Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología
versión impresa ISSN 1315-2556
Rev. Soc. Ven. Microbiol. v.25 n.2 Caracas feb. 2005
Klebsiella pneumoniae y K. oxytoca aisladas de niños con diarrea:
adherencia y citotoxicidad en líneas celulares
Fanny Martínez*, Solalba Gómez, Peggy Rodriguez, José Páez, Gidalia Urbina, Bredy Ortiz
Escuela de Bioanálisis, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela
Resumen
La capacidad de adherencia y citotoxicidad de cepas de Klebsiella pneumoniae y Klebsiella oxytoca sobre líneas celulares intestinales HT-29 y CaCo-2, fue medida a partir de cepas aisladas de heces de niños de 0 a 5 años cuyas principales características son la pobreza y desnutrición, los cuales son factores importantes en problemas de salud publica en Venezuela. Cinco de las seis cepas estudiadas son adherentes y citotóxicas para ambas líneas celulares. Estos resultados confirman que las cepas de K. pneumoniae y K. oxytoca presentan dos mecanismos de enteropatogenicidad: uno de adherencia específico y otro de citotoxicidad en líneas celulares intestinales HT-29 y CaCo-2.
Palabras claves: Adherencia, Citotoxicidad, Diarrea Enteropatogenicidad, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Salud Pública
Klebsiella pneumoniae and K. oxytoca isolates from children diarrhea:
Adherence and cytotoxicity in cellular lines
Abstract
The capacity of adherence and citotoxicity of K. pneumoniae and K. oxytoca upon cell lines HT/29 and CaCo-2. was tested in diarreic stools samples from 0-5 years old children whose main characteristics were poverty and malnutrition, which represent two of the most important public health problems in Venezuela. From six strains stadied, five were adherent and citotoxic for both lines. These results confirm that the strains of K. pneumoniae and K. oxytoca showed two enteropathogenicity mechanisms: one of specific adherence and another of citotoxicity to the HT-29 and CaCo-2 cell lines.
Keywords: Enteropathogenicity, citotoxicy, diarrhea, public health, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca
Recibido: 24 de octubre de 2005; aceptado: 09 de diciembre de 2005
Introducción
En Venezuela las diarreas representan un grave problema de salud pública, en donde la población infantil menor de cinco años de bajos recursos socio económicos es la mas afectada, además es la primera enfermedad que se notifica y representa el 60% de las enfermedades que registra el Departamento de Vigilancia Epidemiológica de la Dirección Sectorial del Ministerio de Salud [1], al igual que en la mayoría de los países en desarrollo donde los niños presentan de tres a cinco veces más episodios de diarrea que en los países desarrollados, constituyendo una causa importante de morbilidad y mortalidad infantil. A partir de los años setenta se han incrementado los esfuerzos en investigar la etiología de las diarreas, gracias a los distintos proyectos de investigación que se han llevado a cabo. En los actuales momentos se pueden identificar los agentes causales en más del 80% de los casos, sin embargo estos avances no han logrado disminuir la incidencia de la enfermedad en nuestro país [1].
Además de los patógenos entéricos clásicos, (Salmonella, Shigella, Escherichia coli enteropatógenas y Campylobacter), otros microorganismos como las bacterias pertenecientes al género Klebsiella se encuentran asociadas con cuadros de diarreas infecciosas en niños menores de cinco años. Klebsiella pneumoniae y Klebsiella oxytoca son patógenos oportunistas responsables de infecciones en el tracto urinario (9%), bacteriemias nosocomiales (14%) y con relativa frecuencia en gastroenteritis [2,3]. En trabajos sobre la etiología de la diarrea aguda en Venezuela se ha encontrado un 11,6% de aislamientos de Klebsiella pneumoniae y Klebsiella oxytoca en casos de diarrea aguda en niños [4,5], por lo que se ha hecho necesario un estudio mas detallado de los mecanismos de patogenicidad asociados a las cepas del género Klebsiella aisladas de cuadros de diarrea [5,6,7,8,9]. Estudios previos han demostrado la presencia de enterotoxinas, así como la existencia de un patrón de adherencia específico a células Hep-2 y Vero [5,6,10]. El presente trabajo evalúa los mecanismos de adherencia y citotoxicidad de cepas de K. pneumoniae y K. oxytoca aisladas de casos de diarrea infantil en líneas celulares intestinales HT-29 y CaCo 2, lo cual sería un aporte mas en la definición del género como patógeno responsable de cuadros de diarreas en la población infantil. Sobre todo la de bajos recursos socio económicos de nuestro país [5,6,7,11,12].
Materiales y Métodos
Cepas bacterianas
Se utilizaron seis cepas del género Klebsiella, tres de la especie K. pneumoniae: Kpn 112, Kpn 579, Kpn 54-1 y tres de la especie K. oxytoca: Koxy 109, Koxy 40, Koxy 33; caracterizadas como adherentes y citotóxicas en cultivo celular Hep-2 y Vero [6]. Los aislamientos fueron obtenidos de cuadros de diarrea no inflamatoria, procesados en el Hospital Materno Infantil de Caricuao [6].
Líneas celulares
Para los ensayos de adherencia y citotoxicidad se utilizaron dos líneas celulares provenientes de adenocarcinoma de colon: CaCo-2 y HT-29.
Ensayo de adherencia a las células HT-29 y CaCo-2
Este ensayo se realizó según el método de Cravioto al cual se le hicieron ciertas modificaciones [13]. Ambas líneas celulares se mantuvieron como una monocapa a una concentración de 2x105 células/ml en D-Men alta glucosa con suero fetal bovino al 10%, repartidas en placas para cultivo celular con sus laminillas de 24 pozos cada una, a razón de 1 ml por cada pozo e incubadas a 37°C en atmósfera de CO2 por 48 horas.
Las cepas se sembraron en Caldo Todd mas D-manosa al 1%, a las 24 horas se centrifugaron a 2500 rpm por 10 minutos, se descartó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió con medio D-Men alta glucosa sin antibióticos mas suero fetal bovino al 10% ajustado hasta lograr una concentración de 108 bacterias/ml. De esta suspensión se agregó 1ml a cada pozo de la placa que contiene los cultivos celulares de CaCo-2 y HT29, previamente lavados con PBS [13]. Se permitió que ocurriera la interacción bacteria-célula (CaCo-2 y HT-29) a 37°C en atmósfera al 5% de CO2 por 1 y 6 horas, posteriormente se procedió a lavar cada pozo tres veces con PBS, las laminillas se fijaron en metanol y se colorearon con Giemsa (proporción colorante amortiguador 1/25) por 20 minutos; se observaron al microscopio de luz marca Olimpus y se fotografiaron con una cámara marca Nikkon. Para definir si una cepa es adherente o no, se utilizó el criterio descrito por Cravioto y col.[13] se contaron 100 células estableciéndose cuantas poseían bacterias adheridas, considerándose el ensayo positivo donde se observara una adherencia mayor o igual al 40% y negativo si la adherencia es menor del 10%.
Ensayo de citotoxicidad directa e indirecta
Para detectar la actividad citotóxica directa e indirecta se emplearon las mismas líneas celulares del ensayo anterior. Un día antes de realizar el ensayo se cultivaron las cepas de K. pnumoniae y K. oxytoca en 10 ml de medio Casminoácidos durante 24 horas; los cultivos se centrifugaron a 10.000 rpm por 30 minutos, el sobrenadante se filtró a través de millipore de 0.45 m corte. El día del ensayo se añadió 1 ml de cada uno de los filtrados obtenidos de las cepas a estudiar en los pozos de la placa de titulación. Las placas se incubaron a 37°C en 5% de CO2, examinándose durante dos días consecutivos con un microscopio invertido Zeiss 10X para observar efecto citopático; caracterizado por: redondeamiento celular, vacuolización del citoplasma, picnósis del núcleo y destrucción parcial a total de la monocapa. Al cabo de las 48 horas se detuvo el ensayo lavando los pozos con PBS, las laminillas se fijaron con metanol y se colorearon con Giemsa por 20 minutos. Una vez finalizado el proceso se observó en un microscopio de luz (Olimpus) y se fotografiaron (cámara Nikkon). Para definir si se produjo actividad citotóxica, se contaron 100 células, considerándose positiva el 50% o más de redondeamiento celular [14,15].
Resultados
Adherencia sobre líneas celulares HT29 y CaCo 2
La adherencia de seis cepas: Kpn 112, Kpn 579, Kpn 54-1, Koxy 109, Koxy 40-0 y Koxy 33 fue establecida sobre líneas celulares HT-29 y CaCo-2 a 1 y 6 horas de incubación (Tabla 1).
Los controles negativos utilizados en todos los ensayos fueron monocapas de ambas líneas celulares sin inocular.
Los patrones de adherencia se establecieron en base a la comparación de las imágenes de referencia observados en los controles positivos, (Figuras. 1a, 1b).
En el grupo de cepas ensayadas se observaron los siguientes patrones de adherencia: las cepas Kpn 54-1, Kpn 579 y Koxy 40-0, presentaron un patrón agregativo (Figura 2). La cepa Koxy 109 presentó un patrón difuso (Figura 3) y la cepa Koxy 33 presentó un patrón mixto (adherencia agregativa y adherencia difusa). Estos resultados fueron observados para ambas líneas celulares.
Citotoxicidad Directa: Efecto Picnótico
El efecto picnótico fue establecido en base a la comparación de las monocapas sin infectar, con los cambios morfológicos producidos por las cepas bacterianas probadas en las líneas celulares a 1 y 6 horas del ensayo (Tabla 2).
HT-29 | CACO-2 | |||||||
Cepa | Adherencia 1h 6h | Patron 1h 6h | Adherencia 1h 6h | Patron 1h 6h | ||||
Kpn 112 | + | + | * | * | + | + | * | * |
Kpn 579 | + | + | AA | AA | - | + | - | AA |
Kpn 54-1 | + | + | AA | AA | + | + | AA | AA |
Koxy 109 | + | + | AD | AD | + | + | AD | AD |
Koxy 400 | + | + | AA | AD | - | - | - | - |
Koxy 33 | - | + | - | AA/AD | + | + | AA/AD | AA/AD |
AA: Adherencia Agregativa
AD: Adherencia Difusa
Figura 3.Cepa Ko 109. Patrón de adherencia difusa células CaCo2.Coloración de Giemsa, aumento 100 x.
Tabla 2 Ensayo de citotoxicidad directa: Efecto picnótico sobre
HT-29 | CACO-2 | |||
CEPA | 1 h | 6 h | 1 h | 6 h |
Kpn 112 | + | + | + | + |
Kpn 579 | + | + | - | + |
Kpn 54-1 | + | + | + | + |
Koxy 109 | + | + | - | - |
Koxy 40-0 | + | + | - | - |
Koxy 33 | - | + | + | + |
Como se puede observar en la tabla 2 la mayoría de las cepas de K. pneumoniae y K. oxytoca empleadas en el ensayo inducen efecto picnótico en ambas líneas celulares, a 1 hora del ensayo y todas lo inducen a las 6 horas, a excepción de la cepa Koxy 40-0 que no presenta dicho efecto sobre la monocapa de células CaCo-2.
Citotoxicidad indirecta: Actividad citotóxica de los filtrados de cultivo de cepas de K. pneumoniae y K. oxytoca sobre líneas celulares HT-29 y CaCo-2 a las 48 horas
La actividad citotóxica se midió observando los cambios morfológicos en las células de las monocapas utilizadas en el ensayo.
Como control positivo se utilizó una cepa de Shigella dysenteriae tipo I para la observación de dichos cambios morfológicos (Figura 4).
De las cepas estudiadas pudimos observar que: la cepa Kpn 112 y Kpn 579 su actividad citotóxica a las 48 horas de incubación se ve reflejada con un 80% de redondeamiento y desprendimiento de la monocapa para ambas líneas celulares. En la cepa Kpn 54-1 se observó: destrucción total de la monocapa con un 100% de redondeamiento para ambas líneas celulares a las 48 horas de incubación. En la cepa Koxy 109 se visualizó un 90% de redondeamiento celular y vacuolización del citoplasma en células HT-29, mientras que para las células CaCo-2 se observó destrucción total de la monocapa con un 100% de vacuolización.
Con respecto a la cepa Koxy 40-0 pudimos observar un 80-90% de redondeamiento celular con destrucción parcial de la monocapa de HT-29, mientras que en la monocapa de células CaCo-2 no hubo destrucción pero si un 50% de redondeamiento celular.
Discusión
Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que cepas de K. pneumoniae y K. oxytoca presentan dos mecanismos de enteropatogenicidad: uno de adherencia específico y otro de citotoxicidad directa e indirecta sobre líneas celulares intestinales HT-29 y CaCo-2. En cultivo de células tisulares se ha ensayado adherencia y citotoxicidad de patógenos entéricos como: E. coli, Salmonella y Shigella entre otros, para establecer los mecanismos por los cuales ellos son capaces de adherirse y producir citotoxicidad [11,13,15,16,17,18].
En el ensayo de adherencia realizado quedó demostrado que el patrón de adherencia establecido para las cepas estudiadas en las dos líneas utilizadas es independiente del pili tipo I [19,20]. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Sansonetti y col. [17] quien describió para E. coli tres patrones de adherencia a las células Hep-2 (agregativo, localizado y difuso) y con los de Páez y col [6] quienes describen un patrón de adherencia agregativo y difuso para cepas de K. pneumoniae y K. oxytoca, aisladas de diarrea infantil. Por otro lado pudimos observar que a las 6 horas de incubación todas las cepas indujeron cambios morfológicos en ambas líneas celulares, a excepción de la cepa Koxy 40-0, la cual produjo solamente alteraciones en la monocapa de HT-29. Estos resultados nos llevan a pensar que la interacción bacteria-célula produce un efecto citotóxico directo; como lo observado en cepas de E. coli que presentan patrón de adherencia difuso y producen efecto citotóxico sobre células Hep-2 [21,22,23].
Los resultados obtenidos de los ensayos de citotoxicidad directa e indirecta en las líneas celulares utilizadas confirman lo reportado por Straus [24] quien reporta actividad citotóxica en seis cepas de K. pneumoniae productoras de un complejo toxico extracelular [24], y la actividad citotóxica del sobrenadante del cultivo de tres cepas de K. oxytoca sobre células Hep-2, CHO y Hela reportadas por Minami y col. [25]. Es importante señalar que los resultados obtenidos del efecto picnótico caracterizado por: retracción del borde celular, vacuolización del citoplasma, picnósis del núcleo y desintegración celular demuestran que los patrones de adherencia observados para cada una de las cepas de nuestro estudio no está relacionado de forma directa al efecto citotóxico que se produce; hecho que se relaciona con lo obtenido por Páez y col [6].
De nuestra experiencia podemos concluir que existen diferencias entre los mecanismos de adherencia y citotoxicidad de alguna cepas de K. pneumoniae y K. oxytoca aisladas en casos de diarrea infantil sobre líneas celulares intestinales HT-29 y CaCo-2, estableciéndose que algunas de las cepas fueron adherentes, citotóxicas; adherentes y citotóxicas en ambas y/o en una de las líneas celulares analizadas.
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