Susceptibilidad in vitro al Ajoene de aislados de Candida albicans, C. parapsilosis y C. krusei obtenidos de pacientes con onicomicosis y su relación con el tratamiento tópico.

Lemus, D.¹; Maniscalchi, M.T.¹; Ledezma, E.^1,2; Sánchez, J¹.; Vivas, J.³; Apitz-Castro, R.²

¹Escuela de Medicina. Universidad de Oriente. Núcleo de Anzoátegui.

 ²Laboratorio de Trombosis Experimental. Centro de Biofísica y Bioquímica IVIC.

³Instituto de Biología Experimental (IBE) UCV.

RESUMEN

Ajoene es un compuesto órganosulfurado obtenido originalmente de extractos alcohólicos del ajo y presenta una actividad antimicótica que ha sido ampliamente demostrada. En este trabajo estudiamos la susceptibilidad in vitro al ajoene, de levaduras aisladas de pacientes con onicomicosis, relacionándola con la actividad in vivo mostrada por este compuesto. Para ello fueron seleccionados 8 pacientes con diagnóstico clínico y micológico de onicomicosis. Seis recibieron ajoene en solución al 0,4% y dos fluconazol 150 mg/semanal por 4 meses, con controles clínicos y micológicos a los 30, 60 y 90 días. Se determinaron la CMI y CI₅₀ de ajoene, fluconazol y terbinafina siguiendo las directrices del NCCLS M27-A con modificaciones (RPMI 2% G y uso de hemocitómetro) Los valores de CMI de ajoene oscilaron entre 2.34 - 70.2 µg/ml y la CI₅₀ entre 0.26 - 7.08 µg/ml,. Todos los pacientes tratados con ajoene mostraron después de cuatro meses de tratamiento una importante mejoría de los síntomas y  siete de los ocho tratados mostraron cura micológica. 

Palabras-Clave: Ajoene, Susceptibilidad in vitro, Candida sp.

In vitro susceptibility of Candida albicans, C. parapsilosis and C. krusei isolated of onychomycosis patients to Ajoene and their relationship with topical treatment.

ABSTRACT

Ajoene is an organosulphur compound obtained from garlic alcoholic extracts, with demonstrated broadly antifungal activity both in vivo as in vitro. In this work we determine the susceptibility in vitro of yeast isolates of patients with onychomycosis and which were related with the in vivo activity shown by this compound. Eight patients were selected with clinical and mycological diagnostic of onychomycosis. Six received ajoene solution 0,4% and two fluconazol 150 mg/weekly for 4 months, with clinical and mycologycal controls on days 30, 60 and 90. The MIC and IC₅₀ of ajoene, fluconazol and terbinafine were determined following the guidelines of NCCLS M27-A with modifications (RPMI 2% G and use of hemocytometer). The values of CMI oscillated among 2.34 - 70.2 µg/ml and the CI₅₀ among 0.26 - 7.08 µg/ml. All the patients treated with ajoene showed improvement of symptoms and mycological cure after four months of treatment.

Key words: Ajoene, Susceptibility in vitro, Candida sp.

INTRODUCCIÓN

El término onicomicosis se refiere a la enfermedad de la uña causada por hongos. Los agentes etiológicos involucran tres grupos de hongos: los dermatofitos, los mohos no dermatofitos y las levaduras; los dos últimos son generalmente invasores secundarios a enfermedades previas de las uñas o accidentes mecano traumáticos (1, 2). Las infecciones de las uñas y pliegues ungueales causadas por levaduras del género Candida fueron descritas por Dubendorfer entre 1904 y 1910; desde esa fecha hasta el presente se han publicado numerosos artículos sobre onicomicosis donde el agente etiológico reportado es este tipo de hongo (3). Las onicomicosis han sido consideradas por diferentes autores como las micosis superficiales más difíciles de diagnosticar y tratar, no se resuelven espontáneamente y requieren de tratamientos muy prolongados. Uno de cada cinco pacientes no se cura (4, 5) y representan la principal causa de enfermedad de la uña en los países desarrollados, con una incidencia que se ha venido incrementando de manera sostenida durante los últimos años (1). Las levaduras que han sido identificadas como agentes causantes de onicomicosis son por orden de frecuencia: Candida albicans, Candida parapsilosis y Candida guillermondii (6).

Las onicomicosis en general son tratadas exclusivamente como un problema cosmético, sin considerar el impacto real que tiene esta enfermedad, al afectar marcadamente la calidad de vida y el bienestar psico-social de los pacientes, con resultados significativamente negativos en los ámbitos emocional, social y laboral. Este estado patológico de las uñas puede ser un factor condicionante en diferentes actividades (manipuladores de alimentos, maestras, secretarias, etc) impidiendo el desempeño normal de sus funciones y produciendo en estos pacientes vergüenza, trastornos de la personalidad, ansiedad y depresión (7).

En el tratamiento de las onicomicosis, la terapia oral es actualmente una terapia generalizada y para ello se utilizan fundamentalmente derivados azólicos (fluconazol e itraconazol) y alilaminas (terbinafina). Los azoles actúan directamente sobre la síntesis del ergosterol, uniéndose fundamentalmente a la enzima 14-a desmetilasa, sistema dependiente de la citocromo P-450, produciendo compuestos metilados que resultan tóxicos para la célula (8). Las alilaninas ejercen su acción mediante la inhibición de la escualeno epoxidasa, una enzima implicada en la síntesis del ergosterol. La acumulación del escualeno resulta altamente tóxica y genera una actividad fungicida que se manifiesta tempranamente.

Ajoene, un agente antifúngico que nunca antes ha sido utilizado en el tratamiento de onicomicosis, posee un mecanismo de acción que parece estar asociado a múltiples efectos como son: la inhibición de la biosíntesis de fosfatidilcolina, la generación de un desorden del empaquetamiento de los fosfolípidos en la membrana (sin afectar la estructura principal del mosaico) y la inhibición de la enzima glutatión reductasa, una enzima fundamental en la regulación de la carga oxidativa. El uso de ajoene, como agente antimicótico tópico en la terapéutica clínica en seres humanos, ha sido demostrado con anterioridad (9-12), donde se ha evidenciado un buen margen de seguridad y una excelente efectividad. Por ello, se decidió determinar la susceptibilidad de las levaduras patógenas asociadas a onicomicosis al compuesto ajoene, fluconazol y terbinafina, utilizando el método de microdilución establecido por la NCCLS M27-A y relacionar esta actividad in vitro con la mostrada en el tratamiento tópico de estos pacientes.

MATERIALES Y MÉTODOS

Antifúngicos

El compuesto ajoene fue sintetizado y purificado en el Laboratorio de Trombosis Experimental del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), siguiendo metodología descrita con anterioridad (21), y se almacenó a -20ºC hasta su utilización, en dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma®), para las pruebas de susceptibilidad. Para el tratamiento de los pacientes se preparó una solución al 0,4% de ajoene en glicerol-etanol 50%, envasándose en frascos goteros previamente esterilizados. El fluconazol y la terbinafina fueron gentilmente donados por el Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”; para la realización de las pruebas de susceptibilidad se disolvieron en DMSO y se guardaron a -20ºC hasta su uso. Para el tratamiento de los pacientes control se utilizó fluconazol en su presentación comercial (Valmorca®).

Selección de los pacientes.

Fueron evaluados 8 pacientes con edades comprendidas entre los 20 y 77 años, masculinos y femeninos, que presentaron diagnóstico clínico y micológico de onicomicosis. Los pacientes seleccionados fueron distribuidos en dos grupos, según su secuencia de incorporación, para recibir tratamiento tópico por cuatro meses, dos veces por día, con 0,4% de ajoene en solución y fluconazol por vía oral en dosis de 150 mg / semana.

Evaluación clínica y micológica

Los pacientes fueron examinados mensualmente, al inicio del tratamiento, durante su aplicación y a los 30 y 60 días posteriores al tratamiento; en cada revisión se evaluaron los   siguientes signos: leuconiquia, paquioniquia, onicolisis, onicomalasia, acumulo de detritus subungueales y perdida de brillo, mediante una escala de puntuación que establece los valores de: cero (0) si esta ausente; uno (1) si es leve; dos (2) si es moderado y tres (3) si es intenso. Además se evaluó el proceso de la mejoría clínica de la lesión según el crecimiento que a la vista experimentaba la parte sana de la uña.

Evaluación clínica

 -   Completamente curado: Regeneración del plato ungueal y observación de uña saludable.

 -  Marcada mejoría: Recuperación en 70% de la uña afectada.

 -  Mejoría: recuperación de 40-70% de la uña afectada.

 - Ligera mejoría: recuperación de menos de 40%

 -  Ausencia de cambios: no se observó variación de los signos en el lecho ungueal. 

      Evaluación Micológica

 -   Cura: ausencia del patógeno en el examen directo y/o cultivo.

 -  Persistencia: Presencia del patógeno en el examen directo y/o cultivo.

 -  Recaída: Ausencia del patógeno basal al final del tratamiento, con reaparición del mismo patógeno en el siguiente examen directo y/o cultivo. Según Criterios de González  M y col. (13).

Identificación Micológica

Se realizó onicotomía con pinza gubia. Las muestras se colocaron en recipientes estériles debidamente identificados y se procedió a realizar examen directo por aclaración con KOH al 30%. El material ungueal recolectado fue cultivado por duplicado por cinco a siete días a temperatura ambiente en agar Sabouraud (BBL, Becton Dickinson) más cloranfenicol (250 mg/ml). Posteriormente se procedió a la identificación taxonómica de las cepas por metodología automatizada para identificación de levaduras (MicroScan AutoScan 4) y se corroboraron por metodología convencional (formación de clamidosporas, producción de tubo germinal, asimilación de azúcares, resistencia a cicloheximida) (14-17). 

Susceptibilidad in vitro.

Se siguieron procedimientos recomendados por el Nacional Comittee for Clinical Laboratory Standards para levaduras, con algunas modificaciones sugeridas por EUCAST-AFST 2002, según se explica a continuación (18-20).

Preparación del inoculo.

Tanto las levaduras identificadas, provenientes de los pacientes, como las cepas C. parapsilosis ATCC 22019 y C. krusei ATCC 6258 (empleadas como cepas de referencia), se mantuvieron inicialmente en medio Sabouraud dextrosa más cloranfenicol. Para los ensayos de sensibilidad, se transfirió de la colonia inicial una asada al medio RPMI suplementado con 2% de glucosa, se repicaron sucesivamente cada 24 horas para adaptarlas al medio y se conservaron en agitación constante a 100 rpm (Shakers orbital, Lab-line) a 35ºC. Para la cuantificación del inóculo se utilizó un hemocitómetro y microscopio óptico (Olympus 300 Bx), ajustándose el inoculo final entre 1-5 x10³ cel/ml.

Curva de crecimiento y Susceptibilidad in vitro

El inoculo obtenido anteriormente en conjunto con las drogas a ser evaluadas fue cultivado por triplicado en un volumen final de 200 ml, en placas para ELISA de 96 pozos fondo plano (Falcónâ) con sus respectivos controles de esterilidad y de crecimiento. La concentración final del dimetil sulfóxido (DMSO, Sigmaâ) en los cultivos nunca fue mayor al 1%. El crecimiento se cuantificó a 490 nm hasta el quinto día mediante la utilización de un lector de microplacas Elisa (Elx 800, Bio-Tek, Instrumentsâ). Todos los experimentos fueron realizados en condiciones de esterilidad y bajo campana de flujo laminar tipo II (Labconco).

Determinación de la CMI y CI₅₀

Para determinar los valores de CMI y CI₅₀ fueron construidos gráficos del Nº de células vs. [Droga], y la CMI fue obtenida como la mínima concentración de droga capaz de producir el máximo efecto inhibitorio. Un gráfico (Nº de células vs. log [Droga]) fue elaborado para calcular el CI₅₀, aplicando la formula: [Droga₅₀ = antilog(1/2 Nº células^C – b) m, donde Nº células^C es el Nº células del control a las 24 horas, m es la pendiente y b es el corte en Y. Para la realización de curvas dosis respuesta a los fármacos ensayados, los procedimientos de regresión lineal, cálculos de las CMI y CI₅₀, se usó el paquete estadístico SigmaPlot para Windows versión 8.0 (SPSS Inc. Chicago, Illinois).  

RESULTADOS

Los ocho pacientes evaluados (3 hombres y 5 mujeres) mostraron edad media entre 46,4 ± 11,1 años (límites 20-55); dos tenían infecciones de las uñas de los pies y 6 en las uñas de las manos. Cinco pacientes mostraron una evolución entre 1-5 años, dos de 5-10 años y uno de menos de un año de duración. Con relación a las características clínicas de las uñas afectadas, la blancura anómala de la uña se evidenció en siete de ocho casos, la presencia de detritus subungueal en tres de ocho casos y el engrosamiento de la uña se observó en sólo uno de los pacientes. La pérdida de brillo, onicomalasia y uñas quebradizas se observaron con menos frecuencia. Paroniquia se presentó en un sólo caso. En el 30% de los pacientes la afectación de la uña era del 50% o más y en un sólo caso del 100%. Los  cultivos demostraron que en las uñas de las manos la especie más frecuente fue C. parapsilosis, seguida por C. albicans y C krusei. Por el contrario, en las dos muestras procedentes de uñas de los pies, la única especie encontrada fue C. parapsilosis.

La Figura 1 muestra el efecto antiproliferativo (respuesta dosis-dependiente) de ajoene sobre uno de los aislados de C. albicans. En la gráfica se puede observar que la CMI para esta levadura se alcanzó a concentraciones de 100 µM ajoene y la CI₅₀ fue de 1,21 µM. Gráficas similares a ésta fueron obtenidas para cada una de las cepas y para cada una de las drogas. En la Tabla 1 se presentan los valores de las CMI y CI50 obtenidas en este estudio para todos los antifúngicos evaluados. La actividad in vitro de fluconazol frente a las 10 cepas de levaduras resultó en valores de CMI que oscilaron entre 10-100 mM, mientras que las CMI de ajoene y terbinafina oscilaron entre 10-300 µM.

 

 Figura 1. Efecto antiproliferativo de Ajoene a distintas concentraciones sobre la cepa 2 (Candida albicans).  1 µM (=); 3 µM (<); 10 µM (5); 30 µM (Ÿ); 100 µM (Ñ); 300 µM (¨); control de crecimiento (–³–).

 

Tabla 1. Valores de concentración mínima  inhibitoria  (CMI) y  de la concentración   inhibitoria  50 (CI₅₀) con especies de Candida..

De una de las cepas de Candida parapsilosis (cepa 4) se obtuvo la CMI más baja de todas las levaduras, siendo 10 mM para todos los antifúngicos evaluados; sin embargo, el resto de los aislados de esta especie presentaron gran variabilidad en los valores de CMI de los antifúngicos, teniendo un comportamiento similar al resto de los demás aislados de las otras especies. Para la cepa ATCC 22019, la CMI de fluconazol fue de 10mM, y la de ajoene y terbinafina de 100 mM. Para la cepa ATCC 6258, correspondiente a C. krusei, las CMI de todos los antifúngicos evaluados fueron iguales o mayores a 100 mM. El fluconazol mostró la mayor actividad in vitro contra todos los aislados de Candida sp., con una CMI promedio de 36 mM, seguido de terbinafina con una CMI promedio de 102 mM y ajoene con un promedio de 171 mM. Estos resultados son consistentes con lo reportado por múltiples autores (22-24).

El único aislado de C. krusei (cepa 6) presentó la menor susceptibilidad para todos los agentes estudiados. Para fluconazol se obtuvo una CMI de 100 mM; para terbinafina y ajoene el valor de la CMI fue de 300 mM  respectivamente. Este mismo aislado mostró los mayores valores de CI₅₀ y correspondió a la terbinafina con 40,95 mM. El valor más alto de CI₅₀ observado para ajoene fue en un aislado de C. parapsilosis, con una CI₅₀ de 30,25 mM y para fluconazol este valor se presentó en C. krusei y fue de 7,73 mM.  Por otra parte, la CI₅₀ de ajoene para Candida albicans mostró un promedio de 1,15 mM, con fluconazol resultó en 2,14 mM y la CMI promedio de terbinafina fue de 0,395 mM, siendo el valor promedio menor en todas  las especies de levaduras valoradas.

Fluconazol presentó la mínima CI₅₀ promedio para todos los aislados, con un valor de 2,27 mM, seguido de terbinafina con 5,71 mM y ajoene con 13,45 mM, a diferencia de los valores obtenidos para la CMI, donde la variación entre fluconazol y los demás antifúngicos resultó estar en un mismo orden de magnitud. La diferencia entre los valores de CI₅₀ resultó ser muy pequeña y se podría decir que estas son muy similares entre si.

En los pacientes tratados con ajoene se observó una mejoría clínica de todos los signos y síntomas desde el primer mes de tratamiento. Entre los primeros signos y síntomas que disminuyeron su grado de afectación se pueden mencionar el detritus subungueal, las manchas en placa ungueal y la paroniquia;  a los tres meses todos los pacientes presentaron una significativa reducción de los signos y síntomas (Figura 2), persistiendo en uno sólo de ellos leuconiquia y detritus subungueal leve en grado 1. La cura micológica se observó para ambos grupos a partir del tercer mes de tratamiento. A los tres meses de tratamiento uno de los dos pacientes tratados con fluconazol curó micológicamente, mientras que, 5 de 6 pacientes tratados con ajoene presentaron cultivos y examen directo negativos. A los cuatro meses de tratamiento, todos los pacientes tratados con fluconazol presentaron cura micológica y un paciente con ajoene mantenía persistencia micológica; a este paciente se le aisló Candida parapsilosis (cepa 7) cuya CMI y CI50 fueron las más altas para los tres antifúngicos estudiados.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

En este estudio la mayoría de los pacientes incorporados pertenecían al género femenino; esta distribución de frecuencia es consistente con lo observado en la literatura, donde se refiere una incidencia de onicomicosis ungueal tres veces mayor en la mujer (24, 25). Candida albicans es, sin dudas, la especie levaduriforme de mayor interés clínico; sin embargo, en el presente trabajo, fue C. parapsilosis la más encontrada, coincidiendo con lo reportado por otros autores (26, 27). En esta investigación, se encontraron lesiones por Candida parapsilosis principalmente en ambas manos. Este género esta reconocido por su capacidad de adherencia al estrato corneo a través de adhesinas y mananoproteinas (b glucán, b glucan-quitina) presentes en su pared celular y por la capacidad de producir filamentos cuando se encuentra en forma parasitaria e invasora en el hospedero, generando cambios que se inician en el pliegue proximal, avanzando hacia la zona central de la uña, donde la queratina es más suave, aumentando el grosor de las masas corneas subungueales,  induciendo progresivamente cambios de coloración, levantamiento del pliegue ungueal y onicolisis en el lecho ungueal, que suele ser el signo clínico con el cual el paciente asume la presencia del foco infeccioso (23)

 Figura 2. Lesión ungueal en uña de mano: A antes de tratamiento con Ajoene solución 0,4%, B 3 meses después de tratamiento con Ajoene solución 0,4%.

En este trabajo, fluconazol presentó un rango de CMI entre 10 y 100 mM y C. krusei mostró para esta droga los más altos requerimientos, alcanzando la CMI valores de hasta 100 mM; todo ello resulta consistente con diversos trabajos realizados anteriormente por otros investigadores (22-24). Terbinafina mostró para C. albicans la menor CI₅₀, en comparación con fluconazol y ajoene, lo cual es concordante con lo reportado por Ryder y col., en 1998. Para la especie C. krusei, este antimicótico mostró los valores más altos de CMI en comparación con fluconazol, alcanzando valores de hasta 300 mM.

Los valores CMI y CI₅₀ de ajoene mediante la técnica de microdilución no pueden ser comparados con los obtenidos por otros autores ya que la técnica recomendada por la NCCLS nunca antes había sido utilizada para evaluar la susceptibilidad ante este novel compuesto, sin embargo, los resultados generados por otros autores utilizando técnicas de macrodilución son similares a los obtenidos en este estudio (13, 24)

El mecanismo de acción de ajoene como agente antimicótico esta asociado a perturbaciones que se originan en la integridad de la membrana plasmática. Este efecto, que conduce a la deformación de la estructura del hongo, se pudo observar por microscopia óptica sobre los microcultivos en placa de Elisa, donde se evidencio alteración de las hifas y blastoconidias, que presentaban protuberancias e hinchamiento a lo largo de toda la estructura fúngica, con apariencia granular, sugestiva de colapso localizado y problemas osmóticos, que han sido descritos por otros autores (28, 29).

La duración normal de la regeneración de las uñas de las manos es de seis meses y para las uñas de los pies es de 12 a 18 meses, sin embargo, el índice de crecimiento varía de persona a persona y se hace más lento con la edad. Con ajoene al 0,4% se alcanzó remisión clínica y cura micológica a los tres meses para siete de ocho pacientes. Sólo una paciente mostró persistencia micológica aún al cuarto mes, sin embargo, sus lesiones ungueales crónicas (aproximadamente 5 años de evolución) han mostrado una mejoría clínica con eliminación de la inflamación periungueal y del dolor al tacto, desaparición de la onicolisis y la marcada disminución de la leuconiquia; esto pudiera ser el resultado de los diversos factores dependientes del fármaco y de la virulencia del hongo (30). Entre otros factores, se puede mencionar que el tiempo de la evolución de la lesión es mayor a cinco años y que la cepa de esta paciente (cepa 7) in vitro fue de la que se obtuvo los valores de CMI y CI₅₀ más elevados en todos los fármacos. Esta paciente debido a su notoria mejoría clínica ha continuado recibiendo tratamiento con ajoene. 

La dosis de ajoene 0.4% solución 2 veces por día fue muy conveniente y aceptable para los pacientes. El mecanismo de acción de ajoene, que involucra distintos efectos a nivel molecular, parece favorecer la relación entre la actividad in vitro e in vivo. Los esquemas cortos de administración, sobre todo en las uñas de los dedos de los pies suelen garantizar no sólo menos posibilidades de recaída, sino además, un mayor cumplimiento del tratamiento. Estos resultados sugieren que ajoene podría estar penetrando a través del lecho ungueal alcanzando concentraciones fungistáticas y fungicidas después de la aplicación de la solución al 0.4% dos veces al día durante 90 días consecutivos, tiempo en el cual se presentó la cura micológica. Este efecto del ajoene in vivo llevó a una mejoría de los síntomas clínicos más notorios. Sin embargo, se podría facilitar y mejorar su acción al formular ajoene en conjunto con otros coadyuvantes, como por ejemplo los queratolíticos. Los resultados obtenidos en este estudio, mediante la utilización tópica de ajoene en solución al 0,4% son prometedores y comparables con los obtenidos con fluconazol 150 mg/semanal  En conclusión ajoene podría desempeñar un papel importante en el control de las onicomicosis generadas por Candida sp., lo que permitiría una disminución en los costos de tratamiento. 

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Fundacite-Anzoátegui el financiamiento del Proyecto de Investigación PI-0204 (E.L.).

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