Estudio de la susceptibilidad in vitro de aislados de Microsporum canis al ajoene, terbinafina y griseofulvina, utilizando el método de microdilución.

Maniscalchi MT¹, Lemus D¹, Ledezma E¹,², Vivas J³, Sánchez J¹ y Apitz-Castro R².

¹Escuela de Medicina. Universidad de Oriente. Núcleo de Anzoátegui. 

²Laboratorio de Trombosis Experimental. Centro de Biofísica y Bioquímica IVIC. 

³Instituto de Biología Experimental (IBE) UCV.

RESUMEN

Ajoene es un agente seguro y eficaz en el tratamiento de cromomicosis y algunas dermatofitosis; ha mostrado su actividad sobre aislados de Microsporum canis, perfilándose como una droga potencial para el tratamiento tópico de la tinea capitis. Por ello, consideramos relevante determinar la susceptibilidad in vitro de 6 aislados de Microsporum canis, obtenidos de pacientes con dicha patología, a los antifúngicos ajoene, terbinafina y griseofulvina, utilizando procedimientos establecidos por el NCCLS M38-A con algunas modificaciones Para el compuesto ajoene los valores de CMI y CI₅₀  estuvieron entre 30-204 µM y 1,45-2,96 µM; las CMI y CI₅₀ de terbinafina se localizaron entre 10-30 µM y 0,02-0,12 µM y para la griseofulvina entre 10-30 µM y 1,08-3,91 µM (0,38-1,38µg/ml) respectivamente. M. canis fue susceptible a ajoene de manera dosis-dependiente, pudiendo este compuesto constituir una alternativa eficiente para el tratamiento de la  tinea capitis.

Palabras-Clave: Microsporum canis, susceptibilidad in vitro por microdilución, Ajoene, Nuevos Antifúngicos, Dermatofitos, tinea capitis. 

In vitro susceptibility of Microsporum canis to ajoene, terbinafina and griseofulvina using a microdilution test

ABSTRACT

Ajoene is a secure and effective agent in chromomycosis and some dermatophytosis treatments; it has shown its activity on Microsporum canis isolates, being a potential drug for topical treatment of tinea capitis. We consider outstanding to determine in vitro susceptibility to ajoene, terbinafine and griseofulvin of six Microsporum canis isolated of patients with this disease, following the guidelines of NCCLS M38-A for molds, with some modifications. The ajoene MIC range were 30-204µM and the IC₅₀ values oscillated among 1,45-2,96 µM; terbinafine MIC and IC₅₀values were among 10-30 µM and 0,02-0,12 µM; griseofulvin MIC and IC50 values were among 10-30µM and 1,08-3,91µM (0,38-1,38µg/ml) respectively. M. canis shows a dose-dependent susceptibility to ajoene, being able to constitute an efficient alternative for tinea capitis treatment.

Key words: Microsporum canis, Broth microdilution susceptibility, Ajoene, New antifungic, Dermatophytes, tinea capitis. 

INTRODUCCIÓN

La tinea capitis es la dermatofitosis más frecuente en la niñez principalmente en el grupo etáreo comprendido entre los 5 y 10 años de edad, aunque también se han descrito casos en adultos y lactantes (1-3). Para el tratamiento de esta micosis, la griseofulvina sigue siendo considerado como un fármaco eficaz, seguro y económico, convirtiéndolo en la droga de elección para la tiña del cuero cabelludo, a pesar de los diversos efectos adversos que puede presentar (cefalea, molestias gastrointestinales, sequedad de la boca, reacciones alérgicas en forma de urticarias, eritema, entre otros) y de la intolerancia al producto manifestada por algunos pacientes (4-7). Aunque la griseofulvina ha resultado efectiva, existen reportes de recidivas, siendo necesario su sustitución por otro antifúngico (7, 8). Sin embargo, el itraconazol y la terbinafina que han demostrado ser efectivos contra los dermatofitos, resultan muy costosos y a pesar que son mejor tolerados por el paciente, se han reportado algunos casos de infantes tratados con terbinafina que presentaron efectos adversos muy severos (4, 7), como por ejemplo, manifestaciones gastrointestinales y alteraciones hepáticas. En el caso de itraconazol, se ha reportado dolores de cabeza, con una incidencia de 3,5% en niños tratados con esta droga, además de erupciones cutáneas y malestares gastrointestinales y cerca del 2% presentaron alteraciones de los resultados de las pruebas de funcionalismo hepático (4). Aún cuando desde el año 1996 está permitido el uso de terbinafina en niños en los países europeos y desde entonces, casi todos los estudios pediátricos de este fármaco se han centrado principalmente sobre su utilización en la tinea capitis (7), estos fármacos son considerados sólo como opciones de segunda línea. Además, se ha observado que Microsporum canis uno de los agentes etiológicos más frecuente de tinea capitis (2, 4) presenta cierta resistencia a la terbinafina y a la griseofulvina. Incluso hay autores que señalan que la terbinafina no resulta eficaz en infecciones causadas por esta especie, reafirmando el papel de la griseofulvina como tratamiento de elección y teniendo al itraconazol como única alternativa válida para tratar casos que no respondan a la griseofulvina o pacientes que no la toleren (6, 7).

Hasta los momentos, ningún antimicótico usado tópicamente ha demostrado ser efectivo en el tratamiento de la tiña del cuero cabelludo. Ajoene un agente antifúngico que ha resultado seguro y eficaz en el tratamiento tópico de corta duración de la tinea pedis, tinea corporis, tinea cruris y en cromomicosis, ha mostrado, en estudios de macrodilución y difusión en agar, un efecto inhibidor importante en el crecimiento de Microsporum canis, constituyéndose en un agente potencial para el tratamiento tópico de esta patología. Por ello, consideramos relevante determinar la susceptibilidad in vitro de varias cepas de M. canis aisladas de pacientes con tinea capitis, utilizando los procedimientos recomendados por el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) en su documento M38-A (9) con algunas modificaciones. Este es el único método internacional estandarizado para hongos filamentosos, que resulta de gran utilidad a la hora de determinar in vitro la actividad de cualquier droga antimicótica, y aunque la potencia antifúngica así determinada no predice como será la actividad de la droga en sistemas in vivo, una buena correlación entre ambas actividades puede ser esperada. 

En este estudio se evaluó la susceptibilidad de 6 aislados de Microsporum canis que fueron obtenidos de pacientes con tinea capitis a los antifúngicos ajoene, terbinafina y griseofulvina.

MATERIALES Y MÉTODOS

Antifúngicos

El compuesto ajoene fue sintetizado y purificado en el Laboratorio de Trombosis Experimental del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC) como ha sido descrito previamente (10). La griseofulvina y la terbinafina fueron gentilmente donadas por el Instituto Nacional de Higiene Rafael Rancel. Todas las drogas se almacenaron en dimetilsulfoxido (DMSO) a -20ºC hasta su utilización definitiva en los cultivos. Las concentraciones finales de ajoene y terbinafina estuvieron en un rango de 1 - 300 µM y de griseofulvina de 300 µM - 100 µM.  

Cepas de Microsporum canis. 

Se obtuvieron seis (6) aislados de pacientes con tinea capitis, cultivados en agar Sabouraud (BBL, Becton Dickinson) y agar Lactrimel, ambos con cloranfenicol a temperatura ambiente entre 25ºC y 28ºC. Las cepas aisladas fueron identificadas por medio de la observación de sus características macroscópicas y microscópicas, siguiendo los criterios micológicos ya descritos (11). 

Susceptibilidad in vitro. 

La susceptibilidad de los aislados se estudió mediante la técnica de microdilución en microplacas estériles fondo plano de 96 pozos (Falcón®), siguiendo recomendaciones descritas previamente en el documento NCCLS M-38A (9) para hongos filamentosos, con algunas modificaciones. Brevemente: Las colonias maduras de cultivos puros bien crecidos, fueron cubiertas con 3 a 5 ml de solución fisiológica estéril y agitadas en vortex (Maxi-Maxi) durante un minuto aproximadamente; a la suspensión así obtenida se le realizó cuantificación de las macro y microconidias mediante la utilización de un hemocitómetro; finalmente se prepararon diluciones con el medio RPMI 1640 suplementado con 2% de glucosa, hasta obtener una concentración de inoculo final entre 1x10⁴ y 2x10⁴ conidios/ml (12, 13). El inoculo obtenido anteriormente, en conjunto con las drogas a ser evaluadas, fue cultivado por triplicado a 28 ºC en un volumen final de 200 ml durante 13 días en cámara húmeda con sus respectivos controles de esterilidad y de crecimiento; la concentración final de dimetil sulfóxido (DMSO, Sigma ®) en los cultivos nunca fue superior al 1%. El crecimiento se cuantificó a 630 nm mediante la utilización de un lector de microplacas Elisa (Elx 800, Bio-Tek, Instrumentsâ). Todos los experimentos fueron realizados en condiciones de esterilidad y bajo campana de flujo laminar tipo II (Labconco). Los valores diarios de densidades ópticas (DO) se graficaron para la determinación de la curva de crecimiento, la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Inhibitoria 50% (CI₅₀)

Determinación de la CMI y CI₅₀.

Para el cálculo de la CMI y CI₅₀, se tomaron los valores de la densidad óptica (DO) que se obtuvo a los 9 días de crecimiento (que fue donde se observó un máximo crecimiento exponencial) con las distintas concentraciones de cada droga y se realizaron gráficos: DO 630λ versus concentración de la droga al tiempo seleccionado (14-16). En el gráfico la concentración mínima inhibitoria (CMI) es la menor concentración de droga capaz de producir el máximo efecto inhibitorio. Un gráfico DO versus log [antifúngico] fue elaborado para calcular la CI₅₀, aplicando la formula: [Droga₅₀] = antilog (DO^CI50 - b)/m, donde DO^CI₅₀ es la densidad óptica que corresponde a la mitad del máximo efecto inhibitorio del control de crecimiento a los 9 días, m es la pendiente y b es el corte en el eje y. Para la realización de curvas dosis respuesta a los fármacos ensayados, los procedimientos de regresión lineal, cálculos de los CMI y CI₅₀ se usó el paquete estadístico SigmaPlot para Windows versión 8.0 (SPSS Inc. Chicago, Illinois).

RESULTADOS

De las Figuras 1 a la 6 se pueden observar las curvas de crecimiento obtenidas con el método recomendado por el NCCLS M-38A modificado, así como se evidencia el comportamiento clásico de crecimiento con fase exponencial que se inicia después del primer día de cultivo, definiéndose claramente a partir del segundo día y alcanzando la fase estacionaria al décimo día; todos los aislados presentaron este mismo patrón de comportamiento. También se puede percibir el carácter de dosis respuesta de los aislados a las diferentes concentraciones de las drogas utilizadas.

En la Tabla 1 se presentan los valores de las CMI y las CI₅₀ obtenidas para los tres antifúngicos en cada uno de los aislados estudiados. Las CMI de ajoene estuvieron en un rango de 30 µM a 204 µM (7,02 µg/ml - 47,7 µg/ml), con un promedio de 82,33 ± 62,77 µM y las concentraciones inhibitorias al 50% oscilaron entre 1,45 µM y 2,88 µM (0,34 µg/ml – 0,67 µg/ml), promedio de 2,15 ± 0,61 µM. Terbinafina fue el antifúngico que presentó los menores valores, con una CMI promedio de 6,5 ± 3,5 µM  (1,89 ± 1,02 µg/ml) y para el CI₅₀ un promedio de 0,08 ± 0,05 µM (0,02 ± 0,014 µg/ml). Los máximos valores de CMI y CI₅₀ se obtuvieron en la cepa Mc2.

Las cepas Mc3 y Mc4 resultaron ser las más sensibles a todas las drogas evaluadas, presentando los valores más bajos de CMI y CI₅₀. Aunque, al comparar ajoene y griseofulvina las CMI obtenidas de ajoene fueron levemente mayores en ambas cepas, los valores de CI₅₀ son ligeramente más elevados para griseofulvina en la cepa Mc3. Estos resultados muestran que el compuesto terbinafina in vitro mostró una mayor potencia antifúngica en comparación con la griseofulvina y el ajoene, que resultaron con una actividad bastante similar.

 

Figura 1. Efecto antiproliferativo de Ajoene a distintas concentraciones sobre la cepa Mc2. 1 µM (=); 3 µM (<); 10 µM (5); 30 µM (¨); 100 µM (Ñ); 300 µM (·); control de crecimiento (–³–).

 Figura 2. Efecto antiproliferativo de Terbinafina a distintas concentraciones sobre la cepa Mc2. 1 µM (=); 3 µM (<); 10 µM (5); 30 µM (¨); 100 µM (Ñ); 300 µM (·); control de crecimiento (–³–).

 Figura 3. Efecto antiproliferativo de Griseofulvina a distintas concentraciones sobre la cepa Mc2. 300 חM (š);1 µM (˜); 3 µM (¾); 10 µM (p); 30 µM (Ã); 100 µM (Ñ); control de crecimiento (–³–).

 Figura 4. Efecto antiproliferativo de Ajoene a distintas concentraciones sobre la cepa Mc4. 1 µM (=); 3 µM (<); 10 µM (5); 30 µM (¨); 100 µM (Ñ); 300 µM (·); control de crecimiento (–³–).

 Figura 5. Efecto antiproliferativo de Terbinafina a distintas concentraciones sobre la cepa Mc4. 1 µM (=); 3 µM (<); 10 µM (5); 30 µM (¨); 100 µM (Ñ); 300 µM (·); control de crecimiento (–³–).

 Figura 6. Efecto antiproliferativo de Griseofulvina a distintas concentraciones sobre la cepa Mc4. 300 חM (¡);1 µM (=); 3 µM (<); 10 µM (5); 30 µM (¨); 100 µM (Ñ); 300 µM (·); control de crecimiento (–³–).

Tabla  1. Valores  de  CMI  y  CI₅₀  de  las  cepas  de  M. canis  aisladas  de pacientes con tiña del pelo y cuero cabelludo.

DISCUSIÓN

El  compuesto  terbinafina fue el más activo contra Microsporum canis, con las CMI e CI50 más bajas, concordando con los reportes internacionales de susceptibilidad con técnica de microdilución (17, 18).

Si bien la mayoría de los investigadores (13, 18), señalan que terbinafina in vitro es el agente antifúngico, de uso comercial actual, más activo contra los dermatofitos, también se ha citado que, de los dermatofitos causales de tiña de la cabeza, el M. canis es el menos susceptible a este antifúngico (13, 17, 19, 20); con algunas excepciones se reportan rangos de sensibilidad similares entre M. canis, T. rubrum y T. mentagrophytes (21). Los rangos de CMI y de CI₅₀, referidos internacionalmente son muy variables, abarcando desde 0,0001µg/ml hasta cerca de 30 µg/ml. Esto puede ser consecuencia de lo complicado que ha resultado la estandarización de la técnica de susceptibilidad, debido a lo difícil que resulta regular el tamaño y el tipo de inóculo (22, 23), originando divergencias entre los rangos de sensibilidad reportados por uno u otro autor. Así mismo, la variabilidad de los resultados internacionales nos indica que se debe establecer el tipo de inóculo (conidias y/o hifas) a someter a prueba contra los antifúngicos. Aunque la mayoría emplean un pool formado por hifas fragmentadas y conidias (correspondiendo ambos a unidades formadoras de colonias [UFC]), estandarizado por espectrofotometría, se prefirió ajustar el inóculo empleando cámara hemocitométrica (12, 22), como un método útil y confiable para la estandarización del inóculo, de esta forma garantizamos el empleo de conidias únicamente (tanto macro como microconidias).

Las modificaciones sobre las recomendaciones del documento NCCLS 38-A (9) aplicadas en este trabajo se apoyan en resultados obtenidos por investigadores que se han dedicado al estudio de la susceptibilidad in vitro, tanto de dermatofitos como de otros hongos (12, 13, 24). Es bien conocido el hecho de que en los resultados de la susceptibilidad a los antifúngicos intervienen muchos factores, desde el tamaño y tipo del inóculo, hasta la temperatura y tiempo de incubación para el corte de las CMI (13, 23, 25).

Los  valores presentados en este estudio son los primeros que se obtienen utilizando la técnica de microdilución con el compuesto ajoene y aunque no son comparables con los obtenidos por Romero y cols., (14) (quienes utilizaron técnicas de difusión en agar y macrodilución, donde estimaron la proliferación del hongo mediante la determinación de la biomasa o peso seco y cuyos resultados fueron entre uno y dos ordenes de magnitud por encima de los reportados en ese trabajo), son concordantes con el rango de valores reportado por otros autores en distintas especies de hongos y otros sistemas biológicos (15, 26-30)

Estos resultados justifican el desarrollo de un estudio piloto en humanos mediante un esquema de tratamiento tópico, vía de administración que hasta el presente ha resultado ser eficaz para el uso de este novel compuesto. Además está sustentado favorablemente, debido a que el tratamiento sistémico actual puede generar la aparición de efectos adversos de gravedad variable, según el individuo. En vista de que el principal agente etiológico en nuestro país, es menos susceptible a los antifúngicos de elección o alternativos, esto conlleva en muchos casos a terapias sistémicas prolongadas, pudiéndose agravar la manifestación de los efectos adversos. Por otra parte, constituiría una terapia orientada fundamentalmente a la cura de una enfermedad pediátrica, esto implica la necesidad de desarrollar fórmulas farmacológicas de fácil administración. 

AGRADECIMIENTOS

Expresamos nuestro agradecimiento al Instituto Nacional de Higiene ‘Rafael Rangel’, en especial a la Dra. Vera Reviákina y a todo el personal que labora en el Departamento de Micología, por su invaluable contribución en la realización de este trabajo. Esta investigación fue parcialmente financiada por la Fundación para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología (FUNDACITE-Anzoátegui, Proyecto PI-0204 E.L.).

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Buckley DA, Fuller LC, Higgins EM and Du Vivier A. Lesson of the week: tinea capitis in adults. BMJ 2000; 320: 1389-90.        [ Links ]

2. Brito A; Marcano C; Rivas G y Rodríguez F. Dermatofitos causantes de tinea capitis en niños y adolescentes. Rev Soc Ven Microbiol 2001; 21: 26-8.        [ Links ]

3. Romano C, Gianni C, Papini M. Tinea capitis in infants less than 1 year of age. Pediatr Dermatol 2003; 20(3): 283-4.        [ Links ]

4. Gupta AK, and Summerbell RC. Tinea capitis. Medical Mycology 2000; 38:255-87.        [ Links ]

5. Higgins EM, Fuller LC, and Smith  CH. Guidelines for the management of tinea capitis. Br J Dermatol 2000; 143: 53-8.        [ Links ]

6. Del Palacio A, Garau M y Cuétara M. Tratamiento actual de las dermatofitosis. Rev Iberoam Micol 2002; 19: 68-71.        [ Links ]

7. Del Palacio A, Garau M, Tena D y Sánchez G. Tratamiento Antifúngico: Últimos Avances en Dermatología. Rev Iberoam Micol 1999; 16: 86-91.        [ Links ]

8. Prieto ML, Santos-Juanes J y Sánchez del Río J. Tinea capitis tratada con itraconazol en paciente inmunocomprometido. Cartas al editor. Ann Esp Pediatr 2002; 57(4): 378-86.        [ Links ]

9. NCCLS. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi. Approved standard M38-A., Wayne,  Pa. 2002; Vol. 22.        [ Links ]

10. Apitz-Castro R, Cabrera C, Ledezma E, and Jain M. Effects of garlic extract and three pure components isolated from it on human platelet aggregation, arachidonate metabolism, release reaction and platelet. Ultraestruct Trhomb Res 1983; 32: 155-69.        [ Links ]

11. Rippon J. Tratado de micología médica. 3ra edición; Editorial Interamericana, México. 1990; pp: 787-795.        [ Links ]

12. Guarro J, Pujol I, Aguilar C, Llop C, and Fernández-Ballart J. Inoculum preparation for in vitro susceptibility testing of filamentous fungi. J Antimicrob Chemother 1998; 42: 385-7.        [ Links ]

13. Fernández-Torres B, Cabañes FJ, Carrillo-Muñoz AJ, Esteban A, Inza I, Abarca L, and Guarro J. Collaborative evaluation of optimal antifungal susceptibility testing conditions for dermatophytes. J Clin Microbiol 2002; 40(11): 3999–4003.        [ Links ]

14. Romero H, Vivas J, Chalbaud V, Ledezma E, and Apitz-Castro R. In vitro antiproliferative effect of ajoene on Microsporum canis. J Mycol Med 2000; 10: 152-5.        [ Links ]

15. Vivas J, Romero H, Herrmann G, Ledezma E, Apitz-Castro R. In vitro antiproliferative effect of Ajoene on Cryptococcus neoformans. J Mycol Med 2002; 12: 149–51.        [ Links ]

16. Ledezma E, Jorquera A, Bendezú H, Vivas J, and Perez G. Antiproliferative and leishmanicidal effect of Ajoene on various Leishmania species: ultraestructural study. J Parasitol Res 2002; 88: 748-53.        [ Links ]

17. Fernández-Torres B, Carrillo AJ, Martín E, Del Palacio A, Moore MK, Valverde A, Serrano M, and Guarro J. In vitro activities of 10 antifungal drugs against 508 dermatophyte strains. Antimicrob Agents Chemother. 2001; 45(9): 2524–8.        [ Links ]

18. Serrano M, Chávez-Caballero M, Valverde-Conde A, Claro RM, Pemán J y Martín-Mazuelos E. Actividad in vitro de voriconazol y otros tres antifúngicos frente a dermatofitos. Enferm Infecc Microbiol Clin 2003; 21(9): 484-7.        [ Links ]

19. Hofbauer B, Leitner I, and Ryder NS In vitro susceptibility of Microsporum canis and other dermatophyte isolates from veterinary infections during therapy with terbinafine or grisofulvine. Med Mycol 2002; 40: 179-83.        [ Links ]

20. Mock M, Monod M, Baudraz-Rosselet F, and Panzon RG. Tinea capitis dermatophytes: susceptibility to antifungal drugs tested in vitro and in vivo.  Dermatology 1998; 197(4): 361-7.        [ Links ]

21. Lo Gascio G, Rosa G, Battaglia E, Maccacaro L, and Fontana R. Antifungal susceptibility testing of dermatophytes: evaluation of 105 clinical isolates. Mycoses 2001; 44: 44-5.        [ Links ]

22. Petrikkou E, Rodríguez-Tudela JL, Cuenca-Estrella M, Gómez A, Molleja A and Mellado E. Inoculum standardization for antifungal susceptibility testing of filamentous fungi pathogenic for humans. J Clin Microbiol 2001; 39(4): 1345–7.        [ Links ]

23. Guarro J, Llop C, Aguilar C and  Pujol I. Comparison of in vitro antifungal susceptibilities of conidia and hyphae of filamentous fungi. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41(12): 2760-2.        [ Links ]

24. Vivas J y Rojas OC. Curso teórico-práctico de sensibilidad a antifúngicos. XXVIII Jornadas Venezolanas de Microbiología ‘Dr. Rafael Bonfante Garrido’. 2002; 7-9 noviembre.  Barquisimeto.  Edo. Lara        [ Links ]

25. Gehrt A, Peter J, Pizzo P, and Walsh T. Effect of increasing inoculum sizes of pathogenic filamentous fungi on MICs of antifungal agents by broth microdilution method. J Clin Microbiol 1995; 33(5): 1302–7.        [ Links ]

26. Yoshida S, Kasuga S, Hayashi N, Ushirogushi T, Matsuura H, and Nakagawa N. Antifungal activity of ajoene derived from garlic. Appl Envirom Microbiol 1987; 53: 615-6.        [ Links ]

27. San-Blas G, Gil F, Mariño L, and Apitz-Castro R. Inhibition of growth of the dimorfic fungus Paracoccidioides brasiliensis by Ajoene. Antimicrob Agents Chemother 1989; 33: 1641-4.        [ Links ]

28. Sánchez-Mirt A, Gil F y Apitz-Castro R Efecto inhibitorio y alteraciones ultraestructurales producidas por ajoene sobre el crecimiento in vitro de los hongos dematiáceos: Cladosporium carrionii y Fonsecaea pedrosoi. Rev Iberoam Micol 1993; 10: 74-8.        [ Links ]

29. Sánchez-Mirt A, Gil F y Apitz-Castro R. Actividad in vitro e in vivo del ajoene sobre Coccidiodes inmitis. Rev Iberoam Micol 1994; 11: 99-104.        [ Links ]

30. Ledezma E, Apitz-Castro R, and Cardier J. Apoptotic and anti-adhesion effect of ajoene, a garlic derived compound, on the murine melanoma B16F10 cells: possible role of caspase-3 and the alpha(4)beta(1) integrin. Cancer Lett 2004; 206(1): 35-41.        [ Links ]