Método fácil y confiable para teñir núcleos en hongos del complejo Rhizoctonia

 Luis Cedeño^[1]

^[1] Laboratorio de Fitopatología, Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Facultad de Ciencias Forestales y Ambientales, Universidad de Los Andes. Apdo.77. Mérida. Venezuela.  e-mail: cedenol@ula.ve

RESUMEN

En el complejo Rhizoctonia la morfología hifal y configuración del septo permiten diferenciar los géneros, mientras que las especies pueden ser distinguidas por la condición nuclear y el grosor de hifas “guías” ó la morfometría del teleomorfo. Para caracterizar las especies en uni, bi y multinucleadas se han desarrollado varios  métodos de tinción nuclear con  acridina naranja, azules de anilina y tripano, diamina fenil indol (DAPI), giemsa, hematoxilina, orceina y safranina O. Algunos de esos procedimientos son  rápidos, pero otros requieren técnicas especiales (fluorescencia) o consumen mucho tiempo y limitan la cantidad de muestras a procesar. Un nuevo método fue desarrollado durante análisis de anastomosis (AGs) en  aislamientos de  R. solani que atacan la papa cultivada en Mérida, Venezuela. El procedimiento es rápido, fácil, confiable y permite la manipulación simultánea de un número considerable de especimenes, y tanto el núcleo como el nucléolo conservan su integridad. El método fue probado exitosamente en 10 patrones de  AGs de R. solani, y permitió separar 173 cepas multinucleadas y 3 binucleadas, todas del género Rhizoctonia. El método fue efectivo utilizando sustrato de agua-agar 2,4 % más PDA 0,39 %, en cultivos de 18 a 48 h fijado con formaldehído 4 % y coloreado con fucsina ácida 0,025 en ácido láctico 50 %.

Palabras clave adicionales: Micología, tinción, morfología hifal, papa

Easy and reliable method for nuclei staining of Rhizoctonia complex fungi

ABSTRACT

Hyphal morphology and septal structure configuration of the fungi included in Rhizoctonia complex allows for differentiation of genus, while species may be distinguished by nuclear condition and thickness of the runner hyphae, or teleomorph morphometry. For characterization of species in uni, bi, and multinucleate diverse methods of staining have been developed using acridine orange, aniline and trypan blue, diamine phenyl indole (DAPI), giemsa, hematoxiline, orcein and saphranin O. Some of these procedures are quick to perform, while others require special techniques (fluorescence) or are time consuming, which impose a limit on the number of samples that can be processed at a time. A new method of nuclei staining was developed during the analysis of anastomosis groups (AGs) of R. solani strains isolated from potato plants cultivated in Mérida, Venezuela. The procedure is quick, easy, and reliable, and allows for simultaneous manipulation of a significant number of samples, and both nucleus and nucleolus maintain their integrity. The method was successfully assayed in 10 different AGs testers of R. solani, and allowed separation of 173 multinucleate and 3 binucleate Rhizoctonia strains. Method effectiveness depends upon growth medium (water agar 2.4 % plus PDA 0.39 %), culture age (18-48 h), fixing agent (formaldehyde 4 %), and stain (fuchsin acid 0.025 % in lactic acid 50 %).

Additional key words: Mycology, staining, hyphal morphology, potato

Recibido: Octubre 11, 2007  Aceptado: Julio 18, 2008

INTRODUCCIÓN

Los  hongos del complejo Rhizoctonia infectan plantas silvestres y cultivadas en las más diversas regiones de la tierra, incluyendo rubros de importancia agrícola, forestal, hortícola y ornamental (Adams, 1988; Sneh et al., 1991). Los miembros del género se distinguen por la morfología hifal y la configuración del septo (Sneh et al., 1991), mientras que las especies pueden ser diferenciadas por el número de núcleos presentes en las células somáticas de hifas jóvenes y el grosor de las hifas guías, o por las características morfométricas de las estructuras reproductivas sexuales.

Desde finales de la década de los 1960’s, la cuantificación de núcleos en  las células vegetativas se constituyó en un importante criterio taxonómico para separar las especies de Rhizoctonia en uninucleadas, binucleadas y multinucleadas (Parmeter et al., 1967). Las uninucleadas fueron reconocidas  a principios de los 1990’s (Hietala et al., 1993) y su hábitat pareciera estar restringido al sistema radical de plantas coníferas donde causan pudrición. Mediante análisis combinado de cuantificación nuclear e inducción del teleomorfo, Parmeter et al. (1967) demostraron que las células vegetativas de R. solani Kühn son multinucleadas e igualmente descubrieron que algunas especies binucleadas  habían sido  identificadas  erróneamente como R. solani.  La confusión previa tuvo su origen en diagnósticos fundamentados exclusivamente en una morfología hifal que es común en otros hongos del suelo, incluyendo algunos ascomicetos (Sanders et al., 1978). Para ese entonces, la morfología hifal era el único criterio disponible porque las Rhizoctonia spp. no producen conidios y muy rara vez desarrollan el teleomorfo de manera natural o inducida; en consecuencia, las posibilidades de utilizar las estructuras reproductivas sexuales con propósitos taxonómicos son limitadas.

El grupo de las Rhizoctonia multinucleadas incluye a R. solani, R. zeae y  R. oryzae. El resto de las especies conocidas son uninucleadas o binucleadas. Mediante análisis de fusión  hifal (anastomosis) entre cepas, las Rhizoctonia binucleadas y multinucleadas han sido divididas en grupos sub-específicos llamados grupos de anastomosis (AGs). La especie más importante es R. solani la cual está conformada por una mezcla heterogénea de cepas que han sido separadas en 14 AGs (AG-1~AG13 más AG-BI) (Carling et al., 2002).

Las Rhizoctonia binucleadas representan un diverso grupo de organismos con más de 20 especies descritas (Kataria y Hoffmann, 1988) y alrededor de 24  AGs  (AG-A ~ AG-S)  (Sneh et al., 1991). Algunas especies binucleadas son patógenos de alfalfa (Eken y Demirci, 2003), cereales (Cedeño et al., 1998), césped (Burpee y Martin, 1992), coníferas (Runion y Kelly, 1993) y  fresa (Martin, 1988). 

En virtud de que la cuantificación del número de núcleos se ha convertido en un parámetro esencial para la distinción de R. solani, y de otros hongos cuyas hifas son morfológicamente similares, para tales fines se han desarrollado varios métodos de tinción nuclear. Sin embargo,  ninguno de los métodos reconocidos, excepto el que requiere fluorescencia,  muestra los núcleos completos e intactos, ni permiten procesar simultáneamente con certeza y rapidez una cantidad significativa de aislamientos.

La literatura especializada registra varios métodos de tinción para cuantificar núcleos en las células somáticas de Rhizoctonia spp. (Yamamoto y Uchida, 1982). Los colorantes más empleados para tales propósitos son los azules de anilina y tripano (Herr, 1979), diamina fenil indol (DAFI) (Martin, 1988), giemsa (Rogers, 1965), naranja de acridina  (Yamamoto y Uchida, 1982),  orceina (Tu et al., 1969) y safranina O (Bandoni,  1979). El giemsa y los azules de  anilina y tripano, tiñen los núcleos de azul intenso. El  naranja de acridina  colorea de verde el ADN y de rojo intenso el nucleolo. La safranina O  tiñe de rojo intenso el nucleolo, pero no reacciona con los otros componentes nucleares. Varios procedimientos han sido catalogados como rápidos (azules de anilina y tripano, DAFI, naranja de acridina, safranina O), pero ninguno de éstos  permite la observación nítida e integral de núcleos y nucleolos y en consecuencia, generan dudas sobre la identidad de las estructuras teñidas, porque existe la probabilidad de que se contabilicen como núcleos a vacuolas cargadas que tienen afinidad con estos colorantes y que pudieran tener morfología y dimensiones similares a las de  los núcleos. La reacción rápida de los azules de anilina y tripano, disueltos ambos en glicerina, aparentemente, constituyen una forma práctica de revelar las estructuras nucleares en Rhizoctonia spp., pero no permite distinguir los nucleolos. Algunos métodos requieren el empleo de técnicas especiales (DAFI, fluorescencia), mientras otros son tediosos y  exigentes en cuanto a dedicación y precaución (HCl-giemsa y aceto orceina); por lo tanto, consumen mucho tiempo y no permiten  el procesamiento simultáneo de una cantidad significativa de muestras.

El objetivo del presente estudio fue desarrollar un método de tinción nuclear fácil y confiable, para visualizar rápidamente núcleos íntegros en especies de Rhizoctonia y que además permita procesar simultáneamente una cantidad significativa de especímenes. 

MATERIALES Y MÉTODOS 

En la investigación se utilizaron cepas de Rhizoctonia obtenidas de raíces, estolones, tallos, pecíolos, y principalmente tubérculos de papa cultivada en distintas áreas ecológicas del estado Mérida. Las cepas fueron sub-cultivadas por 18-48 h a temperatura ambiente (22 ± 2 ºC) en placas que contenían 4,5 mL de agua agar (AA) 2,4 %  más papa-dextrosa agar (PDA Difco) en concentraciones variables de 0,39 a 1,95 %. El medio se descargó en placas precalentadas por 30 min a 50 ºC, para que la distribución ocurriera de la manera más uniforme posible. Los cultivos se fijaron con distintas concentraciones de formaldehido (1 al 7 %) por  lapsos variables (de 10 a 60 min). Posteriormente, de cada placa se cortaron secciones angulares de agar-micelio (15 mm x 15 mm ó 30 mm x 15 mm), que seguidamente fueron colocadas sobre portaobjetos, tratadas por al menos 2 minutos con fucsina ácida 0,025 % en ácido láctico 85 %, cubiertas con cubreobjeto (22 mm x 22 mm ó 24 mm x 40 mm) y  examinadas en microscopio fotónico bajo abundante iluminación. Los cubreobjetos fueron colocados al concluir el tiempo de tinción. Los núcleos se cuantificaron en las células más próximas al ápice hifal (Sneh et al., 1991). Como control  se utilizó la  tinción HCl-giemsa de Rogers (1965). La utilidad y eficiencia del método fueron evaluadas  en 176 cepas cuyas hifas tenían la morfología típica del género Rhizoctonia, 10 patrones reconocidos (testers) de AGs de R. solani, 2 ascomicetes y 1 oomicete. Los montajes se examinaron en un microscopio Zeiss Axioplan y fueron digitalizados usando una cámara Canon PowerShot A640.

En todos los casos, los núcleos y el septo dolíporo se apreciaron con mayor nitidez cuando las cepas fueron sub-cultivadas en AA 2,4 % más PDA 0,39 %, fijadas por 30 min o más con formaldehído 4 % y tratadas por 2 min o más con fucsina ácida 0,025 % en ácido láctico 85 %. Los núcleos conservaron su integridad, mostraron forma lenticular y color rojo claro, mientras que los nucleolos aparecieron como corpúsculos globosos de color oscuro. Cuando el colorante se aplicó en cultivos sin fijar mostró dificultades de penetración y difusión, y en consecuencia, los núcleos no fueron diferenciados. De igual manera, se pudieron distinguir núcleos y nucléolos  en cepas cultivadas  en AA 1,5 ó 2 %,  más PDA 0,78 ó 1,95 %, porque la penetración del colorante fue interferida por la presencia de vacuolas. Los núcleos tampoco se apreciaron claramente en cultivos que después de fijados se lavaron con agua destilada estéril,  alcohol etílico 70 % o tampón fosfato (pH 7,2). 

RESULTADOS y discusión

El método permitió separar en 173 cepas multinucleadas (Figura 1) y 3 binucleadas, todas del género Rhizoctonia provenientes de papas cultivadas en los andes de Venezuela. El procedimiento resultó igualmente exitoso en la visualización de núcleos íntegros en las hifas de los diez patrones de  AGs de R. solani y uno de Rhizoctonia binucleada causante del “sancocho” (damping-off) en alfalfa, así como en los ascomicetos Neonectria radicicola var. radicicola (Cylindrocarpon destructans var. destructans) y Neonectria discophora var. rubi (Cylindrocarpon ianthothele var. ianthothele), y el oomiceto Phytophthora infestans cultivado en harina de avena agar (0,4 %).

La investigación permitió desarrollar un procedimiento de tinción que proporciona una imagen real y exacta de las estructuras nucleares presentes en células vegetativas jóvenes de Rhizoctonia spp. El AA 2,4 % evitó que el material sufriera fractura durante la extracción y posterior manipulación. El PDA 0,39 % redujo la vacuolización hifal y favoreció la penetración del colorante. El formaldehído facilitó la difusión del colorante, incrementó su afinidad por los núcleos y prolongó la vida útil de las preparaciones. Sin tratamiento previo con formaldehído, la penetración del colorante fue restringida. El procedimiento permite examinar  una cantidad apreciable de aislamientos en un lapso relativamente corto, es fácil, poco costoso, no exige el empleo de técnicas microscópicas especiales y  no genera dudas sobre la identidad de las estructuras teñidas. La preparación  no necesita lavado y es notablemente limpia porque el colorante no  precipita.

LITERATURA CITADA

1. Adams, G.C. Jr. 1988. Thanatephorus cucumeris (Rhizoctonia solani) a species complex of wide host range. Adv. Plant Pathol. 6: 535-552.        [ Links ]

2. Bandoni, R.J. 1979. Safranin o as rapid nuclear stain for fungi. Mycologia 71:873-874.        [ Links ]

3. Burpee, L.L. y B. Martin. 1992. Biology of Rhizoctonia species associated with turfgrasses. Plant Dis. 76:112-117.        [ Links ]

4. Carling, D.E, S. Kuninaga y K.A. Brainard. 2002. Hyphal anastomosis reactions, rDNA internal transcribed spacer sequences, and virulence levels among subsets of Rhizoctonia solani anastomosis group 2 (AG2) and AG-BI. Phytopathology 92: 43-50.        [ Links ]

5. Cedeño, L., H. Nass, C. Carrero, R. Cardona, H. Rodríguez y L. Alemán. 1998. Rhizoctonia oryzae-sativae, agente causal de la mancha agregada del arroz en Venezuela. Interciencia 23:248-250.        [ Links ]

6. Eken, C. y E. Demirci. 2003. Identification and pathogenicity of Rhizoctonia solani and binucleate Rhizoctonia anastomosis groups isolated from forage legumes in Erzurum, Turkey. Phytoparasitica 31: 76-80.        [ Links ]

7. Herr, L.J. 1979. Practical nuclear staining procedure of Rhizoctonia-like fungi. Phytopathology 69: 959-961.        [ Links ]

8. Hietala, A., R. Sen y A. Lilja. 1993. Anamorphic and teleomorphic characteristics of a uninucleate Rhizoctonia species isolated from the roots of nursery grown conifer  seedlings. Mycol. Res. 98: 1044-1050.        [ Links ]

9. Kataria, H.R. y G.M. Hoffmann. 1988. A critical review of plant pathogenic species of Ceratobasidium Rogers. J. Plant Dis. Protec. 95: 81-107.        [ Links ]

10. Martin, B. 1988. Identification, isolation, frequency, and pathogenicity of anastomosis groups of  binucleate  Rhizoctonia  spp. from strawberry roots. Phytopathology 78: 379-384.        [ Links ]

11. Parmeter, J.R. Jr, H.S. Whitney y W.D. Platt. 1967. Affinities of some Rhizoctonia species that resemble mycelium of Thanatephorus cucumeris. Phytopathology 57: 218-223.        [ Links ]

12. Rogers, J.D. 1965. The conidial stage of Coniochaeta lignaria: morphology and citology. Mycologia 57: 368-378.        [ Links ]

13. Runion, G.B. y W.D. Kelly. 1993. Characterization of a binucleate Rhizoctonia species causing foliar blight of Loblolly pine. Plant Dis. 77: 754-755.        [ Links ]

14. Sanders, P.L., L.I. Burpee y H.Jr. Cole. 1978. Preliminar studies on binucleate turfgrass pathogens that resemble Rhizoctonia solani. Phytopathology 68: 145-148.        [ Links ]

15. Sneh, B., L. Burpee y A. Ogoshi. 1991. Identification of Rhizoctonia species. Am. Phytopathol. Soc., St.  Paul, Minnesota.  133 p.        [ Links ]

16. Tu, C.C., D.A. Roberts y J.W. Kimbrough. 1969. Hyphal fusion, nuclear condition and perfect stage of three species of Rhizoctonia. Mycologia 61: 775-783.        [ Links ]

17. Yamamoto, D.T. y J.Y. Uchida. 1982. Rapid nuclear staining of Rhizoctonia solani and related fungi with acridine orange and with safranin O. Mycologia 74: 145-149.        [ Links ]