentes correspondieron a C. albicans (36,4 y 42,8%, respectivamente). Los serotipos de C. albicans fueron sensibles en el grupo de asintomáticas, apareciendo cepas resistentes del serotipo A (25%) y del serotipo B (66,7%) en el grupo de CVVPE y del serotipo A (33,3%) en el grupo de CVVR.

Para el ketoconazol se observó un 50% de resistencia de C. no-albicans en el grupo de asintomáticas y un 20% de resistencia en el grupo de CVVPE, mientras que para C. albicans el porcentaje de resistencia fue de 45,5% en el grupo de CVVPE y de 57,2% en el grupo de CVVR.

Del grupo de C. no-albicans, C. guilliermondii presentó 50% de resistencia en el grupo de asintomáticas y C. tropicalis tuvo un 25% de resistencia en el grupo de CVVPE. En relación a los serotipos de C. albicans, se observó que ambos serotipos fueron sensibles en el grupo de asintomáticas, apareciendo cepas resistentes de ambos serotipos en los grupos de CVVPE (37,5% serotipo A y 66,7% serotipo B) y CVVR (50% serotipo A y 100% serotipo B).

En cuanto al itraconazol, se observó que C. albicans fue sensible en los grupos de asintomáticas y CVVPE, presentando un 14,3% de resistencia en el grupo de CVVR, mientras que C. no-albicans fue altamente resistente en los tres grupos, con 100% en las asintomáticas, 60% en CVVPE y 100% en CVVR (VER GRÁFICO 1). En relación a los serotipos de C. albicans, ambos fueron sensibles en los grupos de asintomáticas y CVVPE; en cambio, el serotipo A presentó un 16,7% de resistencia en el grupo de CVVR.

Grafico 1. Susceptibilidad a itraconazol

Para el fluconazol se obtuvo amplia sensibilidad de C. albicans en los tres grupos estudiados, mientras que C. no-albicans mostró una resistencia del 50% en el grupo de asintomáticas, 20% en CVVPE y totalmente resistentes en el grupo de CVVR (VER GRÁFICO 2). Ambos serotipos de C. albicans fueron sensibles a esta droga en los tres grupos estudiados. De las cepas de C. noalbicans estudiadas, C. torulopsis mostró un 36% de resistencia a la droga, mientras que C. tropicalis y C. glabrata presentaron un 9,1% de resistencia a la misma.

Grafico 2. Susceptibilidad a fluconazol

Los resultados obtenidos para 5-fluorocitocina, anfotericina B, nistatina, miconazol, econazol y ketoconazol no arrojaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de estudio ni entre las cepas estudiadas, mientras que para itraconazol y fluconazol sí se encontraron diferencias estadísticamente significativas, tanto entre los grupos de estudio como entre las cepas estudiadas. Para los serotipos de C. albicans no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de estudio ni entre ambos serotipos.

Del grupo de pacientes con CVVPE (16 pacientes) se tenía información del tratamiento previo de 5 de ellas, de las cuales solamente de una paciente (previamente tratada con ketoconazol) se aisló una cepa de C. albicans serotipo A, resistente a todas las drogas ensayadas. Las cuatro pacientes restantes fueron tratadas con distintos antifúngicos, y de ellas se aislaron tres cepas de C. albicans serotipo A y una serotipo B, todas con resistencia a una o varias drogas, sin que se encontrara relación entre el tratamiento previo y el antifungigrama.

Del grupo de pacientes con CVVR (11 pacientes), se tenía información de tratamiento previo en 8 de ellas, de las cuales solamente de una, previamente tratada con isoconazol, se aisló una cepa de C. albicans serotipo A sensible a todas las drogas ensayadas. Las siete restantes fueron tratadas con distintos antifúngicos, y de ellas se aislaron cinco cepas de C. albicans serotipo A y una serotipo B, además de una cepa de C. tropicalis, todas ellas resistentes a una o varias drogas.

Sólo en la cepa de C. tropicalis se encontró relación entre el tratamiento previo con fluconazol (150 mg/día por tres semanas) y la resistencia presentada tanto a fluconazol como a itraconazol.

Discusion

En el presente estudio, la aplicación de las pruebas de susceptibilidad in vitro nos ha permitido conocer la respuesta de un grupo de especies de Candida procedentes de pacientes con CVV y de un grupo control asintomático. Recientemente se ha venido reportando un incremento en la resistencia a las drogas antifúngicas, no sólo por parte de las especies de Candida no-albicans, muchas de las cuales responden mal o presentan una resistencia natural al tratamiento con los azoles, sino incluso en aislados de Candida albicans (26, 30). En la CCV es cada vez más frecuente el aislamiento de estas especies de C. no-albicans, especialmente en la CVVR, lo que explicaría en parte el fracaso observado en el tratamiento de estas pacientes (9). Aunque las pruebas de susceptibilidad in vitro eran sólo ocasionalmente utilizadas hasta hace una década, se están realizando numerosos esfuerzos para su uso y estandarización, ya que podrían servir de guía al momento de seleccionar una terapia apropiada (25).

Aunque la anfotericina B y la 5-fluorocitocina no se usan en el tratamiento de la CVV, los resultados obtenidos concuerdan con los que se presentan en el tratamiento de la candidosis sistémica, donde la anfotericina B sigue siendo la droga de elección, mientras que la 5-fluorocitocina, genera un mayor porcentaje de resistencia (23, 24), lo cual se considera un evento común entre levaduras patógenas (26). La excelente respuesta a la nistatina podría constituir una alternativa terapéutica a considerar, debido a su bajo costo, uso tópico y ausencia de efectos colaterales.

En cuanto a los azoles, los importantes porcentajes de resistencia obtenidos para miconazol, econazol y ketoconazol en todos los grupos y en todas las cepas aconsejarían realizar pruebas de susceptibilidad previas a la indicación de estos agentes en la CVV. De estos tres azoles, la resistencia al ketoconazol es la que más se reporta en la literatura, quizá por haber sido una de las primeras drogas de este grupo en aparecer en el mercado (21).

Se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas en la susceptibilidad para las cepas ensayadas al itraconazol y fluconazol, mostrando una mayor resistencia para estos agentes las cepas correspondientes a las distintas especies de C. no-albicans, especialmente C. torulopsis. No se dispone de suficiente información sobre la susceptibilidad al itraconazol en el tratamiento de afecciones producidas por Candida, ya que, en general, el fluconazol constituye la terapia de elección en estos casos, pero en un estudio realizado sobre la susceptibilidad in vitro al itraconazol en cepas de C. albicans procedentes de pacientes con CVVR se encontró un rango de 94-99% de susceptibilidad (30), mientras que en el presente estudio ese porcentaje para el mismo fue menor (85,7%). No se encontraron referencias sobre la resistencia al itraconazol en levaduras, pero, dados los altos porcentajes de resistencia para esta droga mostrados por las cepas de C. noalbicans (60-100%), su uso no sería aconsejable en presencia de tales agentes etiológicos, aunque habría sido útil en el caso de C. albicans.

El fluconazol resultó ser una droga excelente para las cepas de C. albicans, pero no resultó así para las cepas de C. no-albicans, especialmente para el grupo de CVVR, que mostró un 100% de resistencia. La resistencia al fluconazol entre las distintas especies de Candida comenzó a ser reportada en la literatura poco después de la aparición de éste antifúngico. Mientras que para C. albicans se reportaban altas CIM, que ameritaban la administración de altas dosis de la droga en cuestión, para las distintas especies de C. no-albicans se reportaban algunos casos con resistencia natural al medicamento, como C. krusei, o con sensibilidad disminuida, como en los casos de C. glabrata y C. parapsilopsis (25, 32). En el presente estudio, el mayor porcentaje de resistencia lo presentó C. torulopsis; por lo tanto, el fluconazol habría sido la droga de elección sólo en los casos de CVV por C. albicans, pero no en la CVV causada por C. no-albicans. El hecho de que estas especies estén aumentando su frecuencia como causas de CVVR, y que el fluconazol sea ampliamente utilizado en estos casos, podría ser la causa del fracaso terapéutico a repetición observado en esta entidad, sobre todo teniendo en cuenta el uso de dosis únicas, que, si bien eliminan los síntomas, no son capaces de producir una curación microbiológica ni clínica completa.

En relación a los serotipos de C. albicans, en estudios anteriores se ha reportado que el serotipo A es más sensible que el serotipo B a los diferentes antifúngicos (14), resultados que concuerdan con los del presente trabajo. Llaman la atención los resultados obtenidos en la susceptibilidad a todos los antifúngicos ensayados, donde ambos serotipos son sensibles en el grupo de asintomáticas y luego aparecen cepas resistentes de ambos serotipos en los grupos de CVVP y CVVR, lo cual podría explicar la hipótesis de que en el paso de comensal a patógeno se producen ciertos cambios fenotípicos, que podrían tener consecuencias en lo que a respuesta a drogas se refiere (16, 29).

El análisis de los resultados obtenidos en este estudio nos lleva a reforzar la idea de que cada vez se hace más necesario el cultivo e identificación de las especies de Candida que actúan como agentes etiológicos de la CVV, tanto primaria como recurrente, ya que el conocimiento de la especie causal puede tener implicaciones terapéuticas. Por otra parte, la coincidencia entre los resultados in vitro obtenidos en el presente estudio para la susceptibilidad a los distintos antifúngicos y lo reportado por otras investigaciones sobre el mismo particular, nos orienta a pensar que las técnicas utilizadas están bien estandarizadas.

Por último, poseemos pocos datos en lo que respecta al tratamiento previo de las pacientes, por lo cual no se pudo establecer una relación entre el tratamiento previo y la aparición posterior de resistencia. Sería recomendable realizar más estudios en este sentido, para explicar la existencia o no de tal relación.

Conclusiones y Recomendaciones

1) El cultivo e identificación de las cepas de Candida, así como la posterior realización de pruebas de susceptibilidad, deben ser tomados en cuenta para el establecimiento de una terapéutica adecuada, sobre todo cuando se presentan aislamientos de C. no-albicans.

2) Las pruebas de susceptibilidad in vitro utilizadas ofrecen resultados comparables a los reportados por otros autores; por lo tanto, se presume su adecuada estandarización. Además, son de fácil uso y tienen buena relación costo/beneficio.

3) Es necesario realizar estudios similares con un mayor número de cepas para cada grupo de estudio, con el fin de aumentar las posibilidades de obtener diferencias estadísticamente significativas.

4) Es recomendable obtener mayor información sobre el tratamiento previo de las pacientes y sobre el número de episodios de candidosis sufridos, con la finalidad de establecer si existe o no relación con la posterior aparición de resistencia.

Agradecimientos

Al personal profesional del Departamento de Micología del Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”, muy especialmente a la Dra. Vera Reviákina, por la asesoría y colaboración en la realización de este estudio.

Referencias Bibliograficas

1. Martens, M. G.: Diagnóstico de Enfermedades de Transmisión Sexual en el Consultorio. Clin. Obst. Gin. 3:649-667, 1989.

2. Sobel, J. D.: Infecciones Vaginales en Adultas. Clin. Med. North Am. 74(6): 1637-1649, 1990.

3. Porto, A. G. y Estévez, M.: Vulvovaginitis. Rev. Bras. Med. 49 (Edição Especial): 95-106, 1992.

4. Mard, P. A.: The Vaginal Ecosystem. Am. J. Obstet. Gynecol. 165(4): 1163-1167, 1991.

5. Hammill, H. A.: Flora Vaginal Normal en Relación con Vaginitis. Clin. Obst. Gin. 16(2): 317- 324, 1989.

6. Koneman, E. W. et al.: Micología. En: Diagnóstico Microbiológico. 3ra. Ed, Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. 656-717, 1992.

7. Larsen, B.: Flora Vaginal Fisiológica y Patológica. Clin. Obst. Gin. 36: 105-106, 1993.

8. Kaufman, R. and Favio, S.: Bening Disease of the Vulva and Vagina. Candida. 4th. ed. 321- 337, 1994.

9. Fleury, F.: Adult Vaginitis. Clin. Obstet. Gynecol. 24: 407-438, 1981.

10. Fernández-Cid, A. y López, L.: Citopatología Ginecológica y Mamaria. 2da ed. Ediciones Científicas y Técnicas S.A. Barcelona, España. p.p.563, 1993.

11. Pinto, N. A. et al.: Infecção Genital Baixa. Rev. Bras. Clin. Terap. 21(6): 219-224, 1992.

12. Goode, M. A. et al.: Infectious Vaginitis. Selecting Therapy and Preventing Recurrence. (Abs.) Postgrad. Med. 96(6): 85-88, 91-98, 1994.

13. Perea, E. J.: Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Vol: II. Ediciones Doyman S.A. Barcelona España, 1992.

14. Mendoza, M. et al.: Serotipificación de 48 Aislados de Candida albicans: Predominio del Serotipo A sobre el Serotipo B en Venezuela. Inv. Clin. 33 (1): 33-37, 1992.

15. Barturen, B. et al.: Distribución de los Serotipos de Candida albicans en Aislamientos Clínicos de Personas Inmnocompetentes e Inmunodeprimidas. Rev. Ibero. Micol. 13:10-13, 1996.

16. Sobel J. D.: Pathogenesis and Epidemiology of Vulvovaginal Candidiasis. Ann. N.Y. Acad. Sciens. 547-557, 1996.

17. Vásquez, J. A. et al.: Kariotiping of C. albicans Isolates Obtained Longitudinally in Women with Recurrent Vulvovaginal Candidiasis. J. Infect. Dis. 170: 1566-1569, 1994.

18. Fleury, F. J.: Recurrent Candida Vulvovaginitis. Chemotherapy. 28 (suppl. 1): 48-50, 1982.

19. Andriole, V. T. and Wiernik, P. H.: Inmunologic Pathogenesic of Recurrent Vulvovaginal Candidiasis. Clin. Guid. Fung. Infect. 6(1): 1-8, 1994.

20. Nyirjesy, P. et al.: Cronic Fungal Vaginitis: the Value of Cultures. Am. J. Obstet. Gynecol. 173(3) part 1: 820-823, 1994.

21. Powderly, W. G.: Resistant Candidiasis. AIDS Res. Hum. Retrovir. 10(8): 925-929, 1994.

22. Johnson, E. M. et al: In vitro Resistance to Imidazole Antifungal in Candida albicans. J. Antimicrob. Chemother. 13: 547-558, 1984.

23. Kerridge, D.: Mode of action in clinically important antifungal drugs. Adv Microb Physiol 27: 1- 72, 1966.

24. San Blas, G.: Antibioticos Antifúngicos: Hacia la búsqueda de antibióticos selectivos. Rev Iberoam Micol 8: 24-34, 1991.

25. Rex, J. H. et al.: Resistance of Candida Especies to Fluconazole. Antimicrob. Agent. Chemother. 39(1): 1-8, 1995.

26. Odds, F.C.: Resistance of Clinically Important Yeast to Antifungal Agents. Inter. J. Antimicrob. Agent. 6:145-147, 1996.

27. Reviákina, V. et al.: Infecciones por Levaduras: Diagnóstico Clínico y de Laboratorio. Instituto Nacional de Higiene ‘Rafael Rangel’. M.S.A.S. 1997.

28. Rex, J. H. et al.: Development of Interpretive Breakpoints for Antifungal Susceptibility Testing: Conceptual Framework and Analysis of In Vitro-In Vivo Correlation Data for Fluconazole, Itraconazole and Candida Infections. Clin. Infect. Dis. 24: 235-247, 1997.

29. Torres-Rodríguez, J.: Factores de patogenicidad en Candida. Rev Iberoam Micol 2(7), 1993.

30. M. E. Lynch, J. et al.: Role of antifungal drug resistance in the pathogenesis of recurrent vulvovaginal candidiasis. J Med Vet Mycol 34: 337-339, 1996.

31. Goff, Debra A.: Isolation of Fluconazole-Resistant Candida albicans from Human Immunodeficiency Virus-Negative Patients Never Treated with Azoles. Clin Infect Dis 20: 77-83, 1995.

32. Dupont, Bertrand.: Azole antifungal Agents: Emerging and inherent resistance. Clin. Infect.Dis. 8: 424-427, 1995.

33. Guzmán, M., Pérez, C. et al.: Etiología de la Vaginitis Primaria y Recurrente. Importancia de varias especies del género Candida y serotipos de Candida albicans. Boletín Informativo Las Micosis en Venezuela. Nº 31-32, Año XII Enero-Diciembre, 1998. Trabajo presentado en la XLVII Convención Anual de la AsoVac. Noviembre, 1997.

34. Drouheet, E., Dupont, B., Improvisi, L., Viviani, M.A., Tortorano, A.M.: Disc agar diffusion and microplate automatized technics for in vitro evaluation of antifungal agents on yeasts and sporulated pathogenic fungi. Elseviers Science publishers. Japan, 31-47, 1986.