Las bacterias halófilas y sus aplicaciones biotecnológicas

Ramírez N^*, Sandoval AH^*, Serrano JA^**

^*Departamento de Sistemas Biológicos, Universidad Autónoma Metropolitana, Xochimilco, Mëxico DF.

^**Grupo de Investigaciones de Actinomicetos Patógenos Humanos y del Suelo. Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina, Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela.

RESUMEN

Los autores presentan una extensa revisión sobre las bacterias halófilas y sus aplicaciones biotecnológicas. Revisan aspectos relacionados con su ecología en los ambientes hipersalinos y sus características como microorganismos extremófilos y sus diversas e importantes aplicaciones y potencialidades en la industria y en la biotecnología. Estas bacterias son fáciles de cultivar y presentan escasos requerimientos nutricionales; su tolerancia a elevadas concentraciones salinas reduce al mínimo los riesgos de contaminaciones en el laboratorio, lo que permitiría su explotación como fábricas celulares alternativas a Escherichia coli, para la producción de proteínas recombinantes. Son útiles en la producción de enzimas, polímeros, solutos compatibles y en la biodegradación de residuos, así como en la producción de alimentos fermentados. La revisión abarca aspectos relativos a la microbiología de los actinomicetos halófilos, refiriéndose a estudios realizados por los autores en cepas de actinomicetos halófilos aislados en medios hipersalinos de México y España.

Palabras-clave: Bacterias, halófilos, actinomicetos, biotecnología.

The halophilic bacteria and their biotechnological applications

ABSTRACT

The authors present an extensive review on the halophilic bacterias and their biotechnological applications, along with some aspects related to their ecological behaviour in hypersaline environments. They also examined their characteristics as extremophilic microorganisms, including their several important applications and potential use in the industry and biotechnology. Due to their low nutritional requirements and tolerance to high saline concentrations, these bacteria are easy to be cultivated and the laboratory risks contamination is minimal. These facts allow them to be used as alternative cellular factories instead of Escherichia coli in the production of recombining proteins. They are also useful in the production of enzymes, polymers, compatible solutes, residues biodegradation process, as well as, fermented food production. Finally, this work includes aspects related to halophilic actinomycetes microbiology, discussed in previous studies carried out by the authors in strains of halophilic actinomycetes isolated in hypersaline mediums in  Mexico and  Spain.

Key-words: Bacterias, halophilic, actinomycetes, biotechnology.

INTRODUCCIÓN

La evolución ha forjado todas las formas de vida en la tierra; la diversidad estructural y funcional que apreciamos en las células representa un conjunto de éxitos evolutivos que, a través del proceso de selección natural, confiere un valor de supervivencia (adaptabilidad) a los microorganismos de hoy. La diversidad microbiana puede ser apreciada en términos de variaciones en el tamaño celular y la morfología, estrategias metabólicas, movilidad, división celular, biología del desarrollo, adaptación a ambientes extremos y muchos otros aspectos estructurales y funciones de la célula (42).

Durante las últimas décadas se ha demostrado que las comunidades microbianas pueden encontrarse en muchas condiciones adversas, como temperatura, pH y salinidad, entre otras. Los microorganismos que habitan en estos ambientes extremos son llamados extremófilos, y poseen características bioquímicas y metabólicas que les permiten vivir en hábitats poco comunes, resultando ser microorganismos muy útiles para el desarrollo de nuevos procesos biotecnológicos (44, 82).

Las bacterias halófilas, al pertenecer al grupo de microorganismos extremófilos capaces de vivir en ambientes salinos, ofrecen una multitud de aplicaciones en varios campos de la biotecnología.

Los microorganismos no halófilos capaces de crecer tanto en ausencia como en presencia de sal son llamados halotolerantes; los halotolerantes que son capaces de crecer aproximadamente al 15% (w/v) de NaCl (2,5 M) son considerados halotolerantes extremos. Los microorganismos que requieren sal para su crecimiento son llamados halófilos. De acuerdo a la definición de Kushner (30), es posible distinguir entre halófilos débiles, como lo son la mayoría de los organismos marinos, considerando que el agua de mar contiene cerca del 3% (w/v) de NaCl; halófilos moderados, cuyo crecimiento óptimo se encuentra en un rango del 3 al 15% (w/v) de sal, y halófilos extremos, que presentan un crecimiento óptimo al 25% (w/v) de NaCl (44).

ECOLOGÍA

Los ambientes hipersalinos están bastante extendidos por todo el mundo, sin embargo, los ambientes extremadamente salinos son raros. La mayoría de éstos se encuentran en zonas calientes y secas. La composición iónica de los lagos salinos varía considerablemente. El predominio de unos u otros iones depende de la topografía, geología y condiciones climáticas generales que rodean el lago. El Gran Lago Salado, en el Estado de Utah, EE.UU., por ejemplo: este lago está fundamentalmente constituido por  agua de mar concentrada, debido a que la proporción relativa de cada ión es la del agua de mar, sólo que mucho más alta. El catión principal es el sodio, mientras que el anión primario es el cloro; existen cantidades significantes de sulfato y un ligero pH alcalino. Por el contrario, en el Mar Muerto, en Israel, es relativamente baja la concentración del catión sodio, pero alta la del magnesio. La química del agua de los lagos carbonatados se asemeja a la del Gran Lago Salado pero, debido a los carbonatos que se incorporan al agua de las rocas circundantes, el pH es bastante más alcalino, presentando valores de entre 10 y 12; además, el magnesio y el calcio están prácticamente ausentes, debido a que los mismos precipitan a altos valores de pH. A pesar de que parece que son ecosistemas duros para la vida, los lagos salados representan  ecosistemas muy bio-productivos. 

Las salinas marinas son también buenos hábitats para los procariotas, halófilos extremos. Como se sabe, las salinas son aguas de mar estancadas, que se evaporan lentamente por la acción del sol. A medida que la salina se aproxima a la concentración de sales que permitan el crecimiento de los halófilos extremos, las aguas se vuelven de color rojizo, debido al aparecimiento masivo de arqueas halófilas que crecen en este hábitat (la coloración rojiza proviene de los carotenoides y otros pigmentos). También suelen encontrarse en las salinas procariotas poco comunes, como las bacterias cuadradas. También se han aislando halófilos extremos en alimentos con alta concentración de sal, como salmueras, salsa de soya y pescado (42).

La ecología y diversidad de los microorganismos halófilos es muy variada; muchos de estos microorganismos han sido aislados de hábitats que presentan alta salinidad, ubicados en diferentes puntos geográficos del planeta (85).

En la Tabla 1 se mencionan algunos de los puntos geográficos característicos de los diferentes ambientes salinos, el rango de salinidad que presentan así como el pH característico en cada caso. 

Tabla 1. Ecología de los microorganismos halófilos, diferentes hábitats salinos.

APLICACIONES

Desde que se inició su estudio, las bacterias halófilas moderadas han demostrado ser un grupo de extremófilos con un gran potencial biotecnológico. Así, no sólo producen compuestos de enorme interés industrial, como enzimas, biopolímeros o solutos compatibles, sino que además presentan unas propiedades fisiológicas que facilitan su explotación comercial. Por ejemplo, son microorganismos fáciles de cultivar y con escasos requerimientos nutricionales, pudiendo utilizar una gran variedad de compuestos como única fuente de carbono y energía (84). Además, su tolerancia a elevadas concentraciones salinas (83) reduce al mínimo los riesgos de contaminaciones en el laboratorio, lo que permitiría su explotación como fábricas celulares alternativas a Escherichia coli para la producción de proteínas recombinantes. A continuación se describen algunas de las más interesantes aplicaciones de estos microorganismos.

Enzimas

Muchos procesos industriales se desarrollan bajo condiciones extremas, lo que ofrece un campo de aplicación para las enzimas producidas por microorganismos extremófilos, capaces de actuar a valores extremos de temperatura, pH o salinidad. La mayoría de las haloenzimas extra e intracelulares que se han aislado y caracterizado hasta el momento provienen de bacterias halófilas moderadas. Así, se han descrito varias hidrolasas de interés industrial del tipo de las amilasas, proteasas, nucleasas y 5´- nucleotidasas, producidas por diferentes bacterias halófilas. La nucleasa H, producida por Micrococcus varians, subsp. halobius, por ejemplo, es especialmente interesante para la producción de los agentes aromatizantes ácido 5´- inosínico y ácido 5´- guanílico (27).

En los últimos años se ha llevado a cabo un amplio estudio de las posibles hidrolasas extracelulares de bacterias halófilas moderadas. Cabe destacar el aislamiento y caracterización de una a amilasa de Halomonas meridiana (11). Así mismo, gracias a la obtención y posterior complementación de mutantes defectivas en la α amilasa, se ha conseguido clonar y secuenciar el gen responsable de la síntesis de dicha amilasa (12). Recientemente se han aislado, de salinas del sur de España, un total de 122 cepas de bacterias halófilas moderadas, capaces de producir diferentes hidrolasas: amilasas, lipasas, proteasas, nucleasas y pululanasas (74).

Polímeros

Los polímeros bacterianos tienen gran importancia en la industria petrolera. Gracias a sus propiedades surfactantes y emulsionantes pueden aumentar la eficacia de los procesos de extracción de crudo del subsuelo, incrementando la viscosidad del agua que se inyecta alrededor de las bolsas, disminuyendo así su tensión superficial. Las bolsas de petróleo suelen presentar una elevada salinidad, lo que hace especialmente interesante la utilización directa de bacterias halófilas moderadas productoras de biopolímeros (83). En 1986, Pfiffner y col., aislaron más de 200 cepas de bacterias halófilas moderadas, capaces de crecer en las bolsas subterráneas de crudo y producir biopolímeros surfactantes resistentes a las condiciones ambientales de hipersalinidad.

H. eurihalina produce un exopolisacárido cuando se cultiva a 32°C de temperatura y una concentración del 7,5% de sales totales. Las soluciones de este polisacárido tienen un comportamiento pseudoplástico, son bastante termoestables y presentan una elevada viscosidad a pH ácido (62). Diversos estudios llevados a cabo con dicho biopolímero han puesto de manifiesto su potencial en procesos de biorremediación o en la industria petrolera (45). Así mismo, H. eurihalina sintetiza también otros polímeros de gran interés en farmacología (58).

Solutos Compatibles

Las bacterias halófilas moderadas acumulan en su citoplasma determinados compuestos orgánicos de bajo peso molecular, que no interfieren con el metabolismo celular, por lo que se denominan solutos compatibles (7), que constituyen la base fundamental de la tolerancia a la sal de estos microorganismos. Dichos compuestos osmoprotectores han despertado un enorme interés a nivel industrial, ya que poseen un alto poder estabilizador y protector de enzimas, ácidos nucleicos, membranas e incluso células enteras, contra la congelación, la desecación, la desnaturalización por calor y la alta salinidad (40). También se han descrito sus posibles aplicaciones en tecnología enzimática (biosensores, PCR, etc.) y  en la industria farmacéutica y cosmética (44).

Algunos solutos compatibles, como la ectoína y la hidroxiectoína han demostrado poseer un marcado efecto protector sobre las enzimas lábiles, como la lactato deshidrogenasa y la fructoquinasa. Así, en diversos estudios en los que se comparó el efecto protector sobre estas enzimas de distintos solutos compatibles (glicina-betaína, trehalosa, glicerol, prolina, ectoínas y azúcares), se puso de manifiesto que las ectoínas fueron los mejores agentes protectores del calor y los procesos de congelación y descongelación. Hasta la fecha, estos compuestos sólo pueden obtenerse biológicamente, lo que ha aumentado considerablemente el interés a nivel industrial de las bacterias halófilas moderadas productoras de estos solutos compatibles. Así, en 1995, Frings y col., (18) descubrieron un método de obtención de ectoína e hidroxiectoína a partir de una cepa halófila moderada de Marinococcus. Posteriormente se ha desarrollado un proceso industrial mejorado de obtención de ectoína a partir de una cepa de H. elongata. Dicho proceso, conocido como “bacterial milking” (“ordeñado”), consiste en someter a la bacteria a cambios bruscos en la salinidad del medio de cultivo. Con un primer choque hiperosmótico se induce la acumulación citoplasmática de los solutos compatibles y, a continuación, se elimina la sal del medio, de manera que la bacteria expulsa el contenido citoplasmático, con los solutos compatibles, para compensar el choque hipoosmótico (76).

Biodegradación de Residuos

Las bacterias halófilas moderadas han alcanzado recientemente un gran interés en el campo de la degradación de los residuos tóxicos. Constituyen una importante alternativa a los tratamientos microbiológicos convencionales en aquellos casos en los que éstos sean ineficaces, como son los procesos industriales que generan aguas residuales hipersalinas (56). Esto sucede, por ejemplo, en la producción de diversas sustancias químicas como los pesticidas, determinados productos farmacéuticos y herbicidas, y los procesos de extracción de petróleo y gas.

Así, Oren y col., (55) demostraron la degradación de varios compuestos aromáticos nitro-sustituidos a concentraciones salinas de 13 a 14% por las bacterias Halanaerobium praevalens y Orenia marismortui. A partir de distintos ambientes hipersalinos se han aislado microorganismos capaces de degradar compuestos hidrocarbonados, incluso hexadecanos y fenantrenos (47). En 1992, Woolard e Irvine (89) describieron la utilización de una biopelícula de bacterias halófilas moderadas, aisladas del Gran Lago Salado, Utah, EE.UU., para el tratamiento de aguas residuales hipersalinas contaminadas con fenol. Asimismo, Maltseva y col., (43) han aislado varias cepas pertenecientes a la familia Halomonadaceae, capaces de utilizar como fuente de carbono y energía compuestos cloroaromáticos, como el ácido 2,4-diclorofenoxiacético, potente herbicida que contamina muchos hábitats.

En 1991, DeFrank y Cheng (15) purificaron y caracterizaron una anhidrasa del ácido organofosfórico de una bacteria halófila moderada. Dicha bacteria, aislada a partir de un manantial hipersalino de Utah (EE.UU.), e identificada provisionalmente dentro del género Alteromonas, es capaz de degradar varios compuestos tóxicos organofosforados. Posteriormente se aislaron otras cinco cepas capaces de degradar compuestos organofosforados y derivados (16).

Por otro lado, es frecuente la contaminación medioambiental por metales pesados, debido a los procesos industriales. Recientemente se ha aislado y caracterizado un gran grupo de bacterias halófilas moderadas resistentes a cinco de los más importantes contaminantes industriales: cadmio, cobre, cinc, cromo y mercurio (70). Estas cepas, resistentes a metales pesados, podrían emplearse en procesos de destoxificación o como bioindicadores de ambientes hipersalinos contaminados (80).

Alimentos Fermentados

Las bacterias halófilas moderadas también tienen diversas aplicaciones en el campo de la alimentación. Así en la elaboración de la salsa de soya intervienen determinadas especies del género Tetragenococcus. Los granos de trigo y soya se resuspenden en agua con NaCl al 19% y se dejan durante 9 meses en oscuridad. T. halophila se emplea como indicador de la fermentación, pudiendo alcanzar una densidad de 10⁸ UFC/ml en la salsa de soya, que contiene una concentración aproximadamente 3M de NaCl (71).

Otros usos potenciales

Además de los usos citados anteriormente, existe un amplio grado de posibles aplicaciones que aún están siendo objeto de estudio: (i) en la eliminación de fosfatos de ambientes hipersalinos (69); (ii) en el procesamiento de residuos hipersalinos provenientes de la industria del aceite de oliva o de los procesos de curtido de pieles; (iii) utilización industrial de los biosurfactantes producidos por algunas bacterias halófilas moderadas; (iv) producción de enzimas de interés en biología molecular, antibióticos, o carotenoides de interés para la industria alimentaria; (v) en la recuperación de los suelos áridos o semiáridos, caracterizados por condiciones de estrés osmótico (por salinidad, desecación o frío) mediante la obtención de plantas transgénicas capaces de tolerar altas concentraciones de sal, gracias a los genes implicados en la osmotolerancia de las bacterias halófilas moderadas. En este punto cabe destacar la transferencia de los genes de síntesis de ectoína de H. elongata a cultivos de tejidos de Nicotiana tabacum (51) que presentaron una significativa mayor tolerancia al estrés osmótico.

OSMOADAPTACIÓN BACTERIANA

Los seres vivos están permanentemente expuestos a determinados factores biológicos, físicos o químicos existentes en el medio ambiente. Dichos factores se encuentran sujetos a variaciones que pueden amenazar la supervivencia de los organismos, lo que hace necesario desarrollar estrategias de adaptación a estas variables. Uno de estos parámetros es la concentración de solutos, no sólo importante en ambientes hipersalinos, sino en cualquier ambiente natural en los que la desecación o la lluvia puedan provocar importantes variaciones en la osmolaridad. La osmolaridad es la presión osmótica de una solución, expresada en moles de soluto por litros de solución (87). Un aumento en la presión osmótica del medio conlleva a una baja actividad de agua, lo que provoca una deshidratación por parte de la célula, que puede significar su muerte (6). En procariotas, la osmoadaptación comprende un complejo sistema de mecanismos fisiológicos y genéticos de adaptación al estrés osmótico. Así los microorganismos halotolerantes y halófilos han desarrollado una serie de mecanismos específicos de adaptación a elevadas concentraciones salinas, que posiblemente se encuentren conectados entre sí formando un complejo circuito que se encuentra osmorregulado. Las dos primeras respuestas específicas de la célula frente a un aumento de la presión osmótica externa son la adaptación de la composición lipídica de las membranas y la acumulación citoplasmática de compuestos osmoprotectores para compensar el estrés osmótico (54).  

RESPUESTA ESPECÍFICA AL ESTRÉS OSMÓTICO

Adaptación de la composición lipídica de las membranas

La membrana citoplasmática constituye una barrera que separa el citoplasma del medio externo, en el que pueden producirse cambios en la concentración de sales, por lo que debe jugar un papel importante en la respuesta de la célula a dichos cambios. Se ha demostrado que la adaptación de la composición lipídica de las membranas celulares frente a una nueva situación de estrés osmótico incluye modificaciones en el tipo de fosfolípidos existentes en las membranas y en el tipo de ácidos grasos que forman parte de los lípidos. Con respecto a los fosfolípidos, a medida que aumenta la salinidad, la membrana se enriquece en fosfatidilglicerol y/o en di-fosfatidilglicerol (cardiolipina), fosfolípidos cargados negativamente, a costa de una disminución en la fosfatidiletanolamina (PE), un fosfolípido neutro (73). Estas modificaciones en la composición de lípidos polares aportan consistencia a la membrana, a la vez que son necesarios para mantener la estructura en doble capa lipídica (73), ya que la PE, en respuesta a la salinidad, tiende a formar fases en una única capa.

La composición en ácidos grasos de los fosfolípidos de membrana también experimenta modificaciones con respecto a la temperatura y la salinidad, siendo estos diferentes en bacterias Gram-negativas y Gram-positivas. Así, en bacterias halófilas moderadas Gram-negativas, el cambio más destacable es un aumento de los ácidos grasos ciclopropánicos, a costa de los insaturados, de los cuales derivan. Este efecto se ha descrito en Pseudomonas halosaccarolytica (50), H. halmophila (49), H. canadiensis (1), H. salina (81) y Chromohalobacter salexigens. La transformación de ácidos grasos insaturados en ciclopropánicos proporcionaría a la célula una disminución en la fluidez de la membrana, contribuyendo así a mantener la integridad de la misma (73).

Compuestos osmoprotectores

Sin duda, la principal estrategia que desarrollan los microorganismos halófilos y halotolerantes para adaptarse al estrés osmótico se basa en la acumulación masiva de compuestos en el citoplasma, para compensar la presión osmótica del medio externo. Los compuestos acumulados pueden ser iónicos o no iónicos, según el tipo de microorganismo, lo que determina de forma general la existencia de dos mecanismos principales de acumulación. El primero de ellos, denominado mecanismo “salt-in” es típico de Arqueas y Haloanaerobiales (bacterias halófilas moderadas anaerobias estrictas), que acumulan en su citoplasma iones inorgánicos, principalmente K⁺ y Cl^-. El aumento en la concentración de KCl en el citoplasma conlleva a una adaptación a las altas concentraciones salinas de todas las proteínas y otros componentes celulares como los ribosomas (Dennis y Shimmin, 1997). Esto determina que los organismos que utilizan este mecanismo tengan una limitada capacidad para adaptarse a los cambios en la osmolaridad del medio, por lo que su crecimiento se restringe a ambientes con concentraciones salinas muy elevadas (54).

El segundo mecanismo, conocido como “salt out”, es el que utilizan las bacterias, tanto halófilas como no halófilas, además de las arqueas metanógenas halófilas moderadas. Así, estos microorganismos, en respuesta al estrés osmótico, acumulan en su citoplasma compuestos orgánicos de bajo peso molecular, que mantienen el equilibrio osmótico sin interferir con el metabolismo celular, por lo que se denominan solutos compatibles (7). Se trata de un sistema mucho más flexible, ya que permite la adaptación a las fluctuaciones en la presión osmótica del medio. Los solutos compatibles pueden acumularse tras su transporte al interior celular desde el medio externo, o bien mediante síntesis, como sucede por ejemplo cuando las bacterias se cultivan en un medio mínimo (19). Dado el ahorro de energía que supone para la célula, el transporte es preferido a la síntesis “de novo” (54). Los osmoprotectores incorporados desde el medio externo son acumulados junto con los producidos por la célula, o bien pueden reemplazarlos totalmente. A su vez, existen canales proteicos que responden frente a un choque hipoosmótico, diferentes a los sistemas de transporte, que funcionan como válvulas de seguridad, permitiendo la expulsión de los solutos compatibles acumulados (88). La mayor flexibilidad y versatilidad de este mecanismo explica el hecho de que se encuentre mucho más extendido en la naturaleza, habiéndose observado también en hongos, plantas y animales, incluso en células humanas (85).

Los solutos compatibles son moléculas polares sencillas, altamente solubles y sin carga, o bien con carga neta neutra a pH fisiológico, con capacidad estabilizadora de proteínas frente al calor, la desecación o la congelación (20). Estos efectos beneficiosos se basan en el modelo de “exclusión preferencial”. Según dicho modelo, los solutos compatibles quedarían excluidos de la primera capa de hidratación de las proteínas, lo que daría lugar a una hidratación preferencial de la superficie de las mismas, disminuyendo así el volumen que ocupan y estabilizando su estructura.

Los solutos compatibles que acumulan las bacterias halófilas moderadas se han identificado recientemente mediante técnicas de RMN y HPLC. Dichas técnicas han permitido, entre otros avances, identificar las tetrahidropirimidinas (ectoína e hidroxiectoína), y elucidar las rutas biosintéticas de varios solutos compatibles. A continuación se describen los principales solutos compatibles.

Aminoácidos

Aunque este tipo de compuestos fueron los primeros solutos compatibles que se identificaron, no parecen tener una gran importancia en bacterias halófilas moderadas. La excepción la constituye la prolina, que es acumulada por algunas especies Gram-positivas, como Salinococcus roseus y S. hispanicus (21).

Sin embargo, en bacterias no halófilas, los aminoácidos parecen poseer una mayor importancia. Así, la prolina es un importante osmoprotector en Bacillus subtilis, cuya ruta biosintética recientemente se ha elucidado, Staphylococcus aureus y Salmonella typhimurium. El glutamato es el anión regulado osmóticamente más abundante en enterobacterias. Asimismo, éstas también acumulan alanina y glutamina, aunque a niveles muy inferiores (4).

Azúcares

En muchos microorganismos, incluyendo algunas bacterias halófilas moderadas, es frecuente la acumulación de sacarosa y trehalosa, como respuesta a un choque hiperosmótico, aunque estos compuestos alcanzan concentraciones intracelulares poco elevadas, inferiores a 500 mM (21), y sólo pueden reemplazar parcialmente a los solutos compatibles nitrogenados. En E. coli, sin embargo, la trehalosa es el principal osmoprotector que se acumula cuando se cultiva en medio mínimo, teniendo lugar su síntesis a partir de la glucosa-6-fosfato en respuesta a un choque hiperosmótico. Los genes responsables de la síntesis (otsAB) están regulados por la osmolaridad del medio y la fase estacionaria de crecimiento del cultivo (41). La trehalosa también interviene en la protección de la célula frente a otros tipos de estrés, como el calor, la desecación, o la congelación (79). Sin embargo, la trehalosa no funciona como agente osmoprotector si se suministra externamente (33).

Glicina betaína (Betaína)

La mayoría de las bacterias, incluyendo las bacterias halófilas moderadas, acumulan betaína como principal soluto compatible, cuando se cultivan en medio complejo con elevadas concentraciones salinas. La betaína se acumula tras su transporte desde el medio externo, o bien por oxidación de su precursor, la colina. También existen bacterias capaces de sintetizar betaína “de novo”. Esta síntesis, muy común en bacterias fotótrofas, no se observa en quimioheterótrofas, a excepción de las halófilas extremas Actinopolyspora halophila y Halothiorhodospira halochloris (78). Esta ruta de síntesis, que se inicia a partir del aminoácido glicina, comprende tres reacciones de metilación, con sarcosina y dimetilglicina como intermediarios, y la S-adenosil metionina como donador de grupos metilos (52).

Los mecanismos de transporte y de síntesis de betaína por oxidación de colina han sido estudiados en profundidad en bacterias no halófilas, como B. subtilis (28), E. coli (31), S. typhimurium (57) y Sinorhizobium meliloti (61). En bacterias halófilas moderadas, estos estudios son más recientes, destacando la caracterización bioquímica del sistema de transporte de alta afinidad por betaína, y la clonación de los genes de síntesis de betaína a partir de colina en C. salexigens (9).

Ectoína e hidroxiectoína

La ectoína (2-metil-4-carboxi-3,4,5,6-tetrahidropirimidina) se describió por primera vez en la bacteria purpúrea fotosintética Halorhodospira halochloris (anteriormente Ectothiorhodospira halochloris, de donde proviene el nombre de ectoína) (22), aunque se encuentra ampliamente distribuida en bacterias, así como su derivado hidroxilado, la hidroxiectoína (2-metil-4-carboxi-5-hidroxi-3,4,5,5-tetrahidropirimidina). La ectoína se forma por deshidratación intramolecular del ácido N-γ-acetildiaminobutírico (NADA), que da lugar a la formación del derivado pirimidínico. La ruta biosintética de la ectoína fue elucidada en H. halochloris y H. elongata por Peters y col. (59). Esta ruta comienza con la transformación del aspartato semialdehido en ácido diaminobutírico (DA), que a su vez es transformado en ácido N-acetildiaminobutírico (NADA), que es convertido finalmente en ectoína. Se han aislado y caracterizado parcialmente las enzimas implicadas en dicha ruta en H. elongata (53); la DA transaminasa, la DA acetil transferasa y la NADA deshidratasa, más conocida como ectoína sintasa. En Brevibacterium linens (5) y Streptomyces parvulus (25) se ha propuesto la existencia de una ruta biosintética alternativa a partir del glutamato.

El primer implicado en la síntesis de ectoína que se ha secuenciado es el gen ectC de Halomonas sp., KS-3, clonado por PCR mediante oligonucleótidos degenerados diseñados a partir de la secuencia de la enzima ectoína sintasa (48). Hasta el momento se han caracterizado los genes de síntesis de ectoína de Marinococcus halophilus (39), H. elongata (24) y Sporosarcina pasteurii (29).

Por el momento, aun no se ha podido determinar completamente la ruta de síntesis de la hidroxiectoína, desconociéndose los intermediarios y las enzimas implicadas. En H. elongata (24) y C. salexigens existen evidencias de que la hidroxiectoína se forma a partir de la ectoína por hidroxilación directa, y recientemente se ha postulado la existencia en C. salexigens de una ruta alternativa de síntesis a partir de NADA, precursor inmediato de la ectoína (8).

En las especies del género Halomonas y en C. salexigens, la ectoína y la hidroxiectoína son los solutos predominantes cuando las células se cultivan en un medio sin betaína o colina (86), alcanzando concentraciones considerablemente elevadas, que son suficientes para conseguir, junto con los iones intracelulares, un equilibrio osmótico con el medio. Por otro lado, en la cepa tipo de H. elongata se ha observado que el transporte de betaína no es suficiente para suprimir la síntesis de ectoína, aunque parece ser que la desplaza a concentraciones salinas más elevadas (86). Así, en cultivos  de H. elongata en medio complejo con 0,85 M de NaCl a 40°C, sólo se detectó acumulación de betaína, mientras que a 1,7 M de NaCl se observó la acumulación de ambos solutos compatibles.

Otros solutos compatibles de origen bacteriano.

Existe una amplia gama de compuestos solutos compatibles, cuya composición química varía, dependiendo de la especie bacteriana que los sintetiza. Además de los descritos anteriormente, destaca especialmente el glucosilglicerol, que es acumulado por un gran número de cianobacterias halófilas moderadas. También se ha destacado en Rhodobacter sulfidophilus, Pseudomonas mendocina,  P. alkaligenes y C. salexigens

Por otro lado, en algunas bacterias Gram-positivas, como Halobacillus halophilus, Planococcus sp. y Sporosarcina halophila, mediante 13C-RMN se han podido detectar diaminoácidos N-acetilados, como la Nε-acetilisina y la Nδ-acetilornitina (86, 78).

En la arquea hipertermófila Pyrococcus furiosus (46), se ha detectado la acumulación de manosilglicerato y di-mio-inositolfosfato, en respuesta a aumentos de temperatura o salinidad. El manosilglicerato se acumula preferentemente al aumentar la salinidad, mientras que el di-mio-inositolfosfato se acumula a temperaturas superiores a la temperatura óptima de crecimiento (14). Por otro lado, en varias especies del género Thermococcus se ha identificado un nuevo soluto compatible, la β-galactopiranosil-5-hidroxilisina, que probablemente se sintetiza a partir de la peptona presente en el medio de cultivo (32).

Por último cabe destacar que, además de los solutos compatibles obtenidos por síntesis, muchas bacterias son capaces de transportar desde el medio extracelular una gran variedad de compuestos que pueden actuar como osmoprotectores. Dichos compuestos, liberados al medio por otros microorganismos tras un choque hipoosmótico, o provenientes de la muerte celular de animales o plantas, son captados por transportadores de baja especificidad por sustrato. Los solutos compatibles disponibles tras su transporte son innumerables. Un ejemplo en la incorporación desde el medio externo de poliamidas (putrescina, cadaverina, espermidina y espermita) es el de Salinivibrio costicola (26), aunque no parece que aumenten su estabilidad osmótica tras un choque  hipoosmótico. En Halomonas y Chromohalobacter también se ha detectado espermidina, aunque en concentraciones similares a las encontradas en bacterias no halófilas.

ACTINOMICETOS HALOFILOS

En la actualidad está creciendo el interés por conocer mejor la gran diversidad de microorganismos halófilos, y cada vez es mayor el número de investigaciones relacionadas con el tema. Tal es el caso de los actinomicetos, organismos productores de una amplia variedad de metabolitos secundarios. Los actinomicetos halófilos representan un reducido grupo de microorganismos que, al combinar su capacidad productora con su resistencia a las condiciones extremas de salinidad, resultan microorganismos de gran interés como fuente productora de productos industriales, tanto en el campo farmacéutico como en el cosmético y el biotecnológico. 

El número de actinomicetos halófilos que se conocen actualmente es muy reducido; en los últimos años se han reportado muy pocos géneros de actinomicetos halófilos, de modo que el estudio de la biología de actinomicetos halófilos, incluyendo su aislamiento, identificación y caracterización, empieza a mostrar la diversidad de estos microorganismos en varias partes del mundo.

En 1975 se dio a conocer por vez primera el reporte de un actinomiceto capaz de crecer en altas concentraciones de salinidad, Actinopolyspora halophila (23). Dieciséis años mas tarde, en 1991, se reporta el segundo actinomiceto halófilo, A. mortivallis (91). En  los años siguientes, y hasta 2003, se reportaron 13 especies más, existiendo en la actualidad 15 miembros conformando este grupo. A continuación se presenta de manera breve las principales características de los actinomicetos halófilos reconocidos a la fecha.

Actinopolyspora halophila

Fue aislado como un contaminante de un medio de cultivo que contenía 25% de NaCl. Ha sido clasificada como A. halophila en la familia Nocardiaceae. La morfología y características bioquímicas de este microorganismo lo distinguen de otros miembros de la familia Nocardiaceae y otros géneros poseedores de pared celular tipo IV. Requiere altas concentraciones de NaCl para crecer, y puede crecer hasta en NaCl a saturación. La concentración más baja que le permite crecer en medio líquido es del 12%, mientras que en medio sólido es del 10%. Las colonias desarrolladas a bajas concentraciones de sal presentan cavidades semejantes a placas virales. No presenta crecimiento en medios que contienen el 30% de KCl en lugar de NaCl. Este organismo puede crecer en medio simple con sales de NH₄⁺ como fuente de nitrógeno y diferentes azúcares, así como otros componentes como fuentes de carbono. No obstante, tiene un requerimiento casi tan grande como los cocos y bacilos: contiene ácido m-diaminopimélico y es sensible a la lisozima; ambas propiedades sugieren la presencia de una pared celular mucopeptídica. También contiene algunos fosfolípidos comunes de otros actinomicetos. Sin embargo, no contiene lípidos característicos de otras bacterias halófilas extremas. Produce ácido a partir de rhamnosa y fructosa. Utiliza los siguientes sustratos como fuente de carbono y energía: fructosa, xilosa, arabinosa, rhamnosa, manitol e inositol. Hidroliza tweens 20, 40, 60 y 80. Hidroliza la caseína. No hidroliza urea, xantina y almidón. No reduce nitratos. Licua la gelatina. Su rango de temperatura es 10 – 43°C, con un óptimo de 37°C. Es sensible a la lisozima y resistente a la penicilina. Su contenido de G + C es 64,2 mol% (23).

Actinopolyspora iraquiensis

Aislada de una muestra de suelo de Irak. Presenta crecimiento óptimo en un rango de 10 a 15% de NaCl en medio líquido. El rango de temperatura óptima es entre 30 y 35°C. Las colonias son pequeñas (2-4 mm de diámetro), elevadas y convexas. La masa de esporas blanca y abundante en medio sólido al 10-15% de NaCl. El micelio aéreo forma cadenas cortas de esporas. Las esporas son esferoidales y de superficie lisa, con diámetro de 1 mm. La pared celular contiene principalmente meso-DAP y cantidades traza de L-DAP. La hidrólisis de la pared celular contiene arabinosa, galactosa y ribosa. Las menaquinonas predominantes son  MK-9 (H₄). Los fosfolípidos incluyen  fosfatidil colina, lisofosfatidil glicerol, fosfatidil glicerol y difosfatidil glicerol. Los ácidos micólicos están ausentes. Utiliza glucosa, maltosa, manitol, sacarosa, fructosa, L-arabinosa, inositol, rafinosa y galactosa como fuente de carbono. No presenta crecimiento en L-rhamnosa, D-xilosa o manosa. Produce ácido a partir de manitol y rafinosa. Hidroliza el almidón, xantina y tween 80. No hidroliza úrea, esculina y celulosa. Es sensible a lisozima. Es sensible a los siguientes antibióticos: amoxicilina, carbenicilina, cefalexina, cloranfenicol, eritromicina y novobiocina. Resistente a clindamicina, oxacilina y vancomicina (72).

Actinopolyspora mortivallis

Aislado de suelo salado del Valle de la Muerte, California. Crece en medio con un rango de 5-25% de NaCl. Presenta micelio aéreo ramificado y cadenas de esporas. Las esporas son ovales o cilíndricas. Descompone la caseína y la xantina. Hidroliza tweens 20, 40, 60 y 80. Utiliza las siguientes fuentes de carbono: xilosa, fructosa, sacarosa, rafinosa y glucosa, pero no utiliza, rhamnosa, manitol, inositol y arabinosa. Produce ácido a partir de: xilosa, sacarosa y glucosa. No reduce nitratos. Licua la gelatina. Peptoniza leche. Es sensible a penicilina a concentraciones de 10 µg/ml. El rango de temperatura de crecimiento es de 10-50°C, con un óptimo de 45°C. El rango de tolerancia a NaCl es 5 a 30%, con un crecimiento óptimo en concentraciones de NaCl entre 10 y 15% a 45°C. El contenido de G + C es 68 mol%. Se distingue de A. halophila por las siguientes características: descomposición de xantina, perfil de utilización de fuentes de carbón, reducción de nitratos y peptonización de leche (91).

Friedmanniella lacustris

Aislado de agua del lago salado Ekho, Antártica. Cocos y bacilos pequeños con algún polímero extracelular en cultivos viejos. El tamaño de las células es de 0,9-1,3 µm, con formación de esporas en el exterior formando agregados. Crece bien en medio PYGV + ASW con vitaminas. La temperatura óptima de crecimiento es de 26°C. El pH óptimo es 7,5. Tolera más del 6% (w/v) de NaCl, con un óptimo del 4%. Azúcares de su pared celular: glucosa, manosa, ribosa, rhamnosa y galactosa. La principal menaquinona respiratoria es MK-9 (H₄) y MK-8 (H₄) como componente menor. Ácidos grasos:        ai-C_15:0. Los lípidos polares contienen fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol y un fosfolípido no identificado. Los ácidos micólicos están ausentes. La composición de bases de DNA es de 73 mol% de G+C (34).

Nocardioides aquaticus

Aislado de agua del lago salado Ekho, Antártica. Cocos  y bacilos pequeños en cultivos viejos, no móviles, con formación de esporas en el exterior, el tamaño de las células es de 0,9-1,0 µm. Crecen bien en medio oligotrófico PYGV y ASW, con bajas concentraciones de peptona, extracto de levadura y glucosa, así como sales minerales, vitaminas y ASW. Su temperatura óptima de crecimiento es de 16-26°C. El pH óptimo de crecimiento es de 7-8. El tipo de peptidoglicano es A3γ basado en  la presencia del ácido m-diaminopimélico. Presenta glucosa y galactosa como azúcares de pared celular. La principal menaquinona es MK-8 (H₄), y  como componentes menores MK-6 (H₄) y MK-7 (H₄). Presenta los ácidos grasos C_18:1, C_16:0 y C_17:0. Los fosfolípidos presentes son fosfatidil inositol y fosfatidilglicerol. Ausencia de ácidos micólicos. La composición de bases de DNA es 69 mol% G + C (34).

Nocardiopsis halophila

Aislado de una muestra de suelo de salino en Irak. Crece en medio sintético y orgánico, a una concentración por arriba del 20% de NaCl (w/v) y es resistente a la lisozima. El hidrolizado de la célula completa contiene ácido meso diaminopimélico (pared celular tipo III). El fosfolípido predominante es de tipo PIII. Predomina la menaquinona MK-10 (H₆, H₈). Los ácidos micólicos están ausentes. Forma abundante micelio aéreo blanco y largas cadenas de esporas ramificadas que tienen apariencia de zigzag. El micelio vegetativo es extensamente ramificado y poco fragmentado (2).

Nocardiopsis kunsanensis

Es un actinomiceto halófilo moderado, aislado de una salina de Kunsan, República de Corea. El análisis del rDNA 16S indica que el aislado corresponde al género Nocardiopsis, pero es genéticamente diferente de otras especies de Nocardiopsis. Contiene ácido meso diaminopimélico, menaquinonas MK-10 (H₆, H₈), fosfolípidos tipo PIII. Es diferenciado de las especies de Nocardiopsis descritas debido a sus características morfológicas y fisiológicas (10).

Nocardiopsis lucentensis

Aislada de una muestra de suelo salado cerca de Alicante, España. El hidrolizado de la célula completa presenta el isómero meso del ácido diaminopimélico y azúcares no característicos. La composición de la pared celular es de tipo III. La principal menaquinona es MK-10 (H₈) y el tipo de fosfolípido es PIII (presenta fosfatidilcolina). Las cadenas de esporas son flexibles y en estadío temprano de esporulación se observa hifas aéreas en forma de zigzag. Este microorganismo produce solutos compatibles del tipo ectoína; se caracteriza por la presencia de micelio aéreo color blanco y micelio vegetativo color amarillo y café. El contenido de G+C es de 71,0 mol% (90).

Nocardiopsis xinjiangensis

Aislada de una muestra de suelo salino de la provincia de Xinjiang, República Popular China. Esta cepa muestra abundante micelio aéreo y vegetativo y cadenas cortas de esporas que nacen del micelio aéreo. Las esporas son bacilares, con superficie rugosa no mótiles. Contiene en su pared celular ácido meso diaminopimélico, alanina y ácido glutámico (pared celular tipo III). Contiene glucosa, ribosa, galactosa, xilosa y arabinosa como azúcares de la pared celular. Los fosfolípidos predominantes son fosfatidil inositol y fosfatidil glicerol. Como menaquinonas predominantes contiene MK-10 (H₂) y MK-10 (H₄). Su contenido de G + C es de 74,3 mol% (35).

Prauserella halophila y Prauserella alba

Ambas cepas fueron aisladas a partir de una muestra de suelo colectada en la provincia de Xinjiang, China. Fueron aisladas usando agar almidón caseína complementado con 20% de NaCl. Aeróbicos Gram-positivos. En medio Czapek el micelio aéreo es bien desarrollado y el micelio vegetativo es fragmentado. El micelio aéreo forma cadenas largas de esporas con ramificaciones cortas. De acuerdo al análisis filogenético y propiedades quimiotaxonómicas, las dos cepas son consideradas miembros del género Prauserella. Ambas cepas difieren morfológicamente de P. rugosa. La cantidad de hibridación DNA-DNA revela valores de similitud con P. rugosa por debajo del 70%. El contenido de G+C es de 65,8 y 66,7 mol%, respectivamente (36).

Saccharomonospora halophila

Aislada de suelo pantanoso en Kuwait. Bacteria Gram-positiva halófila. Produce micelio aéreo azul a grisáceo, con esporas solas o en pares. Los marcadores quimiotaxonómicos coinciden con Saccharomonospora. Contiene ácido meso-diaminopimélico como aminoácido diagnóstico en el peptidoglicano. Los azúcares diagnósticos contenidos son arabinosa y galactosa. Presenta fosfatidil inositol, fosfatidiletanolamina, hidroxifosfatidiletanolamina, lisofosfatidiletanolamina y difosfatidilglicerol. MK-9 (H₄) como menaquinona principal. La secuencia del 16S rDNA muestra un 96,8% de similitud con S. cyanea (3).

Saccharomonospora paurometabólica

Aislada de una muestra de suelo colectada en la provincia de Xinjiang, China. La morfología muestra las características típicas del género Saccharomonospora: micelio aéreo y vegetativo bien desarrollado, esporas solas que nacen del micelio aéreo, mientras que algunas esporas se encuentran esporádicamente solas naciendo del micelio vegetativo. La pared celular contiene ácido meso-diaminopimélico. Presenta galactosa, arabinosa y ribosa como azúcares de la pared celular. La menaquinona principal es MK-9 (H₄), mientras que MK-9 (H₂) se encuentra en cantidades más pequeñas. Contiene los siguientes fosfolípidos: fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, difosfatidilglicerol, fosfatidiletanolamina e hidroxifosfatidiletanolamina. Su contenido de G + C es de 71 mol%. El análisis filogenético basado en la secuencia del gen 16S rRNA muestra una relación con S. halophila de un 98,7% de similitud. La hibridación DNA-DNA muestra una relación del 53,8% con S. halophila (37).

Streptomonospora alba

Aislada de una muestra de suelo colectada en la provincia de Xinjiang, China. Presenta micelio aéreo y vegetativo. La pared celular contiene ácido meso-diaminopimélico. El hidrolizado de la pared celular contiene galactosa y arabinosa. La composición de menaquinonas varía con el medio usado para cultivo celular. En medio extracto de levadura-glucosa complementado con 10% de NaCl, la menaquinona principal es MK-9 (H₄), mientras que en medio ISP 2 enriquecido con vitaminas las menaquinonas principales son: MK-10 (H₂), MK-9 (H₈) y MK-10 (H₄). Contiene fosfatidilglicerol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, difosfatidilglicerol, metilfosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilcolina y un fosfolípido no identificado (38).

Streptomonospora salina

Aislada de una muestra de suelo recolectada en un lago salado en el oeste de China. Presenta micelio aéreo bien desarrollado pero sin fragmentar, forma cadenas cortas de esporas de forma oval a bacilar con superficie rugosa. El micelio vegetativo presenta ramificación con hifas no fragmentadas y esporas redondas a ovales. Contiene ácido meso diaminopimélico, ácido DD-diaminopimélico, glicina, lisina y ácido aspártico. En su pared celular contiene glucosa, galactosa, ribosa, xilosa, arabinosa y manosa. Contiene fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol y fosfatidiletanolamina. Las principales menaquinonas son: MK-9 (H₆), MK-10 (H₂) y MK-10 (H₄) (13).

ACTINOMICETOS HALOFILOS EN MÉXICO

En la actualidad está creciendo el interés por conocer mejor la gran diversidad de microorganismos halófilos, y cada vez es mayor el número de especies descritas. Tal es el caso de los actinomicetos halófilos.

La República Mexicana, dada su situación geográfica, forma, clima y geología, presenta una gran variedad de condiciones geográficas; estas condiciones han dado como resultado una gran riqueza de suelos, flora y fauna, así como gran diversidad microbiológica en ambientes de extrema salinidad.

En el año 2001 se dio inicio al proyecto experimental titulado “Caracterización de actinomicetos aislados a partir de ambientes hipersalinos”, el cual se está llevando a cabo en la Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, México, en colaboración con la Universidad de Sevilla, España, y la Universidad de los Andes, en Mérida, Venezuela. Se han realizado muestreos en diferentes zonas geográficas de México y España, con ambientes salinos extremos, suelos salados, lagunas saladas, salinas costeras y zonas desérticas, con el objetivo de conocer la diversidad de microorganismos halófilos.

Hasta la fecha ha sido posible la creación de una colección de 60 cepas de actinomicetos halófilos, aislados de ambientes hipersalinos localizados en la vertiente del océano pacífico en México, los cuales han sido caracterizados por medio de un estudio fenotípico y molecular (63-66).

Cabe mencionar que los actinomicetos aislados en México tienen un alto porcentaje de similitud con dos de los géneros de actinomicetos que incluyen especies halófilas. Los géneros encontrados por secuenciación del gen 16S muestran una distribución geográfica diferente, siendo el género Actinopolyspora predominante en el norte del país (por arriba del Trópico de Cáncer), mientras que el género Saccharomonospora predomina en el sur del país (63, 64, 75, 77).

En la Figura 1 se muestran los géneros de actinomicetos que incluyen especies halófilas. Las cepas representadas con las claves JA6-1 y LRS fueron aisladas en la zona sur de México; las cepas COSE-1a y COSE-1b fueron aisladas de la zona norte de México y las cepas CAD96S8-2, CAD96S14-2a y HS4-1b son cepas provenientes del sur de España.

Figura 1. Géneros de actinomicetos que incluyen especies halófilas

AGRADECIMIENTOS

A los doctores María Isabel Calderón, María del Carmen Márquez y Antonio Ventosa, de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, España.

M. en C. Ninfa Ramírez Durán actualmente es becaria del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología con número de registro: 141507.

Erika Colmenares P. Edición y corrección de este artículo.

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