Optimización de la proliferación in vitro de jojoba con la aplicación del diseño compuesto central rotable e inoculación con rizobacterias

Diana Andressen,⁽¹⁾ Irene Manoochehri¹, Susana Carletti², Berta Llorente², Melángel Tacoronte¹ y María Vielma¹

(1) Laboratorio de Cultivos  in  vitro,  Universidad  de  Los  Andes,  Facultad  de  Ciencias.  Mérida,  Venezuela. e-mail: diana_an@hotmail.com; mvielma1@ula.ve

² Laboratorio de Cultivos de Tejidos Vegetales, Departamento Ciencias Básicas. Universidad Nacional de Luján  (Bs. As.) Argentina. e-mail: susanacarletti@hotmail.com; llorente@mail.unlu.edu.ar

RESUMEN

Jojoba (Simmondsia chinensis (Link) Schneider) es una planta cuyas semillas producen un aceite de alto valor comercial usado en cosmetología y como lubricante. Con el objetivo de optimizar su proliferación in vitro se realizaron experimentos utilizando el diseño estadístico compuesto central rotable (CCR) y se evaluó el efecto de la inoculación con rizobacterias promotoras del crecimiento. Segmentos nodales de vástagos in vitro fueron cultivados en medio básico de Murashige y Skoog con diferentes relaciones de sacarosa (S) y 6-benciladenina (BA) calculadas mediante el CCR. De acuerdo a la superficie de respuesta se obtuvo que el número óptimo de brotes desarrollados en vástagos fue de 5,68 y correspondieron a una relación S/BA de 22,3/1,16. La biotización con 5 x 10⁶ ufc·brote^-1 de Azotobacter chroococcum incrementó significativamente el número de vástagos generados por brote o tasa de multiplicación (TM). En presencia de 0,5 y 1 mg·L^-1 de BA se obtuvieron incrementos del 46 y 28 %, respectivamente. La inoculación con Azospirillum brasilense y A. lipoferum no mostró aumentos significativos en la TM.

Palabras clave adicionales: Micropropagación, Azospirillum brasilense, A. lipoferum, Azotobacter chroococcum, biotización

Optimization of the in vitro proliferation of jojoba (Simmondsia chinensis (Link) Schn.) by using rotable central composite design and inoculation with rhizobacteria

ABSTRACT

Jojoba (Simmondsia chinensis (Link) Schn.) is a plant wich seeds produce oil of high commercial value used in cosmetology and as lubricant. Experiments were conducted using the rotable central composite design (RCCD) in order to get the optimum of its proliferation in vitro and to evaluate the effect of the plant growth-promoting rhizobacteria PGPR). Nodal segments were cultivated in Murashige & Skoog basal medium with different relations of sucrose (S) and 6- benziladenin (BA), calculated by the RCCD. According to the response surface graph, it was obtained that the optimun number of buds developed as shoots was 5.68, corresponding to 22.3/1.6 S/BA relationship. The biotization with 5 x 10⁶ cfu·bud^-1 of Azotobacter chroococum increased significantly the number of shoots generated per bud (rate of multiplication). In presence of 0.5 and 1 mg·L^-1 of BA, increments of 46 and 28 % were obtained, respectively. The inoculation with Azospirillum brasilense and A. lipoferum did not show any significative increase in the rate of multiplication.

Additional key words: Micropropagation, Azospirillum brasilense, A. lipoferum, Azotobacter chroococcum, biotization

Recibido: Febrero 18, 2008  Aceptado: Diciembre 12, 2008

INTRODUCCIÓN

Jojoba (Simmondsia chinensis (Link) Schn.) es un arbusto dioico oriundo del desierto de Sonora (México y Estados Unidos) que pertenece a la familia Buxaceae (Mabberley, 1987). Dado su resistencia a estreses abióticos, se considera un cultivo alternativo de zonas áridas a semiáridas del mundo (Roussos et al., 1999). Sus frutos contienen una cera líquida formada por una mezcla de ésteres de ácidos grasos muy resistentes a la degradación bacteriana y estable a altas temperaturas. Esta cera es ampliamente utilizada en la industria de cosmética (Ayerza, 1992). Actualmente se están desarrollando tecnologías para obtener un lubricante no contaminante a partir de las ceras derivadas de estos frutos. Dicha materia prima también resultaría útil para la fabricación de lacas, pinturas y termoplásticos especiales entre otros  (Bouaid et al., 2007).

Las plantas obtenidas de semillas presentan variabilidad genética y dado que la jojoba es dioica, su sexo y productividad sólo se puede evaluar al momento de la floración (5-6 años). En general, las plantaciones homogéneas obtenidas por propagación asexual producen semillas a los 3 años (Purcell y Purcell, 1988, Alcaráz y Ayla-Rocha, 1992, Mills et al., 1997). Dado que la propagación vegetativa por estacas produce el raleo de las plantaciones (Ayerza, 1992; Benzioni, 1995), la micropropagación constituye una metodología promisoria para la producción masiva de clones selectos, libres de patógenos e independiente de las condiciones ambientales (Mills et al., 1997; Merkle y Dean, 2000).

Varios autores han desarrollado la micropropagación de jojoba variando las condiciones  ambientales,  químicas  y  biológicas de los cultivos (Llorente y Apóstolo, 1998; Roussos  et  al.,  1999;  Tyagi  y  Prakash,  2004). Con  el  objetivo  de  incrementar  la  cantidad  de vástagos generados por brote se han utilizado preferentemente las citocininas 6-bencilaminopurina y cinetina, pero los resultados de esos experimentos no han sido completamente satisfactorios  por  lo  que  es  necesario  aumentar la eficiencia de los protocolos, de manera de incrementar  la  tasa  de  multiplicación  de  la jojoba.

La metodología de superficie de respuesta (MSR) permite modelar y analizar problemas en los cuales una respuesta de interés es influida por diversas variables. Emplea técnicas estadístico-matemáticas para analizar al mismo tiempo varios factores y niveles, generando modelos polinómicos de bajo orden que establecen las relaciones funcionales entre los factores bajo estudio. Permite reemplazar los experimentos factoriales en los que se aumenta significativamente el número de tratamientos y el error experimental y además, se optimiza la respuesta, según los principios establecidos por Box y Wilson (1951). Ha sido utilizada ventajosamente en el diseño de tratamientos químicos, industriales y en algunos tópicos biológicos (Chacín, 1998; Mora, 2000).

El diseño estadístico compuesto central rotable (CCR) es una MSR que en los estudios de cultivo in vitro, permite evaluar concentraciones de sustancias que puedan modificar el crecimiento y desarrollo de diferentes órganos y analizar sus respuestas (Ascanio et al., 1996; Mora, 2000; Bustamante  et  al.,  2006).  Con  su  aplicación  en el cultivo in vitro es posible maximizar la respuesta (formación de brotes, embriones somáticos, callos) y minimizar la aplicación de tratamientos hormonales. En caoba fue utilizada para optimizar respuestas de desarrollo de brotes axilares (Tacoronte et al., 2004) y en melón para optimizar su efecto en la regeneración de primordios de vástago y formación de callo (Valecillos, 1999).

Por otro lado, algunas rizobacterias ejercen efectos benéficos sobre las plantas cultivadas in vitro (Carletti et al., 1998; Nowak, 1998; Llorente et al., 2003). Estas rizobacterias, conocidas como PGPR, favorecen el crecimiento vegetal a través de varios mecanismos tales como síntesis de fitohormonas y fijación del nitrógeno atmosférico (Abbass y Okon, 1993; Okon y Vanderleyden, 1997). La inoculación de las plantas in vitro con PGPR se denomina biotización (Nowak, 1998) y puede protegerlas contra el estrés del cultivo in vitro además de estimular su crecimiento (Nowak y Shulaev, 2003; Vestberg et al., 2004). En asociación con brotes de orégano (Origanum vulgare) y frambuesa (Rubus sp.) cultivados in vitro, las Pseudomonas spp. previnieron la vitrificación de los tejidos y mejoraron la eficiencia de la propagación (Shetty et al., 1996; Ueno et al., 1998). Otra PGPR, clasificada como Bhurkholderia sp., es capaz de establecer poblaciones endofíticas y epifíticas, permitiendo la multiplicación clonal de plántulas de papa (Solanum tuberosum spp. tuberosum) por segmentos nodales (Frommel et al., 1991). También se ha demostrado el efecto favorable de Azospirilum brasilense en el enraizamiento in vitro de jojoba (Carletti et al., 1998) y de fotinia (Larraburu et al., 2007).

Con el objeto de establecer las concentraciones óptimas de sacarosa y BA en la multiplicación in vitro de S. chinensis, se procedió a ajustar el diseño CCR evaluando el número y tamaño de los brotes obtenidos a partir de segmentos nodales cultivados en diferentes relaciones de concentraciones. Por otro lado, se estudió el efecto de la inoculación de los tejidos vegetales con las PGPR A. brasilense Cd, A. lipoferum Sp59b y Azotobacter chroococcum 42 en la proliferación in vitro incorporando métodos biotecnológicos para optimizar esta etapa de la micropropagación.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal y condiciones de cultivo

Los cultivos se iniciaron utilizando segmentos uninodales de 1 cm de largo obtenidos de vástagos cultivados in vitro provenientes de plantas madres del cv. Hermosillo.

En los ensayos del efecto de la concentración de BA y sacarosa se utilizó el medio Murashige y Skoog (MS). Para estudiar el efecto de las rizobacterias se utilizó el mismo medio básico (MS) suplementado con la concentración óptima de sacarosa obtenida por el modelo estadístico CCR (22,3 g·L^-1) y concentraciones de BA inferiores a la óptima (0, 0,5 y 1 mg·L^-1).  Esto debido  a  que  uno  de  los  objetivos  del  trabajo fue sustituir  las hormonas exógenas por las producidas  por  las  rizobacterias,  por  lo  que sólo  se  realizaron  ensayos  estadísticamente  valorados con concentraciones menores de citocinina que la que demostró ser óptima con el CCR (es decir, menores a 1,610 mg·L^-1). Lo anterior está sustentado en ensayos preliminares exploratorios (n = 5) en donde se determinó que la inoculación en medios con altas concentraciones de citocininas producían alteraciones en el crecimiento de los brotes micropropagados de jojoba y en la bibliografía que indica la producción  de  citocininas  por  las  PGPR.   El pH  de  los  medios  se  ajustó  a  5,6  y  se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Los cultivos fueron incubados en cámara a 24 ± 2 ºC con 16 h de luz provista por tubos fluorescentes con 57 µmol·m^–2·s^–1 de radiación fotosintéticamente activa.

Efecto de la sacarosa y BA

Los segmentos uninodales fueron cultivados en tubos con 15 mL de medio MS y diferentes relaciones de  sacarosa y BA, calculadas usando el diseño estadístico CCR (Cuadro 1). El rango de concentraciones de BA varió entre 0 y 2,5 mg·L^-1 y el de sacarosa entre 0 y 30 g·L^-1. Los medios sin sacarosa o BA se utilizaron como controles. Se realizaron 10 repeticiones de cada tratamiento. A los 60 días, se evaluó la longitud de los brotes y la tasa de multiplicación (TM) definida como el número de brotes obtenidos a partir de cada brote inicial. Se utilizó el  programa Statgraphic 5.1 para estimar los valores máximos de TM a partir de una gráfica de superficie de respuesta.

Cuadro 1. Efecto de diferentes combinaciones de sacarosa y BA en el número y tamaño promedio de los brotes desarrollados en los segmentos uninodales de jojoba

Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

Las rizobacterias empleadas en los experimentos fueron A. brasilense Cd (ATCC 29710), A. lipoferum Sp59b (ATCC 29707) y A. chroococcum 42 (aislamiento local). Los inóculos bacterianos fueron crecidos en Erlenmeyer (250 ml) con 150 ml de medio de cultivo, utilizando para A. brasilense y A. lipoferum el medio de Okon et al. (1977) y para A. chroococcum el de Brown et al. (1962). Las cepas fueron incubadas a 32 ± 1º C en agitador orbital a 140 rpm durante 48 horas. El número de las células viables fue evaluado por dilución y conteo en placa con cada medio específico suplementado con 20 g·L^-1 de agar. La cepa Cd de A. brasilense usada en los experimentos fue provista por el Dr Yaacov Okon (Faculty of Agriculture, The Hebrew University, Jerusalem, Israel), el A. lipoferum sp 59b por el Instituto de Tecnología Agropecuaria y el A. chroococcum 42 por la Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires, Argentina.

Inoculación con rizobacterias

Se utilizaron microestacas con uno o dos  nudos que  fueron  cultivadas  individualmente  in  vitro. La biotización se realizó inoculando la suspensión bacteriana en la base de cada microestaca. Con la finalidad de evaluar la influencia de la concentración bacteriana sobre la multiplicación de los brotes, se emplearon 10, 50 y 100 µl brote^-1 de una suspensión bacteriana de 10⁸ ufc mL^-1 (1 x 10⁶, 5 x 10⁶, 1 x 10⁷ ufc brote^-1). Estas  concentraciones  fueron  elegidas  teniendo en cuenta el trabajo de Fallik et al. (1988) sobre la acción de Azospirillum en cultivos de forrajes y gramíneas. Los controles se trataron con igual cantidad  de  buffer  fosfato  potásico  pH 7, estéril. Se evaluó la TM y la formación de callo en la base de los brotes a los 60 días. Los experimentos se planificaron con un diseño estadístico completamente aleatorizado. Se utilizaron 10 brotes por tratamiento y el experimento se repitió dos veces. La exploración estadística de los resultados para TM se realizó mediante análisis de varianza y prueba de Tukey utilizando el programa SPSS 12.0 (Chicago, Illinois).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los segmentos uninodales de jojoba cultivados con diferentes relaciones de sacarosa y BA calculadas por CCR produjeron diferencias en el número de brotes axilares desarrollados en vástagos, indicando que cada relación posee características específicas para la inducción, como lo observó Valecillos (1999) al aplicar el CCR en la propagación de melón. Ambas sustancias son necesarias para la proliferación y alargamiento de brotes axilares de jojoba; en su ausencia ambos procesos se ven afectados como se observa en los  tratamientos 6 y 8 con TM igual a 1,4 y 1,2 respectivamente (Cuadro 1). La TM varió entre 1,2 y 7,0. El tratamiento 2 (sacarosa 25,6 g·L^-1 y BA  0,366  mg·L^-1)  produjo  el  mayor  número  de  brotes por  segmento  uninodal  (7 brotes)  y el tratamiento 4 (sacarosa 25,6 g·L^-1 y BA 2,134 mg·L^-1) originó 5,6 brotes. Los controles (tratamientos 6 y 8) produjeron el menor número de brotes del experimento (Cuadro 1).

Dado que el número de brotes formados por segmento nodal de jojoba, presentó una gran desigualdad de varianzas entre los tratamientos fue necesario transformar los datos mediante la función logaritmo. El modelo ajustado se correspondió con una superficie de respuesta de  segundo  grado,  en  el  que  tanto  los efectos principales como cuadráticos fueron significativos (P≤0,05) (Cuadro 2). Este modelo permitió explicar el 38,99 % de la varianza total observada en el número de brotes desarrollados en segmentos nodales de jojoba. No se detectó interacción entre los tratamientos concentración de sacarosa y de BA.

Cuadro 2. Probabilidad estadística para el logaritmo del número de brotes desarrollados en segmentos nodales de S. chinensis

Se generó la ecuación de regresión:

ln (brotes) = -0,183 + 0,107 [S] + 0,895 [BA] - 0,0024 [S]² - 0,2779 [BA]²

la cual permitió trazar un gráfico de superficie de respuesta (Figura 1) a partir del cual se obtuvo una respuesta óptima de 5,68 brotes, es decir, el número máximo de yemas de jojoba en  segmentos  nodales  que  se  debería alcanzar con  una  concentración  de  sacarosa  de  22,29 g·L^-1  y a 1,61 mg·L^-1 de BA. Este valor óptimo es casi igual  al  promedio  de  5,6  brotes  obtenidos  con la relación de sacarosa de  25, 6 g·L^-1  y  2,134 mg·L^-1 de  BA (Cuadro 1), indicando que al mantener una concentración de sacarosa relativamente alta y disminuir en un 25 % la concentración de BA, el efecto sería casi el mismo.

La longitud promedio de los brotes desarrollados varió entre 1,16 y 7 cm, en los diferentes tratamientos; la ausencia de sacarosa o  de  BA  afectó  su  alargamiento.  La  mayor talla se obtuvo en los tratamientos 9, 4 y 2 (Cuadro 1; Figura 2). Las observaciones cualitativas del vigor de los brotes  mostraron que los del tratamiento 9 eran muy  etiolados, resultando menos vigorosos que los obtenidos en los tratamientos 4 y 2. Los brotes de estos tratamientos resultaron aptos para el cultivo in vitro de segmentos nodales y la micropropagación.

Además de la acción de las diferentes relaciones  sacarosa/BA,  la  gran  variabilidad tanto  en  la  TM  como  en  el  alargamiento  de los brotes puede ser explicada en función de la competencia celular y estado fisiológico de los nudos utilizados. Aunque los explantes eran uninodales y cercanos al ápice fueron tomados entre el tercero y cuarto nudo del vástago obtenido in vitro.

En concordancia con estos resultados, la aplicación del modelo CCR le permitió a Valecillos (1999) demostrar que la formación de brotes en cotiledón de melón aumentaba con concentraciones crecientes de BA  (entre 0 y 2 mg·L^-1) con un óptimo en 1,33mg L^-1. Por otro lado, Bustamante et al. (2006) aplicando el CCR en  el  cultivo  in  vitro  de  Musa  sp.  variedad Hartón (AAB), obtuvieron las concentraciones óptimas de BA, entre otros factores, que permitieron el control de la oxidación y la formación de brotes. 

Efecto de rizobacterias

Con respecto al control sin inocular, la biotización con 5 x 10⁶ ufc brote^-1 de A. chroococcum produjo incrementos significativos (P≤0,05) en la tasa de multiplicación en los medios  con  0,5  y  1 mg L^-1  de  BA  (44 % y 29 %, respectivamente) (Cuadro 3). Por otro lado y si bien en el medio de cultivo sin hormonas, la inoculación con esta concentración  de  A.  chroococcum  produjo un 7 % de incremento en la tasa de multiplicación, el mismo resultó no significativo. La biotización con A. brasilense y A. lipoferum no produjo aumentos significativos en la TM, observándose en algunos casos disminuciones en este parámetro (Cuadro 3). La mayor brotación de yemas axilares en la multiplicación in vitro de jojoba podría deberse a que el Azotobacter produce citocininas como sustancia promotora del crecimiento vegetal (Abbass y Okon, 1993). La producción microbiana de sustancias hormonales  del  tipo  de  las  citocininas podría  suplementar  el  contenido  endógeno de los brotes micropropagados de jojoba promoviendo el crecimiento y estimulando la proliferación de yemas axilares.

Cuadro 3. Efecto de PGPRs sobre la tasa de multiplicación in vitro de jojoba (número de nuevos brotes formados por explante) luego de 60 días de cultivo

Valores con la misma letra en cada columna no difieren significativamente según la prueba de Tukey (P ≤ 0,05)

Se ha reportado que BA induce múltiples brotes durante la propagación in vitro de jojoba pero presenta el inconveniente de incrementar la formación de callo basal. Esto impide la adecuada conexión vascular tallo-raíz y limita la sobrevida de las plantas durante la aclimatización (Llorente y Apóstolo, 1998; Apóstolo y Llorente, 2000; Tyagi y Prakash, 2004). Los brotes de los tratamientos inoculados con las tres cepas bacterianas no presentaron callo independientemente de la concentración  de  BA  utilizada,  mientras  que los  controles  mostraron  dichas  masas  de tejido  indiferenciado  en  la  base.  Este resultado  coincide  con  lo  señalado  por Carletti et al. (1998) en el sentido de que inóculos de A.

CONCLUSIONES

La aplicación del modelo estadístico CCR y la superficie de respuesta obtenida permitieron determinar las concentraciones óptimas de sacarosa y BA aplicadas simultáneamente al medio  de  cultivo  durante  la  multiplicación in  vitro  de  brotes  de  jojoba.  Se  obtuvo  que para  obtener  una  alta  tasa  de  multiplicación se  debería  explorar  un  ámbito  de  relaciones de  concentraciones  en  rangos  desde 22,3  hasta 25,6 g·L^-1 para sacarosa y 0,366 a 2,134 mg·L^-1 para BA.

La biotización con A. chroococcum aumentó la producción de brotes y la posibilidad de sobrevivencia por la ausencia de callo basal. Esta técnica biotecnológica puede permitir el reemplazo parcial del uso de reguladores del crecimiento sintéticos en el cultivo in vitro de la jojoba.

AGRADECIMIENTO

Trabajo financiado por CDCHT-ULA, Venezuela (Proyecto C-1171-02-01-B) y el Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Nacional de Luján, Argentina.

LITERATURA CITADA

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