Actividad biológica de extractos de tres plantas sobre bacterias patógenas para el humano

Zaida Carvajal Tesorero^a,*, Liliana Ramírez Zambrano^a, Marly Ducurú^b, Valery Gómez^b, Gustavo Cabrera^b, Jeannette Méndez^b, Morella Rodríguez Ortega^a,b

^aServicio Autónomo Instituto de Biomedicina. Ministerio del Poder Popular para la Salud. Caracas, Venezuela.

^bEscuela de Química, Facultad de Ciencias. Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela.

* Correspondencia: E-mail: zaidajosefinacarvajal@gmail.com

Resumen: El objetivo de esta investigación fue determinar la actividad biológica de extractos de tres plantas sobre bacterias patógenas para el humano. Se determinó la citotoxicidad de extractos y fracciones de Parinari sprucei, Couepia paraensis y Lantana camara L. y se evaluó su actividad antibacteriana mediante el ensayo colorimétrico del 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,4-difenilbromuro de tetrazolio (MTT), utilizando sólo concentraciones inocuas en todos los ensayos realizados. La CMI se determinó con el ensayo de micro dilución MTT y se evaluó la actividad de los posibles agentes antimicrobianos por el método de difusión en agar de Kirby-Bauer. La CMI de los extractos metanólico de C. paraensis y diclorometano/etanol de P. sprucei sobre Staphylococcus aureus fue 25 µg/mL, mientras que la CMI con el extracto etanólico de P. sprucei fue 50 µg/mL. La CMI de la fracción 19 de L. camara L. sobre Acinetobacter haemolyticus y S. aureus fue 50 µg/mL. Los halos de inhibición obtenidos con los extractos metanólico de C. paraensis, y diclorometano/etanol y etanólico de P. sprucei sobre S. aureus fueron de 8, 9 y 7 mm, respectivamente. Los extractos de la familia Verbenaceae no presentaron actividad antibacteriana, mientras que los de la familia Chrysobalanaceae inhibieron la replicación de bacterias grampositivas.

Palabras clave: extractos, citotoxicidad, actividad antibacteriana, Parinari sprucei, Couepia paraensis, Lantana camara L.

Biological activity of extracts from three plants over bacteria pathogenic for human beings

Abstract: The citotoxicity of extracts and fractions obtained from three plants was determined, and their antibacterial activity was evaluated through a colorimetric assay with tetrazolium 3-(4,5-dimethilthiazol-2yl)-2,4-diphenilbromide (MTT)), using only innocuous concentrations in all the assays carried out. The MIC was determined by the MTT micro dilution assay, and the activity of the possible antimicrobial agents by the Kirby-Bauer agar diffusion test. The MIC of a methanol extract from Couepia paraensis, and a dichloromethanol/ethanol from Parinari sprucei over S. aureus was 25 µg/mL, while the MIC with the ethanol extract from P. sprucei was 50 µg/mL. The MIC of fraction 19 of Lantana camara L. over A. haemolyticus and S. aureus was 50 µg/mL. The inhibition halos obtained with the C. paraensis methanol extracts, and the P. sprucei over S. aureus dichloromethanol/methanol and ethanol extract, were 8, 9 and 7 mm respectively. The Verbenaceae family extracts did not present any antibacterial activity, while those of the Chrysobalanaceae family inhibited replication of gram positive bacteria.

Keywords: extracts, cytotoxicity, antibacterial activity, Parinari sprucei, Couepia paraensis, Lantana camara L.

Recibido 3 de febrero de 2012; aceptado 15 de agosto de 2012

Introducción

Las propiedades terapéuticas de algunas plantas han sido ampliamente estudiadas, particularmente las de especies pertenecientes a las familias Chrysobalanaceae y Verbenaceae. La familia Chrysobalanaceae está constituida por 17 géneros, de ellos el género Parinari y su especie P. sprucei, ha sido encontrada en la selva amazónica venezolana. Estudios fitoquímicos de las hojas de P. sprucei demuestran presencia de diterpenos tetracíclicos con actividad antibacteriana y anticancerígena [1-4]. Couepia paraensis, es otro representante de esta familia y está distribuida en Sur América [5,6].

Verbeneaceae es otra familia de plantas presente en Venezuela, formada por 51 géneros, entre los que se encuentra el género Lantana con 160 especies. Destaca Lantana camara L., conocida como cariaquito morado en Venezuela, cuyos estudios han reportado actividad antimalárica [7]. De las hojas de esta especie se han aislado diferentes triterpenos, flavonoides, alcaloides y glucósidos, que poseen diversas actividades biológicas, incluyendo efectos antibacterianos, antitumorales y antihipertensivos [8]; la raíz se ha utilizado para el tratamiento de malaria, reumatismo y lesiones en piel [9-13]_. La lantamina, alcaloide obtenido de la corteza de las ramas y de las raíces de L. camara L., ha mostrado actividad antipirética y antiespasmódica, comparable con la quinina [14].

Staphylococcus aureus, es una bacteria grampositiva coagulasa positiva, importante agente causal de lesiones cutáneas. Staphylococcus lugdunensis es coagulasa negativo, e inicialmente se ha descrito como productor de endocarditis, pero en los últimos años, su aislamiento ha sido cada vez más frecuente y está asociado a otras lesiones en las que se comporta como un patógeno potencialmente agresivo [15]. Escherichia coli, es la especie bacteriana gramnegativa más comúnmente aislada como agente infeccioso en heridas [16]_. Por otra parte, existe un amplio espectro de infecciones nosocomiales causadas por Acinetobacter spp., un cocobacilo no fermentador.

Los mecanismos de resistencia a los antibióticos que presentan las bacterias se han incrementando; esto plantea el estudio de nuevos compuestos que ayuden al tratamiento de las infecciones producidas por estos microorganismos. El objetivo de esta investigación fue determinar la actividad citotóxica y evaluar la actividad antibacteriana de extractos de P. sprucei, C. paraensis y L. camara L., mediante los métodos de concentración mínima inhibitoria (CMI) y Kirby-Bauer [17], sobre S. aureus, S. lugdunensis, E. coli y A. haemolyticus, aislados de lesiones cutáneas.

Materiales y métodos

Material biológico: Fibroblastos aislados de riñón de mono verde africano (Células Vero) fueron adquiridas en el Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”, Ministerio del Poder Popular para la Salud (MPPS).

Los aislados clínicos de las bacterias S. aureus (10-07), S. lugdunensis (44-07), A. haemolyticus (77-07) y E. coli (18-07) fueron suministrados por el Laboratorio de Microbiología del Servicio Autónomo Instituto de Biomedicina.

Los extractos y fracciones de las plantas utilizadas fueron facilitados por el Laboratorio de Productos Naturales de la Escuela de Química de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela y provienen del macerado de las hojas y las ramas de cada una de las plantas.

Los extractos de P. sprucei fueron obtenidos después de tratar el material vegetal con diclorometano/etanol y posterior extracción con etanol. Los extractos de C. paraensis y de L. camara L. se obtuvieron mediante el tratamiento con diclorometano/metanol, y posterior extracción con metanol. Para la obtención de las fracciones 14 y 19 de L. camara L. se partió de un extracto del material vegetal tratado con diclorometano/etanol, el cual se disolvió en una solución metanol:agua (1:1). La fracción soluble de esta mezcla se extrajo con tolueno y acetato de etilo. La fracción soluble de tolueno se purificó mediante cromatografía de columna, utilizando sílica gel como fase estacionaria y una mezcla de diclorometano/metanol (19:1) como eluyente. Se recogieron 30 fracciones. La fracción 14 resultó rica en triterpenos. La fracción soluble en acetato de etilo fue purificada por cromatografía de columna utilizando RP-18 como fase estacionaria y agua/metanol (1:1) como eluyente. Se obtuvieron 26 fracciones. La fracción 19 resultó rica en flavonoides.

Medios de cultivo: Para el crecimiento y mantenimiento de las células Vero se utilizaron Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM) 1X suplementado con 1% de glutamina (200 mM), 0,1% de gentamicina y 8% de suero fetal bovino y MEM 1X suplementado con 1% de glutamina (200 mM), 0,1% de gentamicina y 1% de suero fetal bovino, respectivamente.

Para la preparación de los extractos y fracciones para la evaluación biológica se pesó 1 mg de cada uno de los extractos y fracciones, se disolvieron con 100 µL de dimetil sulfóxido (DMSO) y se llevaron a un volumen de 1 mL con medio MEM 1X.

Los aislamientos bacterianos se sembraron en placas de agar sangre y se incubaron en aerobiosis entre 18 y 24 horas en estufa a 37 ºC, para obtener un cultivo fresco.

Ensayos de citotoxicidad: En placas de fondo plano de 96 pozos con 100 µL/pozo de medio de crecimiento se inocularon 100 µL/pozo de una suspensión de células Vero a una concentración de 2x10⁵ células/mL por cuadruplicado. Después de 24 horas de incubación a 37 ºC, con una atmósfera de 5% de CO₂, se realizó el ensayo colorimétrico del 3-(4,5-dimetiltiazol 2yl)-2,4-difenilbromuro de tetrazolio (MTT) [18].

La absorbancia se determinó a 570 nm en un lector de Elisa Multiscan EX®. Con los datos obtenidos se determinó la viabilidad celular con la siguiente fórmula:

% Viabilidad celular = 100–(DO_C–DO_EX/DO_C)x100%

DO_C = Densidad óptica del control celular

DO_EX = Densidad óptica de células con extracto

Los valores encontrados en el rango comprendido entre 80 y 120% indican que el extracto de la planta es inocuo sobre las células Vero. Valores por encima de 120 o por debajo de 80 se consideraron proliferativos o citotóxicos, respectivamente [19].

Determinación de la concentración bacteriana: Se estandarizó la concentración bacteriana mediante diluciones seriadas a partir del patrón 0,5 de McFarland hasta obtener lecturas de absorbancia adecuadas siguiendo la Ley de Lamber y Beer, mediante el ensayo colorimétrico de MTT en micro cultivo [20].

Ensayo de CMI por microdilución en placa: En placas de 96 pozos de fondo plano, se colocaron por sextuplicado diluciones seriadas del extracto a probar como antimicrobiano (100 µL/pozo) partiendo de la mayor concentración inocua en 24 horas para cada compuesto. Se usó gentamicina (10 µg/mL) como control de inhibición bacteriana. En cada uno de los pozos se inocularon 100 µL de la suspensión bacteriana de 150x10² bacterias/mL previamente estandarizada y se incubó por 24 horas a 37 ºC. Después del tiempo de incubación, se realizó la observación visual de cada una de las concentraciones evaluadas. Las suspensiones bacterianas de dos pozos correspondientes a cada concentración evaluada se mezclaron y se determinaron las unidades formadoras de colonias (UFC) mediante siembra en placas de agar sangre para cada uno de los compuestos y bacterias.

El ensayo colorimétrico [20] se realizó por cuadruplicado con 10 µL/pozo de MTT (5 mg/mL); las placas se incubaron por 30 minutos a 37 ºC y se leyeron en un lector MicroScan EX® para la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) [17,21].

Actividad antibacteriana por el método de Kirby-Bauer: Se utilizaron discos de papel de filtro de 6,3 mm marca Oxoid®. Para determinar el volumen de absorción de los discos se pesó un disco seco, luego se sumergió en agua destilada y se determinó el volumen de absorción por diferencia de peso. El volumen de absorción de los discos (18,7 µL) fue usado para impregnarlos con las concentraciones mínimas inhibitorias resultantes de las evaluaciones previas para cada extracto y fracción, resultante del ensayo de microdilución en placa. Los discos impregnados estérilmente con el volumen de absorción se dejaron secando en campana de flujo laminar a temperatura ambiente. Posteriormente se realizó la prueba de sensibilidad por difusión con discos por el método de Kirby-Bauer [22-24].

Resultados

Citotoxicidad: El extracto clorofórmico de C. paraensis resultó citotóxico en las concentraciones de 25 y 50 µg/mL e inocuo en el rango de 0,78-12,5 µg/mL, mientras que el extracto metanólico resultó inocuo entre 0,78 y 50 µg/mL. Los extractos diclorometano/etanol, etanólico, diclorometano/metanol y metanólico de P. sprucei, así como la fracción 19 de L. camara L. resultaron inocuos en el rango entre 0,78 y 50 µg/mL; la fracción 14 de L. camara L. resultó inocua en el rango de 0,78 y 25 µg/mL, mientras que a 50 µg/mL resultó citotóxica (Tabla 1).

Tabla 1. Ensayo de citotoxicidad de los extractos y fracciones evaluados sobre células Vero en 24 horas.

Sensibilidad bacteriana:

Concentración mínima inhibitoria: Sobre S. aureus, las CMIs obtenidas fueron: con el extracto metanólico de C. paraensis 25 µg/mL; con los extractos diclorometano/etanol y etanólico de P. sprucei 25 y 50 µg/mL, respectivamente. Sólo la fracción 19 de L. camara L. presentó una CMI de 50 µg/mL sobre S. aureus y A. haemolyticus. El resto de los extractos no presentaron actividad antibacteriana (Tabla 2).

Tabla 2. Ensayo de concentración mínima inhibitoria (CMI) de los diferentes compuestos evaluados sobre Staphylococcus aureus y Acinetobacter haemolyticus.

Prueba de sensibilidad por difusión con discos: El halo de inhibición del extracto metanólico de C. paraensis (25 µg/mL) sobre S. aureus fue de 8 mm y para el extracto diclorometano/etanol de P. sprucei fue de 9 mm. El halo del extracto etanólico de P. sprucei (50 µg/mL) fue de 7 mm. Con los discos impregnados con el doble de la CMI se obtuvo diferencia de una unidad mayor respecto al halo medido con la CMI. Con la mitad de la CMI, se mantuvo la misma medida del halo original. Con la fracción 19 de L. camara L. no se evidenció halo de inhibición para S. aureus ni para A. haemolyticus (Tabla 3).

Tabla 3. Halos de inhibición de los diferentes extractos sobre Staphylococcus aureus y Acinetobacter haemolyticus por el método de difusión, en función de las CMIs obtenidas.

Discusión

Los triterpenoides extraidos de diferentes géneros de plantas pertenecientes a la familia Chrysobalanaceae, presentaron actividad contra bacterias grampositivas pero no contra gramnegativas [25]; estos resultados están acordes con los del presente estudio, ya que al evaluar extractos de C. paraensis y P. sprucei, se observó inhibición sobre S. aureus, mientras que sobre las bacterias gramnegativas, no hubo inhibición.

Existen reportes de la actividad antibacteriana del ácido lantánico extraído de L. camara L. sobre bacterias grampositivas y gramnegativas de cepas de referencia mediante un ensayo bioautográfico [26], sin embargo, bajo las condiciones del presente estudio, la fracción 14, siendo rica en triterpenos, no presentó actividad antibacteriana; posiblemente la composición de triterpenos presentes en estos extractos es diferente.

Los extractos de L. camara L. no presentaron actividad antibacteriana en las condiciones utilizadas en el presente trabajo. Sin embargo, otros autores han reportado 100% de inhibición sobre S. aureus y ausencia de actividad sobre E. coli, utilizando el método de dilución en agar con los extractos diclorometano/metanol y metanólico, en concentraciones de 500 y 1000 µg/mL respectivamente [27]. Estas concentraciones son diez y veinte veces superiores que la máxima concentración usada en la presente investigación; estas diferencias en las concentraciones podrían explicar los resultados obtenidos. Otra variable a considerar es el método: los investigadores realizaron sus evaluaciones con dilución en agar y en este trabajo se utilizó el método de concentración mínima inhibitoria por micro dilución en placa. En otros estudios, la actividad de los extractos clorofórmicos y metanólicos ha sido encontrada de forma específica sobre cepas grampositivas, aunque Pseudomonas aeruginosa fue inhibida por el extracto metanólico de forma dosis dependiente [28].

En la Convención Anual de Microbiología en Filipinas (1998), se presentó una evaluación de la actividad antibacteriana de extractos alcohólicos y acuosos de hojas secas de L. camara L. por el método de difusión en disco de Kirby-Bauer, utilizando discos con un tamaño de 12,7 mm, sobre cepas de referencia de S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922 y P. aeruginosa ATCC 27853; encontraron actividad solo sobre S. aureus con una CMI de 125 µg/mL y los halos de inhibición obtenidos con los extractos alcohólico y acuoso fueron 14,6 y 14,8 mm respectivamente [29]. En el presente estudio la fracción 19 de L. camara L. inhibió el crecimiento de S. aureus, A. haemolyticus y S. lugdunensis con una CMI de 50µg/mL. La concentración mínima inhibitoria reportada por estos autores es 2,5 veces más alta que la concentración reportada en el presente trabajo (50 µg/mL), la cual es inocua en células de mamíferos. Otros autores han demostrado la relevancia que tiene trabajar en rangos de concentraciones inocuas en células eucariotas cuando se está en la búsqueda de agentes terapéuticos [30].

Con la fracción 19 de L. camara L., constituida fundamentalmente por flavonoides, se obtuvo actividad contra bacterias, corroborando la propiedad antibacteriana de los flavonoides [31]. Sin embargo, no hubo correlación entre la CMI y los halos de inhibición, aun cuando se usó el doble de la CMI sobre los discos. La ausencia de inhibición pudiera deberse a la falta de difusión del extracto en el medio, probablemente por interferencia de algún otro componente presente en esta fracción. Mothana et al., en un estudio con diferentes variedades de plantas, dejaron actuar los discos preparados sobre las placas inoculadas durante dos horas en refrigeración antes de la incubación apropiada para el crecimiento bacteriano [32]_. La ausencia de ese factor en la metodología usada en este estudio podría haber contribuido en la falta de difusión de los componentes de la fracción. El siguiente paso de esta investigación será la purificación de cada uno de esos extractos y fracciones, de manera de obtener uno o varios principios activos específicos que se puedan utilizar como agentes terapéuticos para el tratamiento de las enfermedades infecciosas producidas por bacterias.

Conclusión

Los resultados obtenidos muestran que la fracción 19 de Lantana camara L. y los componentes de los extractos de la familia Chrysobalanaceae presentaron actividad antibacteriana en un rango de concentraciones inocuas para células de mamíferos, lo que hace factible su uso en estudios in vivo como potenciales agentes antibacterianos, después de determinar cuál o cuáles son los principios activos responsables de esta actividad.

Agradecimientos

Los autores agradecen a las Dras. María Isabel Urrestarazu y Noris Serrano, del Laboratorio de Microbiología del Servicio Autónomo Instituto de Biomedicina, por el apoyo en la obtención de los aislados bacterianos. Este estudio fue financiado por el Proyecto del CDCH PG-006589-2006.

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