Implementación de un protocolo para la identificación de la toxina de Vibrio cholerae

Implementation of a protocol for the identification of Vibrio cholerae

Arévalo, Z.¹; Clavijo, A. M.²; Rolo, de M.²; Álvarez, M.³; Conroy, D.⁴; Infante, D.² y Santander, J.²

1.Magister Scienciarum en Microbiología, Laboratorio Delgado-Launois, Clínica Lugo, Maracay, Edo. Aragua, Venezuela.
2.Sanidad Animal- CENIAP- INIA.. Maracay, Edo. Aragua, Venezuela.
3.Laboratorio Genomik, Maracay, Edo. Aragua, Venezuela.
4.FARMAFISH. Maracay, Edo. Aragua, Venezuela.

Resumen
     Vibrio cholerae produce una potente toxina codificada por dos genes: el operón ctxAB. Los estudios epidemiológicos han sido limitados por las técnicas fenotípicas; por ello es necesario establecer un protocolo para la detección del gen de la subunidad A (ctxA), que codifica la toxina de Vibrio cholerae, para lo cual se realizaron caracterizaciones genéticas de 24 aislados de la familia Vibrionaceae obtenidos del cepario del Laboratorio de Bacteriología de Sanidad Animal-CENIAP-INIA, que provienen de lisas, tilapias y cachamas. Se siguió la metodología recomendada por Fields et al. (1992) con modificaciones, siendo la secuencia de los iniciadores: 5'-GGGCAGATTCT AGACCTCCTG-3' y 5'-CGATGATC TTGGAGCATTCCCAC-3'. Los aislados de Vibrio cholerae no 01 analizados no poseen la toxina colérica. La investigación de la toxina colérica en aislados ambientales es necesaria, ya que en los peces en los que fueron aislados son de consumo humano, lo que constituye un riesgo en salud pública.

Abstract
     Vibrio cholerae produces a powerful toxin coded by two genes: the operon ctxAB. Epidemiology studies have been limited by phenotypic techniques; from this it is necessary to establish a protocol for detection of the gene of subunity A (ctxA) that codes Vibrio cholerae toxin for which it was done genetic characterizations of 24 isolates of the Vibrionaceae family gotten from isolates of Bacteriology Laboratory of Sanidad Animal- CENIAP-INIA, from lisas, tilapias and cachamas. It was followed the methodology recommended by Fields et al. (1992) with modifications; this are the sequences of these primers 5'-CGGGCAGATTCTAGAC CTCCTG-3' y 5'-CGATGATCTTG GAGCATTCCCAC-3'. The not-O1 Vibrio cholerae isolates studied do not have the choleric toxin. Investigations about choleric toxin on environment isolates is necessary since isolates studied were gotten from físhes for human consumption which constitutes a public health risk.

Palabras-clave: Protocolo, toxina, Vibrio cholerae.

Introducción

     Vibrio cholerae es importante causa de cólera en los humanos, causando formas severas como diarrea profusa, vómitos y dolores musculares. La transmisión de este organismo está asociado al consumo de alimentos contaminados y, con frecuencia, de aguas contaminadas y por transmisión de persona a persona. La patogenicidad del cólera es principalmente asociada con su capacidad para producir la toxina colérica (CT) codificada por dos genes que forman el operon ctxAB. La toxina colérica es el principal determinante de la virulencia de V. cholerae O1. No obstante, la mayoría de las cepas de V. cholerae O1 aisladas del ambiente no producen CT, pero poseen el potencial genético para producirlo, pero algunas cepas de V. cholerae no O1 pueden producir CT. Sólo los aislados de V. cholerae O1 que producen CT han sido asociados con epidemias y pandemias en el pasado. La producción de CT es un importante marcador para identificar aislados que potencialmente son capaces de causar epidemias. Los estudios epidemiológicos han sido limitados por las técnicas fenotípicas; por ello es necesario conocer también cuáles son las cepas toxigénicas, lo cual precisa el uso de sistemas de tipificación, siendo descrito el empleo de técnicas poderosas como la PCR.

Figura 1. Colonias de Vibrio cholerae en medio de TCBS

 

Materiales y Métodos

     Se realizaron caracterizaciones genéticas de 24 aislados de la familia Vibrionaceae obtenidos del cepario del Laboratorio de Bacteriología de Sanidad Animal-CENIAP-INIA, en Maracay, estado Aragua, obtenidos a partir de lisas, tilapias y cachamas. La extracción del ADN bacteriano se realizó con el reactivo DNAzol® con modificaciones, debido a que no se logró la reproducibilidad descrita en la técnica original. Se siguió la metodología recomendada por Fields et al. (1992) para determinar el gen ctxA que codifica la toxina de V. cholerae, las secuencias de los iniciadores fueron: 5'-CGGGCA GATTCTAGACCTCCTG-3' y 5'-CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC-3'. La mezcla de reacción con un volumen final de 50µl, está formada por 10mM de Tris-HCl pH 8,3; 50mM de KCl; 1,5mM de MgCl2; 4ml desoxinucleótido trifosfatado (2,5 mM dATP, dCTP, dGTP. dTTP), 0,5µl de cada iniciador, 0,25µl de la Taq polimerasa y lml de ADN de la muestra. Las condiciones del ciclo fueron las siguientes: preincubación a 95°C por 5 minutos, 25 ciclos: 1 minuto a 95°C, 1 minuto a 60°C y 1 minuto a 72°C. Incubación final a 72°C por 10 minutos. Los amplificados fueron visualizados con LUV en gel de agarosa al 1,5 %. Se utilizó una cepa control de V. cholerae que contiene la toxina, controles negativos y un marcador de peso molecular Ladder 100 bp (pares de bases). El producto amplificado es de 564 pb.

Resultados y Discusión

     En la PCR para la toxina del cólera utilizada en esta investigación, los iniciadores específicos detectan solamente el gen que codifica para la subunidad A de la toxina del cólera. El ADN amplificado de ctxA se detecta como una banda de 564 pb en el gel de agarosa. Los ADN evaluados no generaron amplificados al compararlos con la banda formada por el control positivo de V. cholerae O1 toxigénico, la cual se ubica entre las bandas 500 pb y 600 pb del marcador de peso molecular. Los controles negativos tampoco formaron bandas.

Figura 2. Amplificados de ADN de Vibrio cholerae no = 1 por PCR

 

Conclusiones

1. Los aislados de Vibrio cholerae no O1 analizados no poseen la toxina colérica. La investigación de la toxina colérica en aislados ambientales es necesaria, ya que en los ejemplares de peces en las que fueron aislados son de consumo humano, lo que constituye un riesgo en salud pública.

2. Se estableció un protocolo para la detección del gen de la subunidad A (ctxA) que codifica la toxina de Vibrio cholerae.

3. La técnica de PCR es un valioso instrumento de la biología molecular que hace factible la identificación de un microorganismo de forma específica y sensible, pero requiere trabajar con cuidado, para evitar la contaminación. Su reproducibilidad va a depender de las condiciones de experimentación y del material y equipo empleados, así como de la destreza del investigador.

Recomendaciones

1. Continuar con las investigaciones de la toxina colérica, porque, aún cuando la mayoría de las cepas de V. cholerae O1 aisladas del ambiente no producen CT, poseen el potencial genético para producirlo, y algunas cepas de V. cholerae no O1 pueden producirla.

2. Mantener comunicación entre las Direcciones de Salud Pública, Sanidad Animal y los sectores productores acuícolas, con el propósito de conocer la epidemiología y mancomunar estrategias, con el fin de proteger la salud humana y para un mejor desarrollo de la acuicultura.

3. Realizar campañas de educación sanitaria a la población sobre el peligro que constituye el consumo de pescados crudos o con poca cocción, así como de la adecuada disposición de excretas que eviten la contaminación de las aguas y la aplicación de medidas que obliguen el tratamiento de aguas servidas, para evitar que éstas contaminen los reservorios naturales y a las especies ícticas.

Los autores agradecen a Fundacite-Aragua el financiamiento parcial del presente trabajo.

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