Comparación de cuatro técnicas de laboratorio para el diagnóstico de estrongiloidiasis.

Comparison of four laboratory techniques for the diagnosis of strongyloidiasis.

Ribero, Z.; Chourio, G.; Díaz, I.; Padilla, L.; Zárate, M. y Ferrer, J.
Facultad de Midicina, Escuela de Bioanálisis, La Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela.

Resumen

La estrongiloidiasis es una infección parasitaria que produce cuadros digestivos o generalizados que tienden a complicarse en algunos pacientes, particularmente en los inmunocomprometidos, por lo que un diagnóstico temprano de la infección es sumamente importante. Los métodos de diagnóstico convencionales presentan bajos índices de detección de este parásito; por este motivo, el objeto de la presente investigación es discriminar la técnica más sensible y específica para detectar en heces Strongyloides stercoralis. Se analizaron las muestras fecales de 56 individuos de ambos sexos, con edades comprendidas entre 1 y 47 años, quienes residían en un área endémica para S. stercoralis, ubicada en Puerto Páez, parroquia Potreritos del municipio La Cañada del estado Zulia, Venezuela. Cada muestra fue sometida al examen directo con solución salina fisiológica y lugol, método de concentración de formol-éter, técnica de Baermann y cultivo de agar en placa de Arakaki modificado. Los resultados se analizaron estadísticamente con el programa Statistix, versión 2.02. La prueba de z determinó la diferencia de las proporciones. De los 56 individuos, 18 (32%) presentaron S. stercoralis por al menos una de las técnicas utilizadas. Al comparar las técnicas entre sí, el método de agar en placa fue el que detectó la mayoría de los casos: 16, siguiéndole el método de concentración de formol-éter, con 11 casos.

Posteriormente, el examen directo, con 9 casos y, finalmente, la técnica de Baermann, con 7 casos. No se encontró diferencia significativa entre la técnica de agar en placa y el método de concentración de formol-eter, pero sí entre éstos y el resto de las técnicas estudiadas.

Palabras-clave: Strongyloides stercoralis, diagnóstico de laboratorio, cultivo de agar en placa.

Abstract

The Strongyloidiasis is a parasite infection which produces digestive or generalized symptoms tending to get complicated in some patients, particularly in those immunocompromised, therefore an early diagnosis of the infection is really important. Conventional diagnosis methods show low detection levels of this parasite, that is why to discriminate the more sensitive and specific technique to detect Strongyloides stercoralis in feces is the goal of this research study. Fecal samples from 56 both sex, ages between 1 and 47 years old individuals living in an endemic area for S. stercoralis located in Puerto Páez, parroquia Potreritos of the municipio La Cañada of the Zulia state, Venezuela, were analyzed. Each sample was directly tested using physiological saline solution and lugol, the ether-formol concentration method, Baermann technique and the agar plate culture from modified Arakaki, were also used. Results were statistically analyzed through version 2.02 Statistix program and the z test determined the difference of proportions. 18 (32%) of 56 individuals showed S. stercoralis according at least one of the techniques used. Comparing techniques, the agar plate method detected the higher percentage of cases: 16, followed by 11 cases through the ether-formol concentration method, then 9 cases through direct test and 7 cases through Baermann technique finally. No significant difference was found between the agar plate culture technique and the ether-formol concentration method, but it was found between these and the other techniques studied.

Introducción

La estrongiloidiasis es la infección humana producida por Strongyloides stercoralis, parásito común en las zonas tropicales y subtropicales, que provoca un cuadro digestivo o generalizado, de curso generalmente crónico y pronóstico variable. S. stercoralis es un nemátodo filiforme muy pequeño, que presenta dimorfismo sexual, con un ciclo biológico en el cual se alternan generaciones de vida libre y de vida parasitaria.

Los síntomas más comunes de la infección intestinal por S. stercoralis son: dolor abdominal, especialmente epigástrico, o bien de todo el abdomen, con carácter cólico, diarrea, náuseas y vómitos. En infecciones intestinales severas, y debido a la enteritis ulcerativa producida por el parásito, se puede llegar a un síndrome de malabsorción, con grave trastorno en la absorción de grasas, vitaminas liposolubles y otros principios esenciales de la dieta, con deposiciones esteatorreicas y compromiso progresivo del estado general (1).

En la estrongiloidiasis humana se produce con frecuencia autoinfección, y este fenómeno es el responsable de la larga duración de la parasitosis en algunos individuos. Los mecanismos inmunitarios del hospedero y los reproductores del parásito mantienen un equilibrio, de forma que ninguno de ellos se afecta gravemente. En circunstancias en que se altera la inmunidad celular (Ej.: VIH) y en afecciones como la malnutrición proteico-calórica, la lepra lepromatosa, cáncer, quemaduras graves, irradiación y cirrosis, se destruye este equilibrio y la infección prolifera. Hay, además, producción de un número masivo de larvas que penetran en todas las partes del cuerpo (2).

Toda la patología y complicaciones causadas por el parásito en el humano inducen al diagnóstico temprano de la infección, lo cual, a su vez, se traduce en la necesidad de técnicas muy sensibles y especificas que permitan detectar fácilmente la presencia de las larvas de S. stercoralis en la muestra de heces, con el fin de poder aplicar el tratamiento antiparasitario adecuado, y asimismo exámenes post-tratamiento confiables, para confirmar la erradicación del parásito.

Los exámenes parasitológicos rutinarios que se realizan en el laboratorio orientan hacia la presencia de larvas rabditoides (eventualmente larvas filariformes), y generalmente comprenden técnicas de fácil realización, como el examen directo de heces frescas con solución salina fisiológica al 0,85% y lugol (3); lamentablemente, este examen tiene escaso poder de recuperación para las larvas. Los métodos de concentración de heces, particularmente el de Ritchie, permiten una recuperación mayor.

Se han descrito técnicas mas sensibles y específicas para su diagnóstico, como la técnica de Baermann (4), método de sedimentación espontánea que aprovecha el termotropismo positivo y geotropismo negativo de las larvas de S. stercoralis para su recuperación a partir de la muestra fecal. La implementación del cultivo en placa de agar propuesto por Arakaki y cols.(5) surge como un procedimiento diagnóstico sencillo y cuyos resultados en relación al aislamiento de larvas es mayor. Se han descrito por lo menos tres tipos de cultivos para Strongyloides: cultivos en agar nutritivo, cultivos en agar no nutritivo y cultivo en papel de filtro, los cuales se incuban durante dos días entre 30 y 35ºC. Los más eficaces han sido los que utilizan agar nutritivo o agar no nutritivo, que permiten descubrir hasta 4 larvas en dos gramos de materia fecal (6).

El objetivo general de esta investigación es comparar la eficacia de tres (3) de las técnicas tradicionalmente usadas en nuestro medio con el cultivo de agar en placa para el diagnóstico de laboratorio de la estrongiloidiasis.

Materiales y Métodos

Nivel y diseño de la investigación.
La presente investigación es de tipo prospectivo, descriptivo y de campo .

Población bajo estudio.
Se estudiaron 56 individuos de ambos sexos y diferentes edades (1-47 años), los cuales habitan en Puerto Páez, comunidad ubicada al sur de la parroquia Potreritos, municipio La Cañada de Urdaneta, estado Zulia, Venezuela; zona de tierras bajas ubicadas en las riberas del Lago de Maracaibo. Predominan las temperaturas elevadas todo el año; la media anual es 26,9ºC y la media anual de precipitación es de 1.310 mm2. La principal formación hidrográfica es el Lago de Maracaibo, además del río Palmar. La vegetación es de tipo bosque seco tropical. Algunos habitantes disponen de agua potable por tuberías y los demás servicios no los poseen. Los habitantes de Puerto Páez viven en un alto grado de pobreza, con malos hábitos higiénicos, deficiencias sanitarias y hacinamiento (7). Esta comunidad fue elegida para el estudio, en virtud de que es reconocida como una población endémica para S. stercoralis; lo cual fue confirmado en una investigación preliminar efectuada en esa zona en el año 1995 (8).

Metodología de laboratorio.
Los individuos fueron informados del estudio y voluntariamente aportaron una muestra de heces en envases recolectores de orina (para recuperar una mayor cantidad de muestra), los cuales fueron debidamente identificados y se colocaron en una cava de anime con hielo para luego ser trasladados al laboratorio de Parasitología, ubicado en la Escuela de Bioanálisis, Facultad de Medicina de LaUniversidad del Zulia (LUZ), Maracaibo.

Cada muestra fecal fue sometida a las siguientes técnicas:
· Examen directo con solución salina fisiológica al 0,85% y lugol (ED)(3), utilizando 2 mg de heces para cada emulsión.
· Método de concentración con formol-éter, conocido como concentrado de Ritchie (CR)(9), utilizando aprox. 2 g de heces en su preparación.
· Método de Baermann (MB)(9), utilizando 3-4 g en su elaboración.
· Método de agar en placa modificado (AP), según Arakaki y cols.(5), utilizando aprox. 2 g de heces.

Análisis estadístico.
Los resultados obtenidos se expresaron en números y porcentajes (%), para la elaboración de las tablas. Para determinar si existía diferencia significativa entre la eficacia de las técnicas estudiadas, se determinó la razón de eficacia (dividiendo el número de casos positivos por determinada técnica entre el número total de casos de estrongiloidiasis detectados) y posteriormente se enfrentaron dichas razones por pareja de técnicas, en una matriz de comparaciones, finalmente, se aplicó la prueba "z" para diferencia de dos proporciones. El análisis estadístico fue efectuado utilizando el programa STATISTIX, versión 1.0 para Windows 95.

Resultados

De los 56 individuos analizados coproparasitológicamente, 18 presentaron S. stercoralis por al menos una de las técnicas efectuadas, como puede observarse en la tabla 1.

Tabla 1. Prevalencia general de S.stercoralis en la comunidad de Puerto Páez, municipio La Cañada de Urdaneta, estado Zulia, Venezuela, 2002.

La tabla 2 presenta los casos detectados por cada una de las técnicas realizadas en el estudio, donde se aprecia que el método de AP permitió diagnosticar el mayor número de casos de estrongiloidiasis (16), seguido por el CR (11), el ED (9) y, finalmente, el MB (7). .A través del método de AP todas las larvas recuperadas fueron identificadas como larvas rabditoides de S. stercoralis (algunas un poco más desarrolladas que otras); no se obtuvieron formas filariformes ni adultos de esa especie ni de otras especies parasitarias. La prueba de "z" demostró diferencia significativa entre la técnica de AP y CR con respecto a ED y el MB; las otras comparaciones resultaron no significativas. Ver tabla 3.

Tabla 2. Número de casos de estrongiloidiasis detectados por cada una de las técnicas utilizadas.

Tabla 3. Matriz de comparaciones por parejas mediante la prueba de z para las cuatro técnicas de diagnóstico.

En la tabla 4 se presenta la congruencia existente entre los resultados macroscópicos y microscópicos de la técnica de AP; donde se aprecia que en la mayoría de los casos el aspecto macroscópico negativo se corresponde con una observación microscópica negativa (40 casos); detectándose pocos casos macroscópicamente negativos (sin caminos en el agar) que presentasen larvas observables macroscópicamente (3 casos). En el mismo cuadro se evidencia que en un elevado porcentaje se corresponde la presencia de caminos larvarios con la demostración microscópica de larvas de helmintos, particularmente S. stercoralis (13 casos).La figura 1 analiza los 18 casos positivos por cada método para detectar la presencia de S. stercoralis, donde se evidencia que sólo 7 casos fueron positivos a través de las cuatro técnicas usadas; 6 casos fueron positivos sólo por AP, 1 caso sólo por ED y 1 caso sólo por CR. La técnica de MB no demostró en forma aislada ningún caso de S. stercoralis.

Tabla 4.Resultados obtenidos a través de la visualización macroscópica y microscópica de la técnica de agar en placa.

Las figuras 2 y 3 muestran diferentes imágenes de los resultados microscópicos obtenidos en el método de AP.

Figura 1. Análisis de los 18 casos de estrongiloidiasis por los cuatro métodos utilizados.

Figura 2. Larvas de S.stercoralis en los bordes de la muestra fecal en el agar en placa, vistas al microscopio con objetivo de 40X

Figura 3. Caminos dejados en el agar por una larva de S.stercoralis, vistas al microscopio con objetivo de 40X.

Discusión

Los resultados del presente estudio muestran que el promedio de detección de S. stercoralis en muestras de heces por el cultivo de agar en placa es similar al obtenido cuando se utiliza el método de Ritchie (CR). La alta sensibilidad que la técnica de AP ofrece ayudaría a efectuar diagnósticos tempranos y precisos para prevenir la estrongiloidiasis diseminada que puede ocurrir en pacientes inmunocomprometidos o inmunosuprimidos.

Múltiples investigaciones apoyan esta teoría (10-15); particularmente Moustafa y cols. (16) quienes evaluaron el método modificado de agar en placa en Egipto y describen que éste es más efectivo que los métodos tradicionales en el diagnóstico de la estrongiloidiasis. Iwamoto y cols (17) reportan el diagnóstico de larva currens en Japón, en base a los resultados del agar en placa. Koga y cols (18) consideran el método de AP superior al del cultivo en papel de filtro (Harada Mori) y examen directo en el diagnóstico de S. stercoralis.

A pesar de que la técnica de AP detectó 16/18 casos de estrongiloidiasis y el CR detectó 11/18 casos; la prueba de "z" demostró que la técnica de AP fue tan efectiva como el CR, al no haber diferencia significativa entre ellas; pero sí entre ellas y el ED y MB. Un dato resaltante fue la baja efectividad del MB, aunque no podemos obviar el hecho de que la cantidad de heces recomendada para efectuar el método varía entre 3-10 g (4,11,19) y en la presente investigación, por dificultades en la obtención de una mayor cantidad de heces utilizamos 3-4 g, lo cual invariablemente pudo influenciar en la baja sensibilidad. De hecho, uno de los principales inconvenientes de esta técnica es la necesidad de una gran cantidad de heces para su elaboración. En cuanto a la relación precio/efectividad, la necesidad de más reactivos y aparatos (en comparación al examen directo) para realizar las técnicas de CR y MB influyen en la poca realización de los mismos en los laboratorios de la región. Probablemente para los laboratorios pequeños no se justificaría la utilización del AP, debido al elevado costo que significa para ellos preparar medios de cultivo; sin embargo, la realización del AP se hace más accesible en aquellos laboratorios que ya poseen el área de Bacteriología, donde se preparan placas de agar nutritivo que pueden ser utilizadas para el descarte de estrongiloidiasis en pacientes sospechosos. Es conveniente destacar que el costo de una placa de agar nutritivo (preparación, reactivos, esterilización, etc) no es mayor que el de otros medios utilizados en el área de Bacteriología.

En esta investigación se presentaron dos casos que fueron positivos por otras técnicas, mas resultaron negativos por el AP. Uno de ellos resultó positivo únicamente por el ED, donde microscópicamente sólo se observaron larvas muertas. Sospechamos que el AP falló en esta ocasión, debido a que para mostrar positividad deben existir larvas vivas en las heces, capaces de moverse. El segundo caso fue positivo sólo en el CR y, en vista de que el formol inmoviliza las larvas, no podemos inferir si las larvas estaban vivas o no en la muestra.

Surkhavat y cols (14) reportan en su investigación que las muestras que resultaron negativas por la técnica de AP, fueron positivas por el método de CR y, aunque ellos no dieron explicación a este fenómeno, pensamos que esto se debe a que el método de AP depende de la viabilidad de las larvas. Todo esto nos permite aconsejar que la muestra de heces para realizar la técnica de AP sea lo más fresca posible, para así poder asegurar la confiabilidad de los resultados; debemos recordar que la alta temperatura y la desecación provocan la muerte de las larvas (20).

Tomando en cuenta que la posibilidad de detectar Strongyloides depende del número de larvas en la muestra de heces (a mayor número de larvas, mayor posibilidad de detección); consideramos que el agar en placa tiene la ventaja sobre otros métodos de que aunque existan unas pocas larvas, éstas son capaces de dejar evidencia de su existencia a través de los surcos que dejan en el agar.

Aunque no se observen macroscópicamente surcos en el agar, es recomendable el análisis microscópico de los bordes de las heces, debido a que en algunas ocasiones las larvas tienden a quedarse en ese lugar, porque que dan atrapadas entre las colonias bacterianas de la zona, o, sobre todo si son rabditoides, se introducen en los detritus fecales para alimentarse. Si esta inspección no se realiza se corre el riesgo de perder casos positivos que macroscópicamente eran negativos. Las muestras diarreicas presentan la dificultad de que se riegan al sembrarla en el agar y, aunque contengan larvas (incluso observables microscópicamente), podrían no detectarse los caminos larvarios, debido a que éstos son enmascarados por el crecimiento bacteriano dispersado en la placa.

En relación a este último punto, es conveniente destacar que la concentración de los constituyentes del agar provoca ligeros cambios en la visualización de los caminos larvarios. Al comienzo de la investigación se efectuó un estudio preliminar (datos no mostrados aquí) donde se utilizó el agar originalmente propuesto por Arakaki (5), el cual contiene: 1,5 g de agar base, 0,5 g de extracto de carne, 1,0 g de peptona y 0,5 g de NaCl. Al observar las placas se notó que las larvas se agrupaban en su mayoría en los bordes de las heces, por lo que se observaban pocos caminos en el agar. La bibliografía reseña la posibilidad de utilizar agar nutritivo (AN) bacteriológico (14), el cual contiene: 15 g de agar, 3,0 g de extracto de carne, 5,0 g de peptona y 3,0 g de NaCl. Al emplear este medio observamos un mayor número de caminos larvarios que en el agar original de Arakaki. Esto nos permite inferir que, en vista de la mayor concentración de nutrientes existente en el AN, las larvas rabditoides salen en su mayoría de la muestra de heces para alimentarse en el agar y, por lo tanto, se aprecian más los caminos; mientras que en el agar de Arakaki las larvas se quedan más en los bordes del agar para alimentarse de los detritus fecales.

Cuando un cultivo es positivo macroscópicamente para la presencia de caminos larvarios o se observan macroscópicamente larvas en el agar, es necesario el examen microscópico entre lamina y laminilla, para confirmar la forma evolutiva presente y especie parasitaria, ya que existen otros nemátodes de vida libre y de interés clínico que presentan larvas en su ciclo biológico. Ej.: anquilostomídeos. Aunque se han descrito diferencias entre los caminos dejados por las larvas de Strongyloides (surcos mas finos, regulares y ondeados) y los de anquilostomídeos (surcos más gruesos y alargados con abruptos cambios de dirección)(10,12), deben analizarse las diferencias morfológicas del vestíbulo esofágico y primordio genital, para un diagnóstico definitivo entre especies en el caso de larvas rabditoides y las diferencias en el extremo posterior en el caso de larvas filariformes. En este punto debemos acotar que, en ocasiones, cuando la muestra se incuba por más de 48 horas, pueden apreciarse en el agar unos caminos gruesos rectos y/o ondeantes, los cuales son provocados por larvas de mosca y que en ningún caso deben ser confundidos con los dejados por los nemátodes. De hecho, si se realiza una inspección microscópica al agar, se pueden observar las larvas de mosca en movimiento.

En relación a las formas evolutivas presentes en el cultivo de AP, se ha reportado la recuperación de larvas rabditoides, filariformes y estadíos adultos de S. stercoralis, así como larvas rabditoides de Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Rhabditis sp. y otros nemátodes de vida libre (5,10,12,13, 18,19). En la presente investigación sólo se recuperaron larvas rabditoides de S. stercoralis. Pensamos que esta discrepancia se debe en primer lugar a las diferencias en la prevalencias parasitarias por especie existentes entre un área geográfica y otra, demostrándose en este caso que la prevalencia en la región es de estrongiloidiasis, además de que este tiempo de incubación no es suficiente para permitir la evolución de larvas rabditoides hasta adultos. Aunque en otras referencias se destaca la presencia de larvas filariformes de S. stercoralis en el agar,(5,12,19) en la presente sólo se recuperaron larvas rabditoides, no teniendo una explicación formal para ello, aunque podemos destacar que en una ocasión posterior a la conclusión del proyecto se efectuó la técnica de agar en placa a una muestra de heces de un paciente sospechoso de estrongiloidiasis, la cual tenía 24 horas de recolectada y aún así, resultó positiva (existían caminos larvarios); siendo confirmado microscópicamente por la presencia de larvas filariformes de S. stercoralis. La posibilidad de hallazgo de esta forma evolutiva (forma infectante) ha fundamentado la sugerencia de utilizar guantes al momento de manipular las placas de Petri, para evitar la infección en el laboratorio.

El tiempo de incubación de las placas de agar es un asunto bastante discutido en las diversas publicaciones.(10,15) En el presente estudio las placas de agar que fueron positivas a las 24h permanecían positivas a las 48h; mas no observamos positivización a las 48h de las placas que eran negativas a las 24h. Esto nos sirve de criterio para no aconsejar la incubación mas allá de 48h. Además, existen otros factores que complican la observación de las placas de agar a lo largo del tiempo; entre ellas tenemos: a) el crecimiento exagerado de Proteus sp. permite la formación del velo característico, que impide la visualización de los caminos larvarios en el agar; b) el tiempo prolongado de incubación permite el desarrollo de larvas de mosca, las que efectúan caminos en el agar que provocan confusión, además de que pueden evolucionar hasta estadios mayores; c) las colonias bacterianas llegan a cubrir por completo el agar e impiden la observación de los surcos larvarios; y d) a medida que transcurre el tiempo, los olores nauseabundos de la muestra fecal se hacen más fuertes y hacen desagradable la inspección de las placas. Finalmente es conveniente acotar que el tiempo prolongado de incubación no permitirá el aumento en el número de parásitos (que redunde en aumentar la posibilidad de diagnóstico), ya que en el agar estos nemátodes sólo sufren mudas para su desarrollo.

La temperatura de incubación ideal para la recuperación de S. stercoralis es de 37ºC; sin embargo, también se ha propuesto la utilización de 25, 28, 30, 33 y 35ºC de temperatura para este fin(6,10-15,18,19). Al parecer, este rango de temperaturas no es una limitante para la recuperación de las diversas especies de nemátodos factibles de obtener en un cultivo de agar. Particularmente en este caso, la temperatura ambiente (26-35ºC) resultó bastante efectiva para la recuperación de las larvas de S. stercoralis.

Conclusiones

El método de AP es una herramienta bastante sensible para mejorar el diagnóstico de la estrongiloidiasis humana, y debería ser implementada en los laboratorios cuando esta infección deba descartarse. Este método podría ser utilizado además en ciertas poblaciones seleccionadas, tales como niños desnutridos, familiares de escolares infectados, trabajadores a riesgo, alcohólicos y personas inmunosuprimidas e inmunodeficientes.

Cuando se trata de diagnosticar exclusivamente S. stercoralis, el tiempo de incubación de las placas de agar puede ser de tan sólo de 24 horas.

Para el reporte final del agar en placa deben tomarse en consideración el axamen macroscópico y microscópico del agar, así como el análisis de las larvas entre lamina y laminilla, para un diagnóstico definitivo y certero de la(s) forma(s) evolutiva(s) y la(s) especie(s) presente(s) en el cultivo.

Utilizar la cantidad de heces recomendada para cada técnica es un factor importante para asegurar su sensibilidad, y lograr concentrar y recuperar los parásitos que la misma detecta.

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