Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología
versión impresa ISSN 1315-2556
Rev. Soc. Ven. Microbiol. vol.32 no.1 Caracas jun. 2012
Diversidad de serotipos de Salmonella en camarones de cultivo crudos congelados (Litopeneaus vannamei) de Venezuela
Liliana Gómez-Gamboa a *, José Bermúdez-González b, Zoraida Medina c, Marisela López d, Jessica Navarro c, Ever Morales b
a Unidad Curricular Bacteriología y Virología. Facultad de Medicina. Universidad del Zulia. Venezuela.
b Laboratorio de Bioquímica y Microorganismos Fotosintéticos;
c Laboratorio de Microbiología. Facultad Experimental de Ciencias. Universidad del Zulia. Venezuela.
d Centro de Referencia Bacteriológica. Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo. Venezuela.
* Correspondencia: E-mail: liliana_gomezgamboa@yahoo.com
Resumen
La evaluación de la calidad sanitaria de los camarones procesados y destinados a la exportación requiere determinaciones permanentes que garanticen la inocuidad del producto. No obstante, la información sobre la diversidad y ocurrencia de Salmonella en camarones es muy escasa en Venezuela. Se determinó la prevalencia y diversidad de cepas de Salmonella en 1.022 muestras de camarones crudos congelados procedentes de cultivo para exportación y procesados en una planta del estado Zulia. La recolección, manejo y transporte de las muestras para los análisis bacteriológicos se realizaron de acuerdo al manual de Administración de Drogas y Alimentos norteamericana y la norma venezolana COVENIN. La serotipificación de Salmonella se realizó según la fórmula antigénica descrita por la Organización Mundial de la Salud. Salmonella enterica subsp. enterica estuvo presente en 20 muestras, obteniendo una prevalencia de 2%. Adicionalmente, se observó una amplia diversidad de serotipos de Salmonella, siendo los más frecuentes Tennessee (20%), Typhimurium (15%), Caracas (10%) y Kentucky (10%). La presencia y amplia diversidad de serotipos de Salmonella pudieran estar relacionadas con las condiciones de producción del camarón. En cambio, la baja prevalencia pudiera deberse a las condiciones higiénicas de la planta procesadora y al efecto de las bajas temperaturas.
Palabras clave: camarones, Salmonella, serotipos.
Diversity of Salmonella serotypes in raw frozen culture shrimps (Litopeneaus vannamei) from Venezuela
Abstract
The evaluation of the sanitary quality of processed shrimps destined for exportation requires permanent determinations which guarantee the safety of the product. Nevertheless, the information regarding Salmonella diversity and occurrence in shrimps is very scarce in Venezuela. The prevalence and diversity of Salmonella strains was determined in 1,022 samples of raw frozen shrimps destined for exportation and processed in a facility located at Zulia State. The collection, management and transportation of samples for the bacteriological analyses were done according to a manual published by the North American Food and Drug Administration and the Venezuelan regulations COVENIN. Salmonella serotyping was done according to the antigenic formula described by the World Health Organization. Salmonella enterica subsp. enterica was found in 20 samples, establishing a 2 % prevalence. Additionally, a wide variety of Salmonella serotypes was found, the most frequent being Tennessee (20%), Typhimurium (15%), Caracas (10%), and Kentucky (10%). The presence and wide variety of Salmonella serotypes could be related to the production conditions of shrimps. On the other hand, the low prevalence could be due to the hygienic conditions of the processing plants and the effect of low temperatures.
Keywords: shrimps, Salmonella, serotypes.
Recibido 24 de septiembre de 2011; aceptado 5 de marzo de 2012
Introducción
La acuicultura ha sido uno de los sistemas de producción de alimentos de más rápido crecimiento en las últimas tres décadas. Esta actividad no solamente se ha expandido, sino que también se ha diversificado, intensificado y avanzado tecnológicamente, de tal forma que su contribución a la producción de alimentos, generación de divisas, seguridad alimentaria y con ello la inocuidad alimentaria, se ha incrementado de manera significativa [1].
Los camarones constituyen un producto marino importante en el comercio pesquero internacional y la economía de muchos países se ve favorecida por la entrada de divisas derivada de su cultivo [1,2]. Una proporción sustancial de este producto proviene de países en vías de desarrollo, por lo que existe la posibilidad de diseminación de patógenos con un riesgo asociado de enfermedades transmitidas por alimentos [2]. Por esta razón, es importante aplicar las medidas necesarias para mantener un comercio nacional e internacional seguro en términos de calidad e inocuidad alimentaria [1].
Salmonella es un importante patógeno transmitido por alimentos y agente causal de un gran número de infecciones entéricas en humanos. Actualmente, han sido identificadas a nivel mundial 2.541 serovariedades que ocasionan más brotes de enfermedades transmitidas por alimentos que cualquier otra bacteria, con incidencia de salmonelosis en todo el mundo relacionada con transmisión a través de productos marinos [3,4]. Las principales especies bacterianas que ocasionan devolución de lotes de camarones en Estados Unidos son Salmonella (35,6%) y Listeria (4,1%) [2]. Asimismo, en países de la Unión Europea, Salmonella fue la segunda causa de rechazo de camarones por contaminación microbiana [5]. Aunque el impacto de esta bacteria sobre el comercio de camarones no ha sido cuantificado, se cree que sea sustancial (detención, rechazo y devolución). De estos eventos se pueden producir pérdidas financieras directas e indirectas, ocasionadas por re-inspecciones, análisis de muestras, revisión de registros, expiración de la vida útil y el costo de la manipulación de los productos [2].
Por todas sus implicaciones en la salud pública, Salmonella se encuentra entre los principales microorganismos patógenos indicadores de inocuidad en productos marinos de exportación [6]. De allí que el presente estudio fue desarrollado para determinar la prevalencia y diversidad de serotipos de Salmonella aisladas de camarones de cultivo crudos congelados empacados para exportación en el estado Zulia, Venezuela.
Materiales y métodos
Recolección de muestras: Las muestras de camarón crudo congelado (-18 °C) entero y descabezado, destinado a exportación, fueron recolectadas en forma aleatoria en una planta procesadora y empacadora localizada en San Francisco, estado Zulia, Venezuela, durante el período comprendido entre diciembre de 2008 y diciembre de 2009. Estos dos tipos de muestras corresponden a las principales presentaciones de producto terminado empacados para exportación. La planta procesadora presentaba certificado para exportación, una capacidad de producción entre 2 y 20 toneladas por semana, una denominación del producto para su presentación comercial como camarón crudo entero descabezado y congelado y un proceso sujeto a un control sanitario regular. El camarón procesado en la planta fue cultivado en una finca ubicada a orillas del Lago de Maracaibo, Venezuela.
Los procedimientos para la recolección, manejo y transporte de las muestras de camarones para los análisis microbiológicos, se realizaron de acuerdo con lo establecido en el Manual de Bacteriología Analítica de la Administración de Drogas y Alimentos norteamericana (FDA por sus siglas en inglés) y en la norma venezolana COVENIN 1126 [7,8].
Se recolectaron 1.022 muestras de camarón crudo congelado entero y descabezado empacado para exportación en estuches de 1,8 kg (producto terminado), de las cuales 733 correspondieron a muestras de producto entero y 289 a camarón descabezado. Cada muestra analizada correspondió a un lote diferente.
Adicionalmente, se procesaron 240 muestras de agua provenientes de la planta procesadora y 21 procedentes de la finca camaronera con el fin de determinar la probable fuente de contaminación (agua de la planta procesadora o agua del Lago de Maracaibo de la finca camaronera). La recolección de las muestras de agua se realizó según lo establecido en los métodos estandarizados para el análisis de aguas y aguas residuales APHA [9]. Las muestras de agua procedentes de la planta procesadora de camarones fueron: tanque principal (192 muestras), hielo (12 muestras) y diferentes puntos de muestreo durante el procesamiento del producto alimenticio (36 muestras). Los sitios de recolección de las muestras de agua en la finca de cultivo de camarones fueron: playa (3 muestras), canal reservorio (11 muestras), piscina (1 muestra) y canal de drenaje (6 muestras).
Técnicas de cultivo bacteriológico: La determinación de coliformes totales (CT), coliformes fecales (CF), Escherichia coli, bacterias aerobias mesófilas (AM), Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes en muestras de camarones se realizó según lo establecido en el manual de análisis bacteriológico de la FDA [7].
Para el aislamiento e identificación de Salmonella en camarones se realizó un homogeneizado de 25 g de la muestra en 225 mL de caldo lactosado, dejándolo a temperatura ambiente durante 60 min. Luego se mezcló mediante agitación manual y se ajustó el pH a 6,8±0,2; posteriormente se incubó durante 24±2 h a 35 °C. Transcurrido ese tiempo, se agitó suavemente la mezcla de manera manual y se inoculó 1 mL de ella en cada uno de tres tubos conteniendo 10 mL de los caldos de enriquecimiento selenito cisteína (SC), tetrationato (CTT) y Rappaport (CR). Estos medios de enriquecimiento fueron incubados durante 24±2 h a 35 °C. Transcurrido el tiempo de incubación para el enriquecimiento selectivo, se mezclaron manualmente los tubos, luego se tomó una asada de cada uno de ellos y se inocularon por la técnica de rayado sobre los agares en placa: bismuto sulfito (BS), xilosa dexosicolato lisina (XDL) y Salmonella-Shigella (SS). Las placas fueron incubadas a 35 °C por 24 h. Las colonias características de Salmonella en estos medios fueron seleccionadas para su identificación posterior mediante diferentes pruebas bioquímicas y técnicas serológicas descritas en el manual de la FDA y la norma venezolana COVENIN 1291 [7,10]. La serotipificación se realizó siguiendo el Manual de Procedimientos para la Caracterización de Salmonella [11].
El análisis microbiológico de las muestras de agua se realizó según los Métodos Estándares para el Análisis de Aguas y Agua Residual [9], siguiendo la metodología del Número Más Probable (NMP) para la determinación de CT, CF, E. coli y Pseudomonas. El contaje de AM se realizó por el método de difusión en placa y la determinación de Salmonella y Listeria se realizó mediante enriquecimiento, aislamiento selectivo, reacciones bioquímicas descritas en el manual de la FDA y la norma venezolana COVENIN 1291 [7,10].
Análisis estadístico: Se aplicó una prueba de hipótesis según t-student, donde se prueba la hipótesis nula de igualdad de medias entre camarón entero y cola, contra la alternativa de que son diferentes.
Resultados y discusión
Camarones de cultivo crudos congelados (entero y descabezado): En cuanto a los parámetros CT, CF, E. coli, AM, S. aureus y L. monocytogenes, las muestras de camarones de cultivo crudos congelados entero y descabezado cumplieron con los requisitos microbiológicos exigidos por la norma venezolana COVENIN [12], la Comisión Internacional de Especificaciones Microbiológicas para Alimentos (ICMSF, por sus siglas en inglés) [13] y la Unión Europea [14] (Tabla 1). Aún cuando, los valores de CT y S. aureus observados en las muestras de camarón descabezado fueron significativamente mayores (p<0,05) que los observados en el camarón entero. Mientras que, no se obtuvieron diferencias significativas (p>0,05) entre los valores obtenidos para CF, E. coli y AM en camarones enteros y descabezados.
Tabla 1. Promedio de microorganismos indicadores de contaminación detectados en muestras de camarones de cultivo crudos congelados de Venezuela.
En el presente estudio se procesaron un total de 1.022 muestras de camarones (enteros y descabezados), de las cuales el 2% (20/1022) resultaron positivas para Salmonella enterica subsp. enterica. La frecuencia de Salmonella en el producto terminado entero fue de 2,5% (18/733) y en el producto terminado descabezado fue de 0,7% (2/289), no encontrando diferencias significativas (p>0,05) entre camarones enteros y descabezados.
Actualmente no existe un acuerdo internacional sobre niveles aceptables de Salmonella en alimentos, incluyendo camarones. En Australia, Nueva Zelanda, la Comunidad Económica Europea, Hong Kong y los Estados Unidos, se ha establecido como requerimiento regulatorio la ausencia de Salmonella en camarones crudos o cocidos [2]. La ICMSF [13] y la norma venezolana COVENIN [12] también han sugerido que Salmonella no debe ser detectada en 25 g de camarón crudo o cocido. Por lo tanto, los resultados obtenidos en el presente estudio se encuentran fuera de los requisitos microbiológicos establecidos a nivel nacional e internacional. Sin embargo, según algunos investigadores, este requerimiento de tolerancia cero de Salmonella en camarones frescos o crudos puede ser muy estricto, ya que estos productos recibirán lavado y cocción antes de su consumo [15].
Agua de la planta procesadora y de la finca de cultivo: Los parámetros microbiológicos analizados en las muestras de agua recolectadas en la planta procesadora de camarones se encontraron dentro de los límites microbiológicos establecidos por el MSAS, publicados en Gaceta Oficial 36.395 de fecha 11/02/98, Decreto SG-018-98, Normas Sanitarias de Calidad de Agua Potable.[16]
Los resultados del análisis microbiológico de muestras de agua de la finca de cultivo de camarones se presentan en la tabla 2.
Tabla 2. Promedio de microorganismos indicadores de contaminación detectados en muestras de agua de la finca de cultivo de camarones.
Prevalencia de Salmonella en camarones de cultivo crudos congelados y en agua de la finca de cultivo: La baja prevalencia de Salmonella en camarones de cultivo crudos congelados obtenida en la presente investigación coincide con diversos estudios, donde el porcentaje de muestras positivas para Salmonella fue bajo (0,1% y 5%) o nulo [17-19]. Por el contrario, la prevalencia de Salmonella mostrada, difiere de la investigación realizada en 2005 por Phan y col. [20], donde Salmonella estuvo presente en 24,5% de las muestras analizadas. Asimismo, en investigaciones realizadas en India se comprobó una positividad de Salmonella en muestras de camarones del 37,5% y 59% [21,22].
La prevalencia de Salmonella en muestras de camarones posiblemente esté íntimamente relacionada con las condiciones de producción del camarón en finca [6], dentro de las cuales juegan un papel importante la calidad del agua, del alimento y fertilizantes, los excrementos de aves silvestres y humanos y las escorrentías de agua durante las temporadas de lluvia.
Salmonella ha sido aislada del agua de las lagunas de cultivo del camarón [23-27], del sedimento de las lagunas de cultivo del camarón [21-31], del alimento [21,23,27], de los fertilizantes utilizados para la fertilización de las lagunas de camarones [28,29] y de los probióticos utilizados para promover la salud de los camarones [25]. Existen varias investigaciones sobre presencia de Salmonella en el sedimento y agua de las piscinas de cultivo, por lo que se ha concluido que Salmonella forma parte de la microflora natural del ambiente de cultivo del camarón [5,23].
El aislamiento frecuente y consistente de Salmonella en sedimento y muestras de agua de fincas de cultivo puede ser debido a que este patógeno sobrevive mejor en estos ambientes [21]. Su tasa de sobrevivencia se incrementa rápidamente debido a la alta carga orgánica presente como resultado de la eutroficación de las aguas del Lago de Maracaibo aunado a los nutrientes liberados por los alimentos concentrados utilizados en el cultivo de camarones. Por lo tanto, según varias investigaciones, las principales fuentes que contribuyen a la prevalencia de Salmonella en camarones de cultivo son el agua de las piscinas de cultivo, el sedimento y el alimento utilizado durante la fase de cultivo [21,23,24,28].
En la presente investigación, la prevalencia de Salmonella en camarones de cultivo crudos congelados posiblemente esté asociada con el ambiente de cultivo del camarón, debido a que Salmonella fue encontrada en las aguas del canal reservorio y canal de drenaje de la finca de cultivo de camarones. Algunos investigadores consideran que Salmonella no forma parte de la flora natural del ambiente de cultivo del camarón, ni está presente en las lagunas de crecimiento de los mismos, debido a que reportan ausencia de Salmonella en todas las muestras de agua, sedimento y camarones recolectadas de áreas productoras de camarones [25,32]. En cambio, Dalsgaard A. argumenta que estos estudios no pudieron representar el escenario verdadero debido a que el número de muestras recolectadas fue bajo y no se desarrollaron repeticiones de los ensayos [33].
La baja prevalencia de Salmonella en camarones posiblemente esté íntimamente relacionada con las condiciones higiénicas de la planta procesadora [6]. El análisis de las aguas empleadas durante el procesamiento del camarón posiblemente explique la baja prevalencia de Salmonella obtenida en este estudio. Igualmente, los resultados obtenidos revelaron que la planta procesadora posiblemente ejerce un buen control del proceso con el fin de mantener la calidad bacteriológica de su producto.
Es importante resaltar que la mayoría de los estudios sobre prevalencia de Salmonella en productos marinos del trópico utilizaron métodos de cultivo convencionales. Durante los últimos años se ha incrementado la utilización de técnicas moleculares para la detección de patógenos en alimentos y recientemente ha sido documentada la importancia de la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la detección de todas las especies de Salmonella. El estudio realizado por Shabarinath et al sugiere que la prevalencia de Salmonella en mariscos puede ser mucho mayor utilizando PCR que la reportada empleando técnicas convencionales de aislamiento [22].
Diversidad de serotipos de Salmonella enterica subespecie enterica en camarones de cultivo crudos congelados: En la presente investigación se detectó una amplia variedad de serotipos de Salmonella enterica subespecie enterica en camarones de cultivo crudos congelados para exportación, cultivados en aguas del Lago de Maracaibo. Se identificaron 13 serotipos diferentes en 20 aislados de Salmonella, lo que indica una alta tasa de contaminación por esta bacteria. Los serotipos más frecuentemente aislados fueron Tennessee (20%), Typhimurium (15%), Caracas (10%) y Kentucky (10%) (Tabla 3).
Tabla 3. Serotipos de Salmonella enterica subsp. enterica en camarones de cultivo crudos congelados de Venezuela.
Estos resultados coinciden con los obtenidos por Wan Norhana et al [2], donde los serotipos de Salmonella más frecuentemente aislados de camarones y productos camaroneros fueron Weltevreden y Typhimurium. En otro estudio realizado en Vietnam [20], de 261 aislados de Salmonella de muestras de carnes y camarones, se identificaron 24 serovariedades diferentes, siendo principalmente aislados los serotipos Weltevreden, Tennessee y Dessau.
Los serotipos de Salmonella responsables de la mayoría de las infecciones humanas en el Reino Unido y los Estados Unidos son Enteritidis y Typhimurium [34]. En Venezuela, los principales serotipos aislados en coprocultivos humanos procesados en el Centro de Referencia Bacteriológica del Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo, durante los años 2005-2009 fueron Saint Paul (12,4%), Javiana (9,8%) y Typhimurium (8,8%) [datos no publicados]. Otros estudios reportaron como serotipo más común Typhimurium (14%), seguido de Saint-Paul (11%) y Javiana (9%) de acuerdo con lo reportado por Navarro J. en 2011 [datos no publicados] en los pacientes pediátricos del Hospital Universitario de Maracaibo. En otra investigación realizada en 2012 por López, M. [datos no publicados], los serotipos más frecuentemente aislados en coprocultivos de pacientes provenientes de diferentes instituciones de salud ubicados en la zona norte de la ciudad de Maracaibo fueron Saint-Paul (20,7%), seguido de Orion (13,8%) y Typhimurium, Tennessee y Javiana con un 6,9% para cada uno. La mayoría de estos serotipos aislados en coprocultivos de pacientes, aunque en porcentajes bajos, coinciden con aquellos aislados en los camarones en la presente investigación.
Tanto las excretas humanas como de animales, incluyendo las aves, son fuentes de Salmonella y muchas rutas potenciales son utilizadas para la transmisión de este patógeno entérico. La habilidad de Salmonella de transmitirse por cualquiera de estas rutas depende enormemente de su resistencia a los factores ambientales, que controlan su supervivencia y su capacidad para ser transportada por agua; la cual puede depender de las especies y de las fuentes de contaminación. En este sentido, se ha demostrado que las cargas bacterianas anuales de este patógeno en ríos y áreas costeras pueden ser muy importantes [35].
Wan Norhana et al [36] demostraron que cuando Salmonella se encuentra asociada a la superficie de camarones muestra significativamente mayor resistencia al calor (50°, 60° y 70 °C), hipoclorito (100 ppm) y ácidos (láctico, hidroclórico y acético pH 4.0) que las contrapartes de vida libre. Por lo tanto, la asociación de Salmonella a la superficie de camarones incrementa su resistencia al calor, cloro y ácidos. La unión y subsecuente colonización de la superficie de los camarones por patógenos pueden reducir la eficacia de los métodos utilizados para su control, por lo que se requieren estrategias para reducir la unión de estos patógenos a los camarones y resguardar la seguridad de este producto alimenticio.
La supervivencia de Salmonella en camarones durante congelación fue investigada también por Noda et al [37], observando que después de un almacenamiento a -10 °C, -20 °C y -30 °C durante 12 semanas, la población de Salmonella disminuyó en todos los casos y la disminución fue menor a la temperatura más baja. Por lo tanto, la baja prevalencia de Salmonella obtenida en este estudio posiblemente también se deba a la disminución de esta bacteria como resultado de la congelación. Sin embargo, algunos autores han demostrado que algunos serotipos de Salmonella, (como el serotipo Typhimurium) pueden tener la habilidad de sobrevivir a temperaturas de refrigeración y congelación (-20 °C y -40 °C) [38-40].
En Venezuela, la mayoría del camarón producido en acuicultura es exportado y la detección de Salmonella en países importadores puede ocasionar severas pérdidas económicas para la industria camaronera venezolana. Aunque las regulaciones varían, la mayoría de los países importadores no aceptan Salmonella en camarones crudos congelados (COVENIN, ICMSF y Comunidad Europea).
La presencia y diversidad de serotipos de Salmonella en camarones crudos congelados cultivados en el estado Zulia, Venezuela, posiblemente pudieran producir infecciones transmitidas por alimentos. El mejoramiento de la calidad microbiológica de los productos marinos de exportación es un hecho importante a nivel mundial y la comunicación de contaminación por patógenos debería proveer información con el objetivo de incrementar la seguridad alimentaria.
Conclusiones
La prevalencia de Salmonella enterica subespecie enterica en camarones de cultivo crudos congelados (enteros y descabezados) de Venezuela fue baja (2%), posiblemente debido a las condiciones higiénicas de la empresa procesadora del camarón y la disminución de esta bacteria debido a la congelación. La presencia de Salmonella enterica subespecie enterica obtenida en el presente estudio estuvo íntimamente relacionada con las condiciones de producción de esta especie en aguas del Lago de Maracaibo, Venezuela.
Agradecimientos
Los autores expresan su agradecimiento al Centro de Referencia Bacteriológica del Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo por el apoyo y cooperación recibida en la serotipificación de las cepas de Salmonella.
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