Reacción intradérmica de un antígeno monovalente de Leishmania (Viannia) brasiliensis en casos de leishmaniasis cutánea en el estado Trujillo, Venezuela.

Intradermic reaction to a monovalent anti-gen of Leishmania (Viannia) brasiliensis in cases of cutanaeous leishmaniasis in the state of Trujillo, Venezuela.

Espinoza, A.; Rojas, E. y Scorza, J. V.
1. Centro de Investigaciones Parasitológicas "José Witremundo Torrealba", Laboratorio de Control de Enfermedades Metaxénicas y Parasitarias. Núcleo Universitario "Rafael Rangel", ULA.

Resumen
      La leishmaniasis tegumentaria en el estado Trujillo es una enfermedad endémica. Actualmente existe una alta incidencia, de 120 a 130 casos nuevos/año, procedentes de distintos sectores en la entidad, afectando a todos los grupos etários. Una herramienta utilizada para su diagnóstico es el test de Montenegro o "leishmanina", que permite evidenciar la exposición al parásito causante de esta enfermedad, protozoo del género Leishmania, subgénero Viannia, que puede generar respuestas diferentes en el paciente ante un antígeno preparado como base de la leishmanina. Nos propusimos hacer la revisión de la técnica empleada en el diagnóstico de la leishmaniasis por medio de la intradermorreacción (IDR), estandarizar la técnica de preparación y la aplicación de un antígeno, elaborado con cepas locales de Leishmania sp. La toma de muestras en individuos afectados de la ciudad y consultantes del consultorio del Centro de Investigaciones Parasitológicas "José Witremundo Torrealba", facilitó el aislamiento de los parásitos, su identificación y uso en la preparación del antígeno, que se ensayó en una población del área endémica, para evaluar su calidad y la cinética de su reacción. Encontramos que la concentración del antígeno que induce una respuesta estable fue 40mg/ml de proteína para un tiempo de lectura de 48 horas. El test de Duncan confirma la bondad de estos resultados. La amplia utilización de antígenos, como herramienta de valor epidemiológico, hace necesario el empleo de antígenos estandarizados, por lo que ofrecemos nuestro antígeno para pruebas de campo en amplia escala.

Abstract
     In the state of Trujillo, Venezuela, tegumentary leishmaniasis is an endemic disease. Currently, there exists an incidence of 120 to 130 new cases per year, originating in different sectors of the community of 493,000 inhabitants and affecting all social groups. A tool used in its diagnosis is the "leishmanina", or Montenegro test, which makes evident the exposure to the parasite which causes the disease, the protozoos of the genus Leishmania, sub-genus Viannia, which can generate different responses in the patient, before treatment with prepared anti-genes, such as those which form the base of leishmanina. We propose to revise the technique used in the diagnosis of Leishmaniasis by means of intra-dermatological-reaction (IDR) and to standardize the preparation and application technique of an anti-gene made from local types of Leishmania sp. The taking of samples from effected individuals of the city, attending the Treatment Center of the Parasitological Research Centre, "Jose Witremundo Torrealba", facilitated the isolation of the parasites, their identification and their use in the preparation of the anti-gene. The latter was tested on the population of an endemic region, comparing its characteristics with those of other similar anti-genes, in order to evaluate its quality and the process of its reaction. We found that the concentration of anti-gene, which induced a stable response, was 40ug/ml of protein for a trial period of 48 hours. A local monovalent anti-gene (L. viannia brasiliensis) induced a better response than another polyvalent anti-gene (L. brasiensis brasiliensis and L. brasiliensis guyanensis) in order to produce a hyper-reaction resistant to allergic tests. The Duncan Test confirmed the validity of these results. The widespread utilization of anti-genes as a valuable epidemiological tool makes the employment of standardized anti-genes necessary and we, consequently, offer our anti-gene for large-scale field trials.

Palabras-clave: Leishmania (Viannia) brasiliensis, leishmaniasis cutánea, antígeno monovalente.

Introducción

     La leishmaniasis es una enfermedad producida por protozoos parásitos intracelulares, pertenecientes a diferentes especies del género Leishmania, transmitidos por dípteros del género Lutzomyia en el continente americano, Los reservorios de estos organismos están constituidos por el hombre (ciclo antropozoonótico) o por animales silvestres y domésticos (ciclo zoonótico)⁽¹⁾. Originalmente, esta enfermedad se asoció con regiones selváticas; hoy se observa su ciclo de transmisión adaptado a condiciones domésticas en nueve países de Latinoamérica⁽²⁾.

     Las leishmaniasis en el ser humano se presentan con manifestaciones clínicas diferentes: tegumentaria y visceral. La leishmaniasis tegumentaria ocurre como leishmaniasis cutánea localizada (LCL), leishmaniasis muco-cutánea (LMC) y leishmaniasis cutánea difusa (LCD)⁽³⁾. La forma cutánea localizada (LCL) se presenta como una lesión única o unas pocas lesiones, como expresión de un granuloma inmune típico, o como lesiones no ulcerosas que se alteran a medida que aumenta su cronicidad, observándose intensa reacción ulcerativa destructiva, que puede producir necrosis significativa y otras alteraciones histopatológicas⁽⁴⁾.

     La forma tegumentaria de la leishmaniasis, se encuentra diseminada en cuatro continentes. Mundialmente, su incidencia se estima en unos 600.000 casos nuevos por año reportados oficialmente, con una prevalencia global de 350 millones de personas expuestas al riesgo de contraer la enfermedad⁽⁵⁾.

     Para el diagnóstico de la leishmaniasis se recurre al índice parasitario que comprueba la presencia del agente causal en casos individuales y el índice alérgico, mediante la prueba de la leishmanina, (mide la respuesta celular de hipersensibilidad retardada a derivados antigénicos de Leishmania) que nos permite determinar el contacto previo con Leishmania sp., aun en ausencia de individuos con lesiones patentes⁽⁶⁾; de allí su utilidad como herramienta, tanto para el diagnóstico clínico como para estudios epidemiológicos en diferentes regiones con grados de variabilidad en especificidad y sensibilidad^(7,8,9,10).

     La reacción alérgica se ha utilizado desde 1926,⁽¹¹⁾ cuando se aplicó la prueba de intradermorreacción para el diagnóstico de la leishmaniasis en el hombre. Desde entonces se han realizado estudios aplicando la intradermorreacción con diferentes cepas de parásitos y diversos protocolos para su preparación^{(10,12,13,14,15)}.

     En América del Sur, debido a la cuantía de la incidencia de leishmaniasis, se han usado diversos antígenos preparados por cada investigador. La especificidad de la prueba de Montenegro fue evaluada en cuatro zonas endémicas para leishmaniasis en Colombia,⁽⁶⁾ elaborando histogramas que se obtuvieron a partir del tamaño de las reacciones, sugiriendo mayor especificidad cuando la curva de distribución se desviaba hacia la derecha, con reacciones de gran tamaño (14-30 mm de diámetro), atribuyendo esto a la probabilidad de que el agente etiológico de las lesiones clínicas fuera similar en antigenicidad al antígeno utilizado en la prueba (L. brasiliensis).

     En Perú⁽¹⁶⁾ se evaluaron antígenos preparados a partir de promastigotes de L. panamensis en pacientes con leishmaniasis activa, planteando la necesidad de estandarización en cuanto a las concentraciones de proteínas a probar, siendo las más usadas de 25-50 µg/ml, entre otros ⁽¹⁷⁾.

     En Venezuela, las entidades federales más afectadas son las del eje de la Cordillera de los Andes, con el 56% de los casos reportados a escala nacional. En algunas de estas localidades la enfermedad constituye problema de Salud Pública, por su carácter endémico y por la evolución hacia formas malignas de curso fatal, como lesiones secundarias mutilantes del tracto respiratorio⁽¹⁾.

     Pifano⁽⁹⁾, investigador pionero en estos estudios, utilizó la intradermorreacción a gran escala, en muestras representativas de la población rural en áreas endémicas determinadas, fundamentándose en la respuesta alérgica a la infección como fenómeno de masa entre los habitantes que habían contraído la enfermedad. Uno de sus estudios epidemiológicos lo realizó en el Valle de Aroa, en el estado Yaracuy (región centro-occidental del país), aplicando intradermorreacción con antígeno de L. brasiliensis a una población de 1.118 personas en el ambiente rural, incluyendo todos los grupos etários, en uno y otro sexo, y con edades comprendidas entre 5 y 60 años, demostrando reactividad en el 60% de la población, que a su vez presentaban cicatrices correspondientes a lesiones ulcerosas previas, y en 10% de campesinos que no presentaban cicatrices ostensibles, aparentemente sanos. En este trabajo utilizó una escala cualitativa establecida para leer la reacción, al parecer similar a la empleada por Pessoa & Barreto⁽¹⁸⁾.

     Scorza et al⁽¹⁹⁾, en una encuesta epidemiológica para leishmaniasis cutánea en el estado Mérida, aplicaron a todos los habitantes de 13 caseríos sometidos a estudio una leishmanina preparada con L. garnhami, agente etiológico en la zona, encontrando que en la región andina el porcentaje de individuos sanos con intradermorreacción positiva era muy bajo (0,58%) con respecto al resto del país, atribuyendo estas diferencias posiblemente a especificidad, falta de estandarización o variación de virulencia en las diferentes especies o subespecies de Leishmania utilizadas en la preparación de antígenos. En la ciudad de Trujillo de la misma región de Los Andes, se utilizaron dos lotes de antígeno, uno monovalente (L. garnhami) y otro polivalente (L. mexicana y L. brasiliensis), que se aplicaron ambos a pacientes que habían recibido tratamiento específico después de diagnóstico parasitológico, sin hallar diferencias significativas entre ellos⁽²⁰⁾.

     En muchas regiones de Suramérica la intradermorreacción de Montenegro, o prueba de la leishmanina, es el instrumento más utilizado como herramienta para el diagnóstico clínico de la leishmaniasis. Sin embargo, evidenciar una infección leishmánica reciente es una de las intrigas más problemáticas en áreas donde la prevalencia de la prueba resulta con alta reactividad, de tal manera que, hoy en día, existen diferentes laboratorios que preparan leishmaninas con diferentes especies de Leishmania, a diferentes concentraciones de parásitos y utilizando diferentes protocolos para su elaboración. Esto hace que la comparación con estudios anteriores sea difícil, pues existe falta de uniformidad en el tipo y dosis de antígenos utilizados. Dadas las diferencias antigénicas y variedades de Leishmania dermotropas en el continente, para fines diagnósticos y estudios epidemiológicos es preferible utilizar antígenos preparados con cepas de la localidad debidamente evaluados.

     En este trabajo nos propusimos estandarizar el protocolo de preparación del antígeno, utilizando cepas de Leishmania sp de la localidad de Trujillo, Venezuela, y evaluar la reactividad del preparado en una muestra de la población, para determinar la sensibilidad y especificidad del mismo.

Materiales y Métodos

1. Selección de la cepa para la preparación de antígeno y su identificación.

     Se utilizaron cepas recientemente aisladas de pacientes que acuden a la consulta de leishmaniasis del Centro de Investigaciones "José W. Torrealba", para seleccionar la cepa que diera mayor seguridad de cultivo en masa. La selección de la cepa se basó en el poder de desarrollo en el cultivo base (agar NNN con 10% sangre desfibrinada de conejo, pH 7,2, con una fase líquida de solución salina fisiológica estéril con penicilina 1.000 U/ml, incubado a 24°C durante 5 a 8 días, hasta observar abundante crecimiento flagelar o fase logarítmica).

     La cepa de Leishmania seleccionada fue identificada por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y utilizando los métodos tradicionales de comportamiento en medios de cultivo, en el hámster y por el xenodiagnóstico con Lutzomyia youngi. Una fracción de suero de cada paciente donador de la cepa también fue procesado por PCR e hibridación en el Laboratorio de Genética Molecular del Centro de Biología Experimental de la Universidad Central de Venezuela.

2.- Preparación del antígeno. Estabilidad y seguridad del antígeno: Control de calidad.

     Una vez aislada, identificada y seleccionada la cepa de Leishmania, los parásitos se cultivaron en medio líquido selectivo de Schneider's Drosophila (SIGMA), suplementado con 10% de suero fetal bovino (Gibco) y 1.000 UI de penicilina/estreptomicina (Gibco) por cada 100 ml de medio, e incubados a 24 °C por 3 a 5 días. Los promastigotes se desarrollaron en fiolas de 125 ml, con agitación constante a 40 r.p.m., y cosechados por centrifugación durante 15 minutos a 3.000 rpm. Fueron lavados tres veces con tampón buffer solución amortiguadora de fosfato salino (PBS) pH 7,2 y resuspendidos en solución salina fenolada al 0,5 %. Al empaquetado de parásitos resultante se le midió la concentración de proteínas mediante la técnica de Lowry,⁽²¹⁾ y la reacción leída en Spectronic 20 a 500 nm. Cada uno de los diferentes lotes o fracciones de antígenos preparados fueron procesados para control de calidad, mediante su siembra en 3 tubos de agar sangre y se observaron dos veces por semana, durante un mes, para garantizar que no hubiese desarrollo de parásitos sobrevivientes. De igual manera se investigó contaminación bacteriana y fúngica mediante el cultivo en agar sangre, Mc Conkey y Sabouraud.

Diseño Experimental

I. Grupo de estudio y tamaño muestral

     Todos los individuos participantes en el estudio de campo fueron mayores de 18 años y recibieron explicaciones tanto verbales como por escrito sobre la naturaleza y propósito del procedimiento, beneficios y riesgos. Habiéndose tenido ocasión de aclarar dudas, todos otorgaron su consentimiento por escrito. A cada uno de los participantes se les hizo una encuesta, para evaluar los antecedentes relacionados con la enfermedad y para nuestro registro. El tamaño de la muestra (N) para todo el protocolo se calculó por la tabla de incidencia conocida, empleando como base la incidencia de leishmaniasis observada en los últimos cinco años en la ciudad de Trujillo⁽²²⁾. En cada uno de los ensayos se calculó el tamaño de la muestra (n) necesaria, según la disponibilidad de casos nuevos y del test de comparación que se usaría.

     Este protocolo fue sometido a la evaluación del Comité de Bioética del Centro "José W. Torrealba".

II. Ensayos.

1. Selección de la concentración del antígeno monovalente y del tiempo de lectura para la intradermorreacción.

     Se calculó un tamaño muestral uniforme consistente en un grupo de 24 personas de tres grupos familiares, integrados por hombres y mujeres con antecedentes de lesiones leishmánicas confirmadas parasitológicamente. A cada individuo se le inyectaron subcutáneamente tres concentraciones diferentes del antígeno monovalente y otra de solución salina fenolada 0,5% como control negativo, inyectándoles en la cara anterior del antebrazo derecho 60 mg/ml de nitrógeno de proteína de promastigotes de leishmania y, a una distancia de cinco centímetros en el mismo antebrazo, 20 mg/ml. De igual manera se colocó en el antebrazo izquierdo 40 mg/ml y la solución salina fenolada 0,5%. La intradermorreacción (IDR) se hizo inyectando intradérmicamente un volumen de 0,1 ml del antígeno, y se midió la respuesta a las 24, 48 y 72 horas, como una induración o por la aparición de un granuloma basal y no por una simple reacción cutánea superficial.

     La lectura se hizo mediante la técnica del bolígrafo y el calcado sobre papel milimetrado, para determinar geométricamente el valor de la reacción. Se cuantificó el diámetro (d=2xr) de la misma usando la fórmula para el cálculo del área del círculo A=πxr² . Toda reacción con pápula fue leída. Cada papel milimetrado fue archivado en la historia del paciente.

2. Prueba de campo

     Este ensayo se realizó en la localidad de San Jacinto, cuya incidencia para leishmaniasis es conocida y considerada como sector de alto riesgo;^(23,24) consistió en la búsqueda activa de casos, a través de la colaboración de voluntarios de la comunidad, que permitieron la aplicación del antígeno para

Resultados

1. Selección de la cepa para la preparación de antígeno.

     De pacientes de la consulta de diagnóstico de leishmaniasis se aislaron cinco cepas, de las cuales MHOM/VE/1991/MAP resultó ser la mejor para cultivo en masa con el medio suplementado para la preparación del antígeno,

    La cepa se obtuvo de una ulcera abierta, limpia, sin secreción, con granuloma basal y diámetro de 25 mm, ubicada en el tercio medio del miembro inferior derecho de una paciente femenina de 36 años de edad y con una evolución clínica de 2 meses.

     A la paciente se le realizó diagnóstico parasitológico mediante frotis de tejido, resultando con una relación de veinticinco parásitos en cien (100) células blancas, contadas bajo aumento de 100X en microscopio de luz ⁽²⁵⁾.

     La respuesta de la paciente al antígeno NURR98 fue de 10 mm, leído a las 48 horas de aplicado el test de Montenegro. Otras pruebas diagnósticas realizadas fueron: ELISA, que presentó positividad en la dilución 1/100, y PCR positiva, con hibridación para el subgénero Viannia.

2. Identificación de la cepa de Leishmania sp.

    En el cuadro 1 se muestran los medios de identificación empleados con las distintas cepas aisladas.

 

Cuadro 1. Características de las cepas aisladas de pacientes con leishmaniasis cutáneas localizadas, cultivadas para preparación de antígenos.

 

     El análisis, por la Técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) de la cepa MAP, utilizada en este estudio, permitió clasificarla como perteneciente al complejo brasiliensis (subgénero Viannia), uno de los tipos o complejos de Leishmania que existen en Venezuela,^(9,25) como se corresponde con la descripción de los parásitos circulantes en la ciudad de Trujillo, Venezuela ⁽¹⁾.

3. Preparación del antígeno y control de calidad.

     El medio de cultivo Schneider's Drosophila mostró ser el más apropiado para el desarrollo in vitro de la cepa seleccionada. En la evaluación de la esterilidad y seguridad del antígeno no se observó contaminación bacteriana, fúngica ni viabilidad de parásitos en ningún lote del antígeno preparado.

I. Grupo de estudio y tamaño muestral.

     Fue calculada una muestra (N) de 248 individuos según la incidencia de leishmaniasis observada en San Jacinto en los últimos años.⁽²³⁾ La fórmula aplicada permite considerar tamaños muestrales pequeños cuando la incidencia observada es alta y constante en una zona epidemiológicamente activa o en focos antiguos que permanecen activos.

El grupo estudio fue subdividido como:
A: 24 individuos integrantes de tres grupos familiares
B: 104 individuos de un área endémica de la ciudad de Trujillo.
C: 36 pacientes de la Consulta de Leishmaniasis.
D: 20 pacientes de consultas diversas IPASME.
E: 64 individuos del foco más antiguo.

II. Ensayos.

1. Selección de concentración del antígeno monovalente y el tiempo de lectura para la intradermorreacción.

     El cultivo en masa de los promastigotes de Leishmania permitió la preparación de tres lotes de antígeno, cada uno con concentraciones correspondientes a 30, 40 y 60 mg/ml de proteínas, correspondientes a bases nitrogenadas determinadas por el método de Lowry⁽²¹⁾. Con cada uno de ellos se aplicó 0,1 ml en la cara anterior del antebrazo, obteniéndose las siguientes observaciones: cuando la concentración usada fue de 40 y 60 mg/ml de proteína, el tamaño de las reacciones medidas en hombres y en mujeres resultó de un diámetro medio de 15,66 mm y 15,04 mm, respectivamente, sin observarse diferencias significativas. La comparación entre lecturas obtenidas con la concentración de 20 mg/ml de proteína mostró una diferencia significativa (p<0,05) con respecto a las concentraciones anteriores, al producir una media de 12,12 mm de diámetro, como puede verse en la figura 1.A. 

 

Figura 1A. Medias de las lecturas de las concentraciones del antígeno empleado (a) y medias de las lecturas en los diferentes tiempos de lectura 49mg/ml (B)

     

    Estos resultados nos permitieron seleccionar como concentración apropiada la de 40 mg/ml de proteína para los ensayos de campo, debido a que esta dosis de 40 mg/ml tiene el mismo valor de lectura que la mayor concentración utilizada y con menor cantidad de proteínas, similar a la de otros estudios epidemiológicos realizados en Venezuela⁽²⁶⁾. El diámetro de las lecturas medidas a las 48 y 72 horas después de la aplicación de la intradermorreacción no mostraron entre sí diferencias significativas (18,01 y 17,66 mm), resultando altamente significativa (p>0,001) frente a las lecturas realizadas las 24 horas, con una media de 10,05 mm de diámetro figura 1.B .

 

Figura 1B. Medias de las lecturas las concentraciones del antígeno empleado (a) y medias de las lecturas en los diferentes tiempos de lectura con 49 mg/ml (B)

     

    Estos resultados confirmaron las 48 horas como tiempo óptimo para la lectura de las pruebas, evitando la posible disminución del diámetro de reacción a las 72 horas, como se plantea en estudios realizados y demostrados en situaciones diferentes^{(17, 18, 27)}.

2. Prueba de campo.

     Los ensayos anteriores nos proporcionaron resultados bases confiables para hacer un estudio poblacional en la comunidad de San Jacinto, un área endémica para leishmaniasis cutánea, donde el tamaño de la muestra no es un factor determinante, debido a la frecuencia de la patología o por la alta incidencia observada. Por ello se dio mayor importancia a la composición de la muestra, según grupos de edades y sexo, con relación al riesgo epidemiológico. La zona seleccionada para la prueba, es clasificada como de alto riesgo,⁽²³⁾ sobre la base de una caracterización con incidencia observada de 569 casos/año, para una prevalencia de 5,2% en una población de 13.460 habitantes. Determinado el tamaño de la muestra mediante la tabla de incidencia observada, resultó de 104 individuos a los cuales se les aplicó la prueba antigénica como explicamos anteriormente.

     El cuadro 2 muestra la distribución en grupos de edad, observados entre los individuos muestreados. Numéricamente el sexo femenino resultó ser mayor. Al aplicar la encuesta epidemiológica para presencia/ausencia de leishmaniasis, fue el sexo masculino el que presentó mayor número de lesiones activas, mientras que el grupo femenino presentó mayor número de cicatrices. No se observaron diferencias en el grupo sin antecedentes leishmánicos, en cuanto al sexo. Cada grupo fue separado según la edad de sus integrantes, observándose el grupo etario de 31 a 40 años como el predominante en sexo masculino y mayor uniformidad muestral en los distintos grupos del sexo femenino.

 

Cuadro 2. Descripción general de la población muestreada (n=104) para medir la especificidad y la sensibilidad del antígeno MAP (Leishmanina).

 

2.2. Respuesta a la intradermorreacción de acuerdo al tiempo transcurrido de contacto con el parásito.

     De 64 individuos (de uno y otro sexo) estudiados en este ensayo, 55 mostraron cicatrices y 9 presentaron lesión activa de leishmaniasis. La aplicación de la intradermorreacción arrojó un porcentaje de positividad de 92,19% en la población. Se observó que los individuos con más de 10 años de haber padecido la leishmaniasis presentaron mayor porcentaje de reacciones positivas a la intradermorreacción y la reacción fue más intensa, según la lectura de la misma, como se muestra en la figura 2.

2.3 Determinación de la especificidad y sensibilidad del antígeno monovalente.

Prueba de grupos.

     De los 104 individuos evaluados, 67 habían padecido leishmaniasis o presentaban lesión activa en el momento del estudio y 37 estaban sin antecedentes de la enfermedad, a los cuales se les aplicó la intradermorreacción, con la concentración y el tiempo de lectura seleccionados previamente, así como el control con solución salina fenolada 0,5%.

     La aplicación de la intradermorreacción en la zona de San Jacinto originó la separación de 4 grupos resultantes, según el siguiente esquema.

Grupo A: 9 pacientes con lesiones activas y diagnóstico parasitológico confirmado.

Grupo B: 58 individuos con cicatrices de lesiones curadas.

Grupo C: 27 individuos sin historia de leishmaniasis ni cicatrices evidentes, que han habitado toda su vida en el área endémica.

Grupo D: 10 individuos con enfermedades causadas por agentes etiológicos diferentes a Leishmania.

     Al analizar, los resultados obtenidos en la prueba de campo, observamos que en los grupos experimentales mostrados en el cuadro 3, el antígeno preparado con la cepa MAP detectó el 78% de los casos con lesiones activas de leishmaniasis cutánea posteriormente confirmados parasitológicamente, mientras que el 100% de los individuos que mostraron cicatrices tuvieron reacción positiva a la intradermorreacción. Encontramos a 2 personas con intradermorreacción negativa, aun cuando tenían lesiones activas confirmadas parasitológicamente con menos de 2 meses de evolución. Tanto el grupo control negativo, como los pacientes con enfermedades distintas a leishmaniasis, resultaron negativos a la intradermorreacción.

     Al aplicar la prueba de tamiz para evaluar el antígeno utilizado basándonos en los individuos con y sin leishmaniasis observamos una sensibilidad de 97% y una especificidad y valor predictivo positivo de 100%, en tanto que el valor predictivo negativo fue de 94,8% y falsos negativos de 2,99%. Encontramos el 9,6% de reacciones con diámetro mayor de 30 mm en individuos con más de 10 años de haber padecido la leishmaniasis, las que pueden considerarse como hiper-reacciones.

 

Cuadro 3. Respusta antigénica leída a las 48 horas en diversos grupos humanos de una zona endémica para leishmaniasis cuténea.

 

Discusión

     La prueba de la leishmanina, o intradermorreacción de Montenegro, es una herramienta importante en el diagnóstico clínico y epidemiológico de la leishmaniasis cutánea, utilizada durante muchos años por diversos investigadores.^{(28, 9, 8, 29)} Normalmente se han utilizado promastigotes muertos de Leishmania sp., obteniendo alta sensibilidad para medir la respuesta de hipersensibilidad retardada a través de la leishmanina como prueba diagnóstica.

     La prueba está limitada en ciertas situaciones, pues la respuesta puede persistir mucho tiempo después de la cura clínica de la enfermedad, y no permite diferenciar lesiones activas de casos curados, sobre todo cuando las lesiones son tempranas⁽¹⁴⁾.

     En este trabajo utilizamos una cepa de Leishmania del subgénero Viannia, aislada de un paciente habitante de la zona, que nos permitió preparar un antígeno monovalente que mostró cien por ciento de especificidad, debido a que las leishmanias del complejo brasiliensis (Subgénero Viannia) son las circulantes en esta región de Venezuela^(8,25).

     Los resultados relativos al crecimiento de la cepa de Leishmania MHOM/VE/1991/MAP en medio Scheinder&acute;s Drosophila son similares con los obtenidos por otros investigadores.^{(30, 31, 32)} Los parásitos se desarrollaron en este medio de manera óptima, demostrando ser relativamente sensible y utilizable de rutina para el aislamiento de cepas de Leishmania sp. desde lesiones de pacientes que provienen de áreas donde la leishmaniasis es endémica.

     Debido a la necesidad de definir el tiempo de lectura del test y la concentración óptima para la preparación de la leishmanina en las pruebas realizadas con ese objetivo, encontramos que la concentración del antígeno monovalente (cepa MAP) de 40 mg/ml de nitrógeno como proteína antigénica inyectada intradérmicamente, en un volumen de 0,1 ml y leída a las 48 horas, obtuvimos una especificidad de 100% y sensibilidad de 97%. Aunque no hubo diferencias significativas en las lecturas realizadas a las 48 con las 72 horas, otros estudios han demostrado que el diámetro de las reacciones disminuye significativamente a las 72 horas,⁽²⁷⁾ al evaluar en Guatemala un antígeno de L. major (especie natural del Viejo Mundo) para determinar su especificidad y sensibilidad en el diagnóstico de la leishmaniasis.

     Cuando comparamos lotes de antigénicos de diferentes concentraciones de proteínas no observamos diferencias significativas entre el lote de 40 y el de 60mg/ml, por lo cual decidimos utilizar la menor concentración de parásitos, suficiente para producir una respuesta inmunológica⁽⁴⁾; esta concentración de proteínas ha sido utilizada con buenos resultados en la aplicación de la intradermorreacción en Guatire, estado Miranda, Venezuela.⁽²⁶⁾

     La prueba de campo detectó el 78% de los casos con lesiones activas de leishmaniasis, siendo incapaz de detectar dos casos con lesiones activas con menos de 2 meses de evolución, sugiriendo que estos individuos pueden no haber estado sensibilizados en el momento de la aplicación de la prueba.⁽³³⁾ También observamos el 9,6% de reacciones mayores de 30mm de diámetro, casi el doble de lo reportado en pacientes venezolanos con leishmaniasis cutáneas.⁽⁴⁾ En nuestro caso es aceptable, teniendo en cuenta que estudiamos un área endémica clasificada de alto riesgo para la transmisión de leishmaniasis cutánea, lo que obliga a una continua exposición a la acción de vectores infectados.⁽²³⁾

Conclusiones

•      Se confirma el valor de la intradermorreacción como herramienta epidemiológica complemento de la prueba diagnóstica. La sensibilidad del antígeno usado complementó el diagnóstico parasitológico y la encuesta clínica, mientras que su especificidad demostró la información histórica del contacto antigénico.

•      Una reactividad antigénica del 78% a la leishmanina MAP se observó en pacientes con leishmaniasis activa, mientras que en los pacientes tratados y curados se observó el 100% de respuesta. En individuos sin antecedentes leishmánicos sanos e individuos con otras patológicas, el antígeno resultó ser altamente específico y no se observaron reacciones cruzadas.

Recomendaciones

     Dado el aumento de casos de leishmaniasis en Venezuela⁽³⁴⁾ es importante tener presente que la IDR es sólo una herramienta que complementa al diagnóstico, en especial cuando se realizan estudios epidemiológicos.

     Es ideal contar con antígenos elaborados con cepas propias que puedan ser comparados con controles que cumplan las normas de bioseguridad.

     Asegúrese de la identidad de la cepa y de la respuesta alérgica que pueda hacer el paciente al vehículo del preparado antigénico.

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