Identificación de Cryptococcus neoformans var. gattii mediante el uso del medio canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB).

Identification of Cryptococcus neoformans var. gattii by canavanine glycine bromothymol blue medium (CGB).

Pérez C*, Hernández Y***, Colella MT**, Roselló A**, Hartung de Capriles C**, Olaizola C*, Magaldi S**, Mata-Essayag S*.

* Médicos Adjuntos de la Sección de Micología Médica, Instituto de Medicina Tropical, UCV.

** Asistentes de Investigación de la Sección de Micología Médica, Instituto de Medicina Tropical, Universidad Central de Venezuela (UCV).

*** Estudiante de Pregrado de la Facultad de Medicina, UCV.

RESUMEN

Se conocen 2 variedades de Cryptococcus neoformans y 5 serotipos: Cryptococcus neoformans var. neoformans (serotipos A, D y AD), usualmente aislados a partir de muestras clínicas, encontrándose Cryptococcus neoformans var. neoformans serotipo A, con mayor incidencia en pacientes con SIDA; Cryptococcus neoformans var. gattii (serotipos B y C), los cuales son aislados menos frecuentemente, principalmente en pacientes VIH seronegativos y excepcionalmente han sido asociados con SIDA.

Se estudiaron 43 cepas de Cryptococcus neoformans. El medio de canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) permite diferenciar en Cryptococcus la variedad gattii de la variedad neoformans.

Nuestro estudio refleja que las 2 cepas (4,65%) de Cryptococcus neoformans var. gattii, obtenidas a partir del aislamiento de muestras de líquido cefalorraquídeo, procedían de una paciente con inmunodeficiencia celular y humoral catalogada como idiopática, y de un paciente con SIDA, asociación rara vez reportada.

Son escasos los estudios epidemiológicos de esta micosis en Venezuela, y pocos hacen una identificación más allá de la especie, por lo cual es difícil comparar nuestros resultados.

Palabras-clave: Cryptococcus neoformans, gatii, variedad, canavanina-glicina-azul de bromotimol.

SUMMARY

Two variants of Cryptococcus neoformans and 5 serotypes have been described: Cryptococcus neoformans var neoformans (serotype A, D y AD) are most likely to be isolated from patient specimens than Cryptococcus neoformans var neoformans serotype A, recovered in AIDS patients; Cryptococcus neoformans var gattii (serotypes B y C), have been exceptionally associated with AIDS patients.

43 Cryptococcus neoformans isolates were studied. Canavanine glycine bromothymol blue medium (CBG) has been shown to be a reliable medium to identify Cryptococcus neoformans var gattii

2 isolates (4.65%) of Cryptococcus neoformans var gattii, were isolated from the cerebrospinal fluid, one of a patient with diagnosis of idiopathic cellular and humural immunodeficiency, and the other of an AIDS patient.

Epidemiological studies are limited in Venezuela and identifications of the fungus rarely include subspecies or serotype.

INTRODUCCIÓN

La criptococosis, habitualmente producida por Cryptococcus neoformans var. neoformans, es la cuarta entre las enfermedades infecciosas graves que con más frecuencia son causa de muerte en los enfermos con SIDA en los Estados Unidos y en Europa. En los países en desarrollo su incidencia es mayor; así en África Central es, junto con la tuberculosis, la infección más común, y se calcula que alrededor del 20% de los enfermos con SIDA padecen de esta enfermedad. Lamentablemente, en Venezuela no existen cifras oficiales que reflejen el comportamiento de esta micosis [1-4].

Cryptococcus neoformans es una levadura globosa, circundada de una cápsula mucilaginosa muy espesa al estado parasitario, menos gruesa al estado saprofítico, por lo que las células tienen un tamaño variable entre 3 y 20 µm. La presencia de la cápsula confiere a las colonias de Cryptococcus un aspecto mucoso filante [5].

Tradicionalmente, han sido identificadas 2 variedades y 5 serotipos de Cryptococcus neoformans: Cryptococcus neoformans var. neoformans (serotipos A, D y AD), usualmente aislados a partir de muestras clínicas, encontrándose Cryptococcus neoformans var. neoformans serotipo A, con mayor incidencia en pacientes con SIDA; Cryptococcus neoformans var. gattii (serotipos B y C), los cuales son aislados menos frecuentemente, principalmente en pacientes VIH seronegativos y, excepcionalmente, han sido asociados con SIDA [6-10].

Recientemente, algunos autores [11] sostienen la presencia de una tercera variedad, la cual fue denominada var. grubii. Este hallazgo surge como consecuencia de estudios de biología molecular practicados a las cepas de Cryptococcus neoformans var. neoformans, asignándosele a Cryptococcus neoformans var. neoformans el serotipo D y a la var. grubii del mismo, el serotipo A.

Desde el punto de vista epidemiológico, la var. neoformans es de distribución mundial; ésta se ha aislado de diversas fuentes ambientales, como por ejemplo, a partir de las deyecciones de aves, trozos de madera, frutas en descomposición y diversas especies de árboles; siendo la distribución de la var. gattii más restringida, limitada a países con climas tropicales y subtropicales, específicamente aislada de árboles pertenecientes al género Eucalyptus (E. camaldulensis, E. tereticornis) y en los almendros (Terminalia catappa) [11-22].

El evaluar la capacidad de asimilar la L-canavanina y la glicina, nos permite realizar la determinación de la variedad del Cryptococcus en estudio. Datos todos estos, importantes en lo referente, al estudio epidemiológico de la criptococosis [23].

En la actualidad se han desarrollado múltiples métodos automatizados, como el API o el MicroScan^®, entre otros, con la finalidad de simplificar y acelerar la identificación de los hongos, los cuales tienen la desventaja de ser muy costosos y, además, pueden originar diagnósticos errados cuando se evalúan cepas cuyo comportamiento bioquímico o enzimático no es el habitual y no identifican la variedad de Cryptococcus neoformans [24].

La diferenciación entre las 2 variedades pertenecientes a la especie Cryptococcus neoformans se puede realizar basándose en las características morfológicas en su estado perfecto o teleomorfo, por medio de la investigación de sus antígenos capsulares, proceso éste denominado serotipificación, o por pruebas bioquímicas, que evalúan la capacidad que presentan las variedades de asimilar ciertos aminoácidos [23, 25-28].

En 1992, Kwon Chung y Bennett describieron un medio selectivo y diferenciador, el medio de canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB), el cual desde entonces ha sido utilizado ampliamente como prueba bioquímica patrón para este fin [23].

Dicha prueba se fundamenta en la particularidad que presenta Cryptococcus neoformans var. gattii de ser resistente a la L-canavanina (aminoácido natural estructuralmente similar a la L-arginina), el cual es degradado por las cepas de esta variedad, liberando amonio como compuesto final. El amonio en el medio eleva el pH del mismo, que pasa de 5,8 a 7 o más, virando el color del medio de amarillo verdoso a un azul de cobalto, por la presencia de azul de bromotimol.

La L-canavanina actúa como una droga, inhibiendo el crecimiento de Cryptococcus neoformans var. neoformans. El 60% de las cepas de Cryptococcus neoformans var. neoformans serotipo A, son resistente a la L-canavanina, pero no asimilan la glicina presente en el medio. De esta manera se inhibe el crecimiento del 100% de las cepas pertenecientes a Cryptococcus neoformans var. neoformans, permaneciendo sin cambio el color del medio de cultivo [23].

El propósito del presente trabajo fue evaluar la utilidad del medio CGB para identificar la variedad de las cepas de Cryptococcus neoformans en estudio.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas

Se utilizaron 43 cepas de Cryptococcus sp., de las cuales 17 fueron aisladas de muestras de líquido cefalorraquídeo, recibidas y procesadas en la Sección de Micología Médica del Instituto de Medicina Tropical de la Universidad Central de Venezuela, entre enero de 2001 y diciembre de 2002; dichas muestras provenían de pacientes con sospecha de criptococosis del Hospital Universitario de Caracas y de otros hospitales del área metropolitana de Caracas. Las 26 cepas restantes provenían de la micoteca de esta sección, las cuales fueron aisladas de diversas muestras clínicas y conservadas en dicha micoteca utilizando el método de Castellani, siendo introducidas en el agua destilada entre los años 1962 y 2000.

Se utilizaron como cepas de control: control positivo: Cryptococcus neoformans (WC 1400 IMT) y control negativo: Candida albicans (ATCC 90028)

Aislamiento de cepas a partir de líquido cefalorraquídeo

Todas las muestras de líquido cefalorraquídeo recibidas en la Sección de Micología Médica entre enero de 2001 y diciembre de 2002 fueron sembradas en agar cerebro-corazón-infusión, enriquecido con sangre (agar BHI con sangre) [29] y Sablac [30] para su aislamiento. Las muestras se sembraron en 2 tubos con el medio agar BHI con sangre y en 2 tubos con el medio de Sablac, permaneciendo en estufa a 35°C por un lapso de 5 días.

Se realizó la prueba de la ureasa utilizando el caldo urea de Stuart (interpretación de la prueba: color rosado intenso o fucsia = hidrólisis de la urea y color amarillo o rosado muy claro = ausencia de hidrólisis de las urea) [29,31].

Identificación automatizada

Todas las cepas estudiadas, se identificaron a través del método automatizado MicroScan^® DADE BEHRING [24], utilizando los paneles de identificación rápida de levaduras.

Medio canavanina-glicina-azul de bromotimol (medio CGB)

Solución A: Glicina 10 g; fosfato de potasio monobásico KH₂PO₄ 1 g; sulfato de magnesio MgSO₄ 1 g; tiamina-HCl 1 mg; sulfato de L-canavanina 30 mg; agua destilada100 ml; pH 5,6. Se esterilizó por filtración (0,45 m).

Solución B: Azul de bromotimol 0,4%; agua destilada 100 ml. Para 1.000 ml del medio: solución B 20 ml; agua destilada 880 ml; agar 20 g; solución A 100 ml.

Se mezcló la solución B con el agua destilada y el agar. Se esterilizó en autoclave y, al entibiar, se agregó la solución A. Se distribuyó a razón de 4 ml por tubo, dejando solidificar con taco y bisel [23].

A partir de un cultivo de 48 horas de crecimiento a 35°C en medio de Sablac, se procedió a realizar la siembra en la superficie del bisel. Se dejaron a temperatura ambiente y se observaron diariamente hasta un máximo de 5 días.

Interpretación de los resultados: Color amarillo o amarillo-verdoso = C. neoformans var. neoformans; color azul de cobalto = C. neoformans var. gattii.

Estadística

En el presente estudio la técnica aplicada consistió en estadística descriptiva, en donde se usaron tablas de frecuencias, determinación de porcentajes y sensibilidad.

RESULTADOS

De un total de 102 muestras de líquido cefalorraquídeo recibidas y procesadas en la Sección de Micología Médica del Instituto de Medicina Tropical entre los años 2001 y 2002, se aislaron 17 cepas de Cryptococcus sp., una de las cuales se pudo aislar solamente a partir del medio agar BHI con sangre y no creció en el medio de Sablac (tabla 1).

Tabla 1: Comparación de la efectividad en el aislamiento de las 17 cepas de Cryptococcus sp obtenidas entre los años 2001 y 2002, con los medios de Sablac y agar BHI con sangre.

Con respecto a la identificación efectuada a través del aparato automatizado MicroScan^® DADE BEHRING, todas las 43 cepas en estudio, tanto las 17 cepas aisladas entre los años 2001 y 2002, como las 26 cepas procedentes de la micoteca, resultaron pertenecientes a la especie Cryptococcus neoformans.

Con relación a la prueba de la ureasa, se observó que el 100% (43) de las cepas de Cryptococcus neoformans evaluadas resultó ureasa-positivo.

En la determinación de la variedad con el uso del medio CGB, se encontró que el 95,35% (41) de las cepas correspondieron a C. neoformans var. neoformans; el 4,65% (2) de las cepas restantes fueron identificadas como var. gattii (tabla 2, figura 1).

Tabla 2: Determinación de la variedad de las 43 cepas estudiadas, con el medio CGB.

 

Figura 1. Medio canavanina-glicina-azul de bromotimol.

A. Medio virgen. B. Medio de color verde: C. neoformans var. neoformans.

C. Medio de de color azul cobalto: C. neoformans var. gatii.

DISCUSIÓN

De las cepas por nosotros estudiadas, el 95,35% (41) correspondieron a C. neoformans var. neoformans, lo cual representa un porcentaje similar a los múltiples reportes epidemiológicos existentes, en los cuales C. neoformans var. neoformans es el principal responsable de los casos de criptococosis a nivel mundial, aislado de aproximadamente el 99% de los pacientes con SIDA, muy probablemente por estar éstos más expuestos al hábitat natural de esta variedad cosmopolita [2, 4, 6, 7, 10, 14, 32, 33-38].

Por el contrario, los reportes de criptococosis en los que se ha aislado C. neoformans var. gattii como agente causal son muy escasos. De manera particularmente excepcional es el agente causal de esta entidad en los pacientes con SIDA, siendo más afectados los pacientes VIH seronegativos, con alguna condición de base de inmunosupresión o sin ésta, que habitan en áreas tropicales y subtropicales. Esta afinidad observada de la var. gattii por los pacientes VIH seronegativos aún no ha sido aclarada. [2, 6, 8, 14, 16, 33, 36, 38, 40-42].

Nuestro estudio refleja que las 2 cepas (4,65%) de Cryptococcus neoformans var. gattii obtenidas a partir del aislamiento de muestras de líquido cefalorraquídeo procedían de una paciente con inmunodeficiencia celular y humoral catalogada como idiopática y de un paciente con SIDA, asociación rara vez reportada.

En Latinoamérica, este comportamiento epidemiológico es similar a lo descrito en el resto del mundo [2, 4, 6, 36, 39, 40, 42-45]. Un estudio multicéntrico realizado por Calvo y col. [46], con 100 cepas aisladas de muestras clínicas procedentes de Brasil (69), Venezuela (20) y Chile (20), reporta 89 aislamientos identificados como C. neoformans var. neoformans y 11 identificados como C. neoformans var. gattii. Todas las cepas de C. neoformans var. gattii, procedían de pacientes VIH negativos.

En Venezuela, Villanueva y col. [37] realizaron la determinación de la variedad y serotipo de 27 cepas de C. neoformans aisladas en nuestro país, reportando un predominio de C. neoformans var. neoformans y un 3,7% de C. neoformans var. gattii.

El medio de canavanina-glicina-azul de bromotimol resultó ser un medio útil para determinar la variedad de C. neoformans. Sugerimos implementar este medio para la determinación de la variedad de C. neoformans, en beneficio del estudio epidemiológico de la criptococosis.

En el presente trabajo se demostró, una vez más, que la criptococosis es una infección micótica oportunista de importancia, siendo el agente etiológico más frecuente en nuestro medio C. neoformans var. neoformans y, en menor proporción C. neoformans var. gattii.

Son escasos los estudios epidemiológicos de esta micosis en Venezuela, y pocos hacen una identificación más allá de la especie [47,48], por lo cual es difícil comparar nuestros resultados.

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