Escherichia coli enterohemorrágica en productos cárnicos comercializados en el mercado municipal de Cumaná, Venezuela.

Enterohemorragic Escherichia coli in meat product marketed in Cumaná, Venezuela.

Bravo, V. J. B. y Villalobos de Bastardo, L. B.
Universidad de Oriente, Núcleo de Sucre, Escuela de Ciencias, Departamento de Biología, Cumaná, Estado Sucre, Venezuela.

Resumen
     La mayoría de los brotes por E. coli O157: H7 han estado asociados al consumo de carne de res molida insuficientemente cocida. Para determinar la presencia de Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH), se tomaron muestras bacteriológicas de carne molida y chorizos en los diversos expendios del mercado municipal de Cumaná entre febrero de 1997 y marzo de 1998. Las muestras fueron enriquecidas en caldo EC modificado, seguidas de siembras en placas de Agar SMAC. Las cepas sorbitol negativas fueron identificadas por pruebas bioquímicas convencionales, test de MUG y confirmación con el sistema ID32E. La serología de las cepas MUG negativas se realizó con antisuero monovalente y la producción de toxina termoestable mediante la prueba de Dean. Adicionalmente se les realizó el perfil de susceptibilidad antimicrobiana. Se aislaron 95 cepas sorbitol negativas, sólo tres (3,15%) de ellas fueron confirmadas como E coli O157:H7 productoras de toxina termoestable. Una de las cepas mostró resistencia para los antibióticos ampicilina, ceftazidima y tetraciclina.

Abstract
     E. coli O157:H7 has been associated to the consumption of undercooked ground meat. In order to determinate the presence of enterohemorragic E. coli (EHEC), bacteriological samples of ground meat and fresh sausage in the municipal market of Cumaná were collected among February 1997 and March 1998. Samples were assayed for EHEC by enrichment in modified EC broth and plating onto SMAC Agar. Sorbitol negative strains were identified by conventional biochemical tests, ID32E strips and MUG test. Serology of MUG test negative strains was carried out with by monovalent antiserum, and heat stable toxin production by Dean's test. Additionally antibiotic profiles were determinated. Ninety five negative sorbitol strains were isolated, only three (3,15%) of those strains were confirmed as E. coli O157:H7 toxin stable producers. One of those showed resistance to ampicillin, ceftazidime and tetracicline.

Introducción

     Algunas cepas de E. coli que causan enfermedades gastrointestinales en los humanos, en un comienzo eran denominadas E. coli enteropatógenas, pero recientemente a estos microorganismos se les ha separado en categorías de acuerdo al síndrome clínico con el cual han estado asociadas y a los atributos de virulencia. Se han distinguido los biotipos de E. coli enterotoxigénica, enteropatógena, enteroinvasiva, enteroadherente, enteroagregativa, enteroadherente difusa y enterohemorrágica (1,2,3).

     E. coli enterohemorrárgica O157: H7 es de gran importancia patógena en humanos, dado que es la causante de la colitis hemorrágica, síndrome hemolítico urémico (HUS) y la púrpura trombocitopénica, los cuales se han reportado con mayor frecuencia a finales del siglo XX (4). La infección humana asociada con E. coli O:157 ha sido identificada en más de 30 países y distintos continentes (5).

     Estudios realizados en EE. UU. y España revelaron que E. coli O157:H7 forma parte de la flora intestinal del ganado bovino siendo éste su principal reservorio. Se encuentra con mayor frecuencia en terneros vaquillas que en ganado adulto (3), así como también en la leche cruda (6, 7).

     La carne molida resulta ser un buen vehículo cuando ésta no tiene la manipulación adecuada y se ingiere sin tener un buen grado de cocción (8, 9, 10). Transmisión persona a persona y animal- humano también ha sido documentada (11).

     El bajo número de células de la bacteria detectadas en alimentos asociados a brotes epidémicos ha permitido inferir que la contaminación con 50 a 100 bacterias es suficiente para causar la enfermedad (11). Es por ello que la identificación de las fuentes de E. coli O157:H7 en estos productos requiere la utilización de métodos más sensibles (12).

     El propósito de este estudio fue determinar la presencia de E coli O157:H7 en muestras de carne molida y chorizos recolectadas en el mercado municipal de Cumaná, Venezuela, con el fin de alertar sobre los daños causados por la bacteria y sugerir medidas higiénicas en el manejo y preparación de estos alimentos.

Materiales y Métodos

    Muestras: Entre febrero de 1997 y septiembre de 1998, se recolectaron 356 muestras de 250 gramos cada una, incluyendo 128 de carne molida y 128 de chorizos. Todos los productos fueron adquiridos en el mercado municipal de Cumaná, Venezuela.

    Recuento de coliformes en placa: Se siguió el procedimiento descrito por la Comisión Venezolana de Normas industriales (13).

    Aislamiento e identificación de E. coli O157:H7: Una porción de 25 g de cada muestra fue adicionada a 225 ml de caldo EC modificado (Merck) el cual contenía una concentración final de 30 µg/ml de novobiocina. Después de la homogeneización se incubaron a 37° C por 6 horas en baño de maría con agitación (140 rpm). Se sembró por extensión 1ml del caldo en placas de Agar Mac Conkey Sorbitol (Merck). Las placas se incubaron a 37 °C por 18 horas. Se seleccionaron las colonias que fuesen sorbitol negativas y se confirmaron utilizando pruebas bioquímicas convencionales y el sistema ID32E (BioMérieux). Adicionalmente las cepas sospechosas se sembraron en Agar Violeta Rojo Bilis con MUG para verificar si presentaban o no fluorescencia al incidir luz ultravioleta sobre la colonia. Las cepas negativas para esta prueba se les practicó serología con antisuero monovalente para E. coli O157:H7 de la Fundación Venezolana de Salud Infantil (14), como cepa de referencia se utilizó CVCM:417 (15).

     Antibiograma: los antibiogramas se realizaron mediante difusión en disco (16), utilizando los antibióticos: trimetoprim-sulfametoxazol, ampicilina, ceftazidima, tetraciclina, ácido nalidíxico, oxitetraciclina, gentamicina y kanamicina.

     Determinación de toxina termoestable: La determinación de la producción de toxina termoestable se realizó mediante la prueba en ratones lactantes (17), la cepa utilizada fue de ratones albinos Mus musculus cepa NMRI.

Resultados

     Recuento de coliformes. Las muestras de chorizo oscilaron entre 1,3 x 105 hasta 6,5 x 106 ufc/g y la carne molida presentó valores que variaron de 3,9 x 104 a 4,3 x 107 ufc/g.

     Aislamiento de E. coli O157:H7. De los dos tipos de muestra se aisló un total de 95 cepas sorbitol negativas de las cuales, sólo tres se confirmaron como el serotipo en estudio, dos provenientes de carne molida (1,56 %) y una de chorizo (0,781%), representando el 3,15% del total de las cepas aisladas. Las cepas identificadas como serotipo O157:H7 fueron MUG negativas, positivas para la prueba de aglutinación en lámina con el antisuero monovalente y no crecieron a 44 °C.

     Susceptibilidad a los antibióticos. El comportamiento de las tres cepas de E. coli O157:H7 fue similar con respecto al tamaño de los halos de inhibición. La mayoría de los antibióticos mostraron efectividad muy marcada contra las tres cepas y tan sólo se registró resistencia a tres antibióticos. Dos de ellas a la ampicilina y ceftazidima y otra a la ampicilina, tetraciclina y ceftazidima.

     Determinación de producción de toxina termoestable. Los ratones lactantes inoculados presentaron aumento de la cavidad abdominal, color de piel azulada, inmovilidad corporal. La autopsia mostró intestinos inflamados con gran cantidad de fluido. Los índices obtenidos al aplicar la fórmula de Dean se consideraron positivos para las tres cepas.

Discusión

    La enumeración de coliformes continúa siendo la técnica de referencia para indicar si un alimento o el proceso de su elaboración parcial o total poseen características sanitarias satisfactorias. En este trabajo se demostró que los productos cárnicos examinados presentaron un número de coliformes que sobrepasaron los límites establecidos, lo cual permite inferir que están siendo excesivamente manipulados desde el momento en que salen del matadero hasta su comercialización en el mercado municipal de Cumaná. La contaminación cruzada también se observó en los expendios, al colocar la carne molida en la misma bandeja de los cortes sin procesar, lo cual contribuye a que la calidad sanitaria del producto sea cuestionable.

     El aislamiento de E. coli O157:H7 a partir de alimentos es problemático porque esta bacteria parece estar presente en muy bajo número y debe competir con la microflora existente incluyendo otras E. coli.

     Aparentemente esta bacteria puede ser un comensal en la microflora gastrointestinal del ganado vacuno (18,19, 20,21,22), la cual en el momento de la evisceración contamina el canal. Se ha reportado que el principal vehículo de E. coli O157:H7 ha sido la carne medio cocida y los alimentos ácidos (10).

     La metodología aplicada para el momento, aunque fue utilizada por otros autores (5,23) con relativo éxito, actualmente se sabe que no proporciona una rata de recuperación alta de la bacteria, lo que explicaría el bajo porcentaje detectado en las muestras analizadas en este estudio. Es por ello que se ha recomendado la separación inmunomagnética para la recuperación y mejor aislamiento de la bacteria (24, 12) y la utilización de otros procedimientos (25, 26, 27, 22) no disponibles para entonces en nuestro laboratorio.

     La utilización del MUG (28, 29) jugó un papel clave en la identificación de colonias de E. coli O157:H7, ya que la mayoría de las E. coli utilizan la enzima 4-methylumbellferone-B-D-glucoronoide y la actividad de la misma, se presenta por una fluourescencia ante la luz ultravioleta (UV). Por el contrario, E. coli O157: H7 no utiliza dicha enzima y por lo tanto no muestra la florescencia típica ante la luz UV, permitiendo así su identificación. La prueba de aglutinación en lámina con antisuero monovalente continúa siendo una excelente técnica de ayuda para el despistaje de la E. coli O157:H7.

     La prueba con ratones lactantes (17) mostró síntomas característicos de la acción de la toxina, con valores que se consideraron positivos para las tres cepas de E coli O157:H7 (30).

     Los perfiles de susceptibilidad antimicrobiana concuerdan con los obtenidos en un estudio realizado en Washington sobre resistencia de E. coli O157:H7 (31) y difieren en parte con los obtenidos en Japón (32). Aún cuando los resultados en la presente investigación mostraron sensibilidad de las bacterias ante la mayoría de los antibióticos que se probaron, cepas de E. coli O157:H7 resistentes a antibióticos son motivo de mayor preocupación por cuanto los brotes diarreicos, colitis hemorrágicas y HUS que ocasionan son de más difícil tratamiento.

     Determinar E. coli O157:H7 en productos cárnicos consumidos ampliamente por la población y expendidos en condiciones higiénicas mínimas, requiere de una evaluación más exhaustiva mediante el uso de procedimientos que faciliten el aislamiento de la bacteria y la detección de sus serotipos.. Sobre esta base se implementarán las estrategias para mejorar las prácticas de manufactura y la utilización del sistema HACCP, que permita reducir la ocurrencia no sólo de esta bacteria, sino de otros patógenos que puedan afectar la salud del consumidor.

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