Supervivencia de un aislado de Escherichia coli O157:H7 en jugos de naranja no pasteurizados de expendio comercial.

Survival of strain of Escherichia coli O157:H7 in unpasteurized orange juice commercially expended.

Rojas T¹, Castillo Z².

1. Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo, Valencia, Venezuela.

2. Microfast Occidente, Productos 3M.

RESUMEN

    En este estudio se evaluó la supervivencia de un aislado de Escherichia coli O157:H7 en jugos de naranja no pasteurizados de expendio comercial. Las muestras fueron preparadas ajustándose sus pH a tres niveles: 3,0; 3,5 y 4,0. Un inóculo del aislado de 10⁵ UFC/ml fue preparado e inoculado en las muestras a los distintos pH, siendo almacenadas a 5 y 10°C. El número de células viables se determinó por recuento en placa, durante cuatro días consecutivos a la inoculación. En niveles no detectables del microorganismo por recuento en placa, se utilizó una técnica de pre-enriquecimiento y detección por ELISA. Los resultados revelan diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) en la supervivencia del microorganismo entre las temperaturas de almacenamiento utilizadas, obteniéndose recuentos mayores de células viables a 5°C. La supervivencia del microorganismo frente a los distintos tratamientos de pH, presentó diferencias estadísticamente significativas (p< 0,05), tanto a 5 como a 10°C. A pH 3,0 y 3,5 la población se reduce en 4 ciclos logarítmicos, mientras que a pH 4,0 la reducción fue de 2,5 ciclos, tanto a 5 como a 10°C. Los datos indican que la supervivencia del microorganismo fue observada hasta por 8 días post-inóculo, y en los primeros 4 días los niveles de células viables se encuentran en el orden de 10² a 10⁴ UFC/ml de jugo.

ABSTRACT

    In this study the survival of strain of Escherichia coli O157:H7 was evaluated in unpasteurized orange juices commercially expended. The samples were prepared being adjusted their pH at three levels: 3,0; 3,5 and 4,0. An inocula of strain (10⁵ CFU/ml) was prepared and inoculated in the samples to the different pH, being stored at 5 and 10°C. The number of viable cells was determined by surface plating, during four serial days to the inoculation. In levels non detectable of the microorganism by surface plating was used a pre-enrichment technique and detection by ELISA. The results reveal significant differences (p<0,05) in the survival of the microorganism among the utilized storage temperatures, being obtained recounts bigger than viable cells to 5°C. The survival of the microorganism to the different pH treatments, presented differences statistically significant (p<0,05) as much to 5 as to 10°C. To pH 3,0 and 3,5, the population decreases in 4 logarithmic cycles, while to pH 4,0 the reduction was of 2,5 cycles, as much to 5°C as to 10°C. The data indicate that the survival of the microorganism was observed until for 8 days post-inocula, and in the first 4 days the levels of viable cells are in the order from 10² to 10⁴ CFU/ml of juice.

Palabras-clave: Escherichia coli O157:H7, jugo de naranja, supervivencia.

INTRODUCCIÓN

    En los últimos años se ha incrementado el número de brotes de infecciones transmitidas por el consumo de jugos de frutas no pasteurizados de expendio comercial. De hecho, en países como Estados Unidos y Canadá se han reportado, desde 1990, alrededor de 15 brotes, en los cuales se aislaron patógenos tan variados como Salmonella, Cryptosporidium y Escherichia coli O157:H7^(1,2,3). De estos patógenos es quizás Escherichia coli O157:H7 el que mayor peligrosidad representa para el consumidor, dadas sus características de patogenicidad, por cuanto puede producir cuadros que van desde púrpura trombocitopénica y anemia hemolítica, hasta colitis hemorrágica e insuficiencia renal aguda, que en ocasiones pueden producir la muerte del paciente⁽⁴⁾.

    Aunque la acidez y el pH bajo en los jugos de frutas pueden ser factores antagonistas para la supervivencia de muchos patógenos, estos elementos por sí solos no garantizan la inocuidad de este tipo de productos. Este hecho se hace notorio en el caso de Escherichia coli O157:H7, la cual es inusualmente resistente a las condiciones de acidez típicas de los jugos de frutas. Es así como jugos de manzana cuyos pH oscilan entre 3,0 y 3,5, han sido asociados como vehículos de transmisión del microorganismo^(2,5). Numerosos estudios han concluido que la supervivencia del microorganismo en este tipo de jugos, oscila entre 5 y 30 días, mantenidos generalmente a temperaturas de refrigeración⁽³⁾. En otros productos igualmente ácidos, como es el caso del yogur, el microorganismo ha permanecido viable durante semanas en almacenamiento a 4°C.

    Esta tolerancia de Escherichia coli O157:H7 es una característica compartida con otros géneros de la familia Enterobacteriaceae, siendo dicha tolerancia altamente dependiente de la fase de crecimiento del microorganismo. La máxima resistencia se obtiene en la fase estacionaria de la curva de crecimiento, mientras que la mínima tolerancia se expresa en la fase logarítmica⁽⁶⁾. Algunos autores reportan que la tolerancia a la acidez está asociada a un gen denominado rpos, el cual codifica en la fase estacionaria un factor sigma el cual confiere la resistencia a condiciones de pH adversas. Se ha observado además que la resistencia a la acidez es superior en cepas que han permanecido en condiciones ácidas previas y a bajas temperaturas, lo que permite que este tipo de células presente ventajas frente a las condiciones ácidas del estómago, pudiendo resistirla y producir la infección^(7,8).

    A pesar de que los jugos de naranja no pasteurizados no han sido implicados como vehículos de transmisión de Escherichia coli O157:H7, sí se han asociado con otros tipos de patógenos. Tal es el caso de un brote ocurrido en Estados Unidos, en el cual se detectó un brote por Salmonella enteritidis serotipo anatum después del consumo de jugo de naranja no pasteurizado. El estudio reveló que la posible contaminación se produjo por adición del microorganismo durante el procesamiento, debido a contaminación superficial de la fruta en el momento de la cosecha y por ausencia de un lavado escrupuloso de la fruta al momento de procesarla⁽⁹⁾. Esto sugiere que el jugo de naranja no pasteurizado representa un producto con el potencial de vehiculizar numerosos microorganismos patógenos, entre ellos Escherichia coli O157:H7. Ante esto, resulta interesante estudiar el comportamiento del microorganismo en este tipo de producto, para determinar su capacidad de adaptación y supervivencia en relación con distintas variables que pudieran estar involucradas, tales como pH, temperatura y flora microbiana presente . En función de lo expuesto en el presente estudio, se determinó la supervivencia de una cepa de Escherichia coli O157:H7 en jugos de naranja no pasteurizados de expendio comercial, sometida a distintas condiciones de pH y almacenamiento, dado el incremento del consumo de este tipo de productos, y que podrían ser potenciales vehículos para la transmisión del microorganismo

MATERIALES Y METODOS

    Cepa utilizada: Se utilizó una cepa de Escherichia coli O157, aislada de carne de hamburguesa, perteneciente a la bacterioteca del Laboratorio de Microbiología de Alimentos del Departamento de Procesos Biológicos y Bioquímicos de la Universidad Simón Bolívar. Este aislado fue caracterizado fenotípicamente a través del sistema Microscam, y su caracterización serológica se efectuó utilizando antisueros para el grupo enterohemorrágico (Fuvesin, Instituto de Biomedicina, UCV).

    Preparación del inóculo bacteriano: El aislado de E. coli O157 se transfirió a un caldo de soya tripticasa (CST) (Difco Laboratories, Detroit, Mi.), el cual se incubó a 35°C por 24 horas. 20 ml del cultivo se transfirieron a un tubo de centrífuga y se centrifugaron a 4.000 g por 15 min, suspendiéndose el paquete celular en 20 ml de solución 0,1 M de buffer fosfato pH 7,2 (PBS). Este procedimiento se realizó por tres veces consecutivas. A partir de la suspensión obtenida del ultimo lavado se procedió a realizar diluciones seriadas en PBS, hasta lograr un inóculo de 10⁷ UFC/ml.

    Inoculación de las muestras de jugos y enumeración de células viables: Se prepararon unidades experimentales, conteniendo cada una 99 ml de jugo de naranja no pasteurizado y se procedió al ajuste de pH a valores de 3,0; 3,5 y 4,0. Para cada tratamiento de pH se prepararon unidades experimentales por duplicado, utilizándose dos lotes, uno para ser almacenado a 5°C y el otro para su almacenamiento a 10°C. Estas muestras se inocularon con 1 ml de la suspensión de E. coli O157 en PBS (10⁷ UFC/ml), a fin de obtener una densidad bacteriana de 10⁵ UFC/ml de jugo. Las muestras inoculadas fueron almacenadas tanto a 5 como a 10°C, determinándose el número de células viables a intervalos de 0, 1, 2, 3, 4 días posteriores a la inoculación, utilizando como medio selectivo agar MacConkey-Sorbitol (AMS) (Difco Laboratories, Detroit, Mi.), el cual se inoculó con 0,1 ml de jugo y se incubó a 35°C por 24 horas. Transcurrida la incubación se procedió al recuento de células viables de E. coli O157, considerándose sólo las colonias incoloras presentes en el medio AMS, confirmándose luego como serogrupo O157 al tomar 5 colonias al azar y ser sometidas a serotipificación con antisueros antihemorrágicos. Para la determinación de células viables en ausencia de crecimiento en agar AMS se procedió a pre-enriquecimiento de 25 ml de jugo en caldo soya tripticasa, incubándose a 35°C por 18 horas. De este caldo se tomó 1 ml para aplicar luego un ensayo inmunoenzimático (TECRA E. coli O157 VIA, TECRA^R DIAGNOSTIC, Australia) para la detección de E. coli O157, siguiendo la metodología especificada por el fabricante.

    Análisis de los resultados: A los datos obtenidos se les aplicó un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías, utilizando el programa estadístico Statgraphics versión 2.1.

RESULTADOS

    Supervivencia del aislado de Escherichia coli O157 en las muestras de jugos almacenadas a 5 °C. La supervivencia del microorganismo en las unidades experimentales almacenadas a 5°C, luego de aplicados los distintos tratamientos de pH (3,0; 3,5 y 4,0), presentó diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). En la figura 1 se observa el comportamiento del aislado en las unidades almacenadas a 5°C. A pH 3,0, la reducción a los 2 días post-inóculo fue de 5,0 log₁₀ UFC/ml a 3,2 log₁₀ UFC/ml, aproximadamente 1,7 ciclos logarítmicos, mientras que al cuarto día la población se redujo de 5,0 log₁₀ UFC/ml a menos de 10 log₁₀ UFC/ml. Similar comportamiento se observó en los patrones de supervivencia, al aplicar el tratamiento con pH 3,5, siendo la declinación en el número de células viables de alrededor de 1,5 ciclos logarítmicos al segundo día post-inóculo y de 4 ciclos logarítmicos al cuarto día. Al aplicar el tratamiento de pH 4,0, las células sobrevivientes recuperadas por recuento en placa de AMS fue significativamente superior (p< 0,05) en relación con los otros tratamientos (pH 3,0 y 3,5). En los dos primeros días post-inóculo la reducción fue de 5,0 log₁₀ UFC/ml a 4,8 UFC/ml, lo que representa una disminución de células viables de menos de 0,5 ciclos logarítmicos, mientras que al cuarto día el número de células recuperadas fue de 2,5 log₁₀ UFC/ml, estimándose la reducción de la población en aproximadamente 2,5 ciclos logarítmicos.

Figura 1. Supervivencia de Escherichia coli O157-H7 en jugos de naranja no pasteurizados almacenados a 5°C.

    Supervivencia del aislado de Escherichia coli O157 en las muestras de jugos almacenadas a 10°C. La supervivencia del microorganismo en las unidades almacenadas a 10°C fue significativamente menor que en las almacenadas a 5°C (p<0,05); no obstante, el comportamiento del aislado frente a los distintos tratamientos de pH aplicados a esta temperatura arrojó diferencias estadísticamente significativas (p< 0,05). Tal y como se aprecia en la figura 2, a pH 3,0 existe una disminución en el número de células viables desde 5,0 log₁₀ UFC/ml hasta 3,8 log₁₀ UFC/ml hacia el segundo día post-inóculo, mientras que, a pH 3,5, en el mismo período de tiempo, el decremento en la población viable fue de 5,0 log₁₀ UFC/ml a 2,1 log₁₀ UFC/ml, aproximadamente 2,0 ciclos logarítmicos. Para el cuarto día, los niveles de E. coli sobrevivientes, a pH 3,0, fueron de 1,7 log₁₀ UFC/ml, y para pH 3,5 la disminución fue mayor de 4,0 ciclos logarítmicos, con una población viable que se ubicó en menos de 1,0 UFC/ml. Los decrementos en la población del aislado a pH 4,0, fueron significativamente menores (p<0,05), si se comparan con los valores obtenidos con los pH descritos con anterioridad (figura 2). Se aprecia que al segundo día post-inoculación, el recuento de células viables está en el orden de 4,8 log₁₀ UFC/ml (0,3 ciclos logarítmicos), y hacia el cuarto día este valor se ubicó en 2,8 log₁₀ UFC/ml (1,5 ciclos logarítmicos).

Figura 2. Supervivencia de Escherichia coli O157-H7 en jugos de naranja no pasteurizados almacenados a 10°C.

    Supervivencia del aislado en niveles no detectados por recuento en placa de AMS. A partir del quinto día no se logró la detección de células viables por recuento en placa sobre AMS; sin embargo, entre el día 6 y 8 post-inóculo el aislamiento fue posible, al aplicar una fase de preenriquecimiento y posterior determinación de células viables por ensayo inmunoenzimático (ELISA). Esto permitió comprobar la supervivencia del microorganismo hasta por 8 días post-inóculo.

DISCUSIÓN

    Aunque la concentración de ácidos orgánicos y el bajo pH de los jugos de frutas pueden ser antagonistas de un amplio número de bacterias patógenas, estos factores por sí solos no aseguran la inocuidad de este tipo de productos. De hecho, los procesos de elaboración de jugos comercialmente expendidos, se basan en algún mecanismo que permite la eliminación de microorganismos patógenos, siendo el más común la pasteurización, la cual permite la obtención de un producto relativamente confiable^(10,11). A pesar de esto, la tendencia en muchos países se orienta hacia el consumo de alimentos con el menor procesamiento posible y el mínimo agregado de aditivos, con la finalidad de no alterar las características organolépticas y su riqueza nutricional, pero con el consiguiente riesgo de que puedan ser vehículos de muchos patógenos que han demostrado capacidad de adaptación a las condiciones adversas presentes en este tipo de productos⁽¹²⁾. Es por esto que se han dirigido esfuerzos a fin de conocer el comportamiento de numerosos patógenos en productos con mínimo procesamiento, y en especial en jugos no pasteurizados, dadas las numerosas implicaciones de éstos en distintos brotes, algunos con consecuencias graves.

    Así, la intención del presente estudio fue determinar la supervivencia de un aislado de E. coli O157 en jugos de naranjas no pasteurizados, a fin de dilucidar cuál es el potencial de riesgo que podría ofrecer este tipo de productos como vehículo de transmisión de este microorganismo. Los resultados obtenidos en esta investigación demuestran que la supervivencia del aislado de Escherichia coli O157:H7 en las muestras de jugos es posible, y depende significativamente del pH de las mismas. Así, aun con variaciones en el número de células viables recuperadas para cada tratamiento de pH, quedó demostrado que en todas las unidades experimentales evaluadas hubo recuperación del microorganismo hasta por 8 días posteriores a la inoculación. Tal y como se aprecia en las figuras 1 y 2, a los dos días post-inoculación el recuento del microorganismo, tanto a 5 como a 10°C, para los pH 3,0 y 3,5, oscilan entre 10³ y 10⁴ UFC/ml, con un decremento para el cuarto día que se ubica en aproximadamente 10 UFC/ml. A pH 4,0 la supervivencia fue significativamente mayor, obteniéndose recuentos al segundo día de 10⁴ UFC/ml y al cuarto día de 10² UFC/ml. Esto permite inferir que la supervivencia del microorganismo en este tipo de producto es posible y va a depender del inóculo inicial, del pH del producto, el tiempo, temperatura de almacenamiento y la flora microbiana preexistente. Estos resultados concuerdan con otros reportes de supervivencias del microorganismo en distintos productos de alta acidez. De hecho, Miller y Kaspar⁽¹³⁾ reportan supervivencias del 98% de células viables, con relación al inóculo inicial, en cidras de manzanas, pH 3,5 a 4,0, hasta por 21 días. Así mismo, Chikthimmah y Cols.⁽¹⁴⁾, evaluaron la supervivencia de este patógeno igualmente en cidras cuyos pH oscilaban entre 3,5 y 4,3, reportando el aislamiento de células viables durante 18 días a temperaturas de almacenamiento de 4 °C. Zhao y Cols. ⁽⁶⁾, reportan supervivencias hasta por 10 días conteniendo inclusive benzoato de sodio al 0,1 %, mientras que Hsin-Yi y Chou ⁽¹⁵⁾, reportan recuperación de células viables en distintos tipos de jugos (pH de 3,2 a 3,9) hasta por 12 días a temperaturas de almacenamientos de 10 °C.

    Si se analiza el número de células viables presentes en las unidades experimentales, considerando los dos primeros días posteriores a la inoculación, en los distintos tratamientos de pH, los valores obtenidos se encuentran en niveles considerados como dosis altamente infectantes, según lo reportado por ciertos autores^(8,16). Aun con una disminución considerable en el número de microorganismos viables hacia el cuarto día, a pH 3,0 y 3,5, y de menor cuantificación a pH 4,0, los niveles de inóculo presentes (figuras 1 y 2) siguen siendo de riesgo, por cuanto para otros microorganismos tolerantes a la acidez, como Shigella flexneri y Listeria monocytogenes, se reportan dosis infectantes que oscilan entre 10 y 500 células, y probablemente para Escherichia coli O157:H7 estas dosis sean parecidas⁽¹⁶⁾.

    Los datos presentados en las figuras 1 y 2, describen el comportamiento de la población sobreviviente luego de cuatro días de almacenamiento a las dos temperaturas evaluadas, tomando en consideración la vida media de consumo de estos jugos no pasteurizados; no obstante, en el presente estudio se logró la detección de células viables hasta por 8 días post-inóculo, utilizando métodos de preenriquecimiento y detección del microorganismo por técnicas inmunoenzimáticas (ELISA), y no necesariamente se logró recuperación de las mismas a través de aislamiento en AMS. Esto indica que existe un porcentaje de células viables, aún después de 8 días de inoculación, que probablemente muestren señales de estrés y que, por lo tanto, no son recuperables por los métodos de recuento en placa utilizados, y que para su recuperación se hace necesario un preenriquecimiento previo que permita un aumento en la población y así lograr su aislamiento e identificación. De hecho, se reporta la presencia de células viables pero no cultivables de E. coli O157 cuando son sometidas a condiciones de estrés extremas, tales como: calentamiento, congelamiento y acidez, lo que provoca en las células un estado de latencia más no de disminución de su virulencia, por lo que al conseguir condiciones favorables para su reproducción éstas pueden representar un peligro real, sobre todo si esta reactivación es a nivel intestinal⁽¹⁷⁾. Ante esto, algunos autores recomiendan la utilización de métodos de preenriquecimiento previo con medios poco selectivos, a fin de otorgar la posibilidad de recuperación de las células lesionadas y que se encuentren en bajo número, para luego aplicar algún método que permita la identificación del patógeno⁽¹⁸⁾. En el presente estudio quedó demostrado que, a pesar de no poderse recuperar el microorganismo a través del aislamiento convencional, posiblemente por estrés, estas células sí fueron recuperadas después del enriquecimiento, determinándose viabilidad de las mismas, aún por 8 días post-inóculo.

    Los hallazgos denotados anteriormente son significativos, por cuanto, a medida que transcurre el tiempo, las células remanentes se encuentran en una fase de adaptación a las condiciones de acidez presentes, lo que permite que se seleccionen los individuos más resistentes, los cuales serán capaces, en bajo número, de atravesar la barrera ácida que representa el pH de la mucosa gástrica y, por lo tanto, producir infección. Este fenómeno de adaptación ha sido reportado por varios autores^(16,19,20), quienes han estudiado los mecanismos de adaptación del microorganismo, dentro de los que destacan la aparición de una fase de latencia en la que se expresan varios genes que permiten la adaptación del microorganismo a condiciones de acidez y son considerados de mucha importancia en la adaptación a las condiciones de estrés. Esto sugiere que mientras más tiempo se encuentre el microorganismo bajo condiciones de pH ácido, más se producirá en éste la expresión de mecanismos de resistencia que favorecerán las propiedades de colonización del microorganismo, aun en condiciones de extrema acidez.

    Ante los numerosos brotes que se han presentado asociados al consumo de jugos de frutas no pasteurizados, y sobre todo por la severidad de las infecciones causadas por el consumo de las mismas, muchos organismos internacionales, entre ellos la FDA, han legislado con la finalidad de disminuir los riesgos a la salud asociados con estos productos⁽²¹⁾. Los resultados obtenidos en la presente investigación y en otros estudios ya mencionados sugieren que para lograr la inocuidad de este tipo de productos es necesario aplicar algún tratamiento que garantice la disminución o, preferentemente, la eliminación de este patógeno. Sin lugar a dudas, el tratamiento más adecuado resulta ser la pasteurización; sin embargo, el hecho de que muchos de estos jugos comercializados en la actualidad son producidos a través de máquinas extractoras localizadas en supermercados, hace difícil que se produzca algún procesamiento térmico luego de la extracción, por lo que se estudian otras alternativas que permitan controlar este tipo de patógenos. Se ha propuesto el uso de ácidos orgánicos tales como ácido láctico, ácido sórbico y ácido propiónico en concentraciones de 0,1 %, como una alternativa adecuada en este tipo de jugos para la disminución del riesgo de transmisión del microorganismo⁽³⁾. No obstante, se hace difícil lograr la aplicación de este tipo de métodos de control, por cuanto generalmente los expendedores de este tipo de productos desconocen el problema y, en todo caso, no disponen de una adecuada asesoría que les permita establecer un plan mínimo que permita reducir el riesgo asociado al consumo de jugos no pasteurizados.

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