Evaluación  del complejo enzimático  producido mediante el cocultivo de Aspergillus sp. y Trichoderma sp. en fase sólida sobre residuos de palma

Katherine Manjarrés¹,  Yineth Piñeros² y Eduardo Rodríguez-Sandoval¹

¹ Dpto. de Ingeniería Agrícola y Alimentos, Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Nacional de Colombia. Núcleo El Volador. Medellín, Colombia. e-mail: jkmanjarresp@unal.edu.co;   edrodriguezs@unal.edu.co

² Programa de Ingeniería de Alimentos, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano. Bogotá, Colombia. e-mail: yineth.pineros@utadeo.edu.co

RESUMEN 

El procesamiento de la palma de aceite en Colombia genera grandes cantidades de residuos ricos en lignina, celulosa y hemicelulosa. En este trabajo se estudió la actividad de enzimas celulolíticas mediante el cultivo individual y cocultivo de Aspergillus sp. y Trichoderma sp. en fase sólida utilizando los residuos de palma como sustrato,  pretratados biológicamente con Pleurotus ostreatus durante 20 días para deslignificarlos y favorecer así la producción de celulasas.  Se evaluaron las actividades celulasa total (Fpasa), endoglucanasa (CMCasa) y ß-glucosidasa (Celobiasa) durante 16 días de cultivo a una temperatura de 30ºC.  Los mayores valores se obtuvieron con Aspergillus sp. como cepa individual, reportando valores de 0,149 UI·mL^-1 de Fpasa, 0,329 UI·mL^-1 de CMCasa y 0,148 UI·mL^-1 de celobiasa. Sin embargo,  bajo el sistema de cocultivo con Aspergillus sp. en los primeros 9 días y posteriormente de sembrar Trichoderma sp. resultó ser benéfico al evitar el decrecimiento de la actividad enzimática después de alcanzar su máximo nivel, obteniéndose valores de de 0,112 UI/mL de Fpasa, 0,311 UI·mL^-1 de CMCasa y 0,140 UI/mL de celobiasa.

Palabras clave adicionales: Celulosa, celulasas, endoglucanasas, ß-glucosidasa

Evaluation of enzymatic complex produced by the co-culture of Aspergillus sp. and Trichoderma sp. in solid phase on oil palm waste

Abstract

Oil palm processing industry in Colombia generates a huge quantity of byproducts rich in lignin, cellulose and hemicelluloses. This work studied cellulolytic enzyme activity through the individual culture or coculture of Aspergillus sp. and Trichoderma sp. in a solid phase using byproducts of oil palm as a substrate. These agricultural wastes were biologically pretreated with Pleurotus ostreatus during 20 days in order to eliminate the lignin and thus improve the cellulase production. The total activity of cellulase (Fpase), endoglucanase (CMCases) y ß-glucosidase (Celobiase) were evaluated during 16 days at 30 °C. The highest values were obtained using Aspergillus sp as individual culture, with 0.149 UI·mL^-1 of Fpase, 0.329 UI·mL^-1 of CMCase and 0.148 UI/mL of celobiase. However, the coculture  systems with  Aspergillus sp. during the first 9 days and after adding Trichoderma sp. resulted in a suitable system because prevented the decrease of the enzymatic activity after reaching its maximum level of 0.112 UI/mL of Fpase, 0.311 UI/mL of CMCase and 0.140 UI/ml of  celobiase.

Additional key words: Cellulose, cellulase, endoglucanase, ß-glucosidase

Recibido: Febrero 12, 2010 Aceptado: Octubre 4, 2010

INTRODUCCIÓN

La celulosa es el biopolímero más abundante en la naturaleza y el constituyente principal de la pared celular de los tejidos vegetales; se degrada por algunos microorganismos tales como bacterias, protozoos y ciertos hongos filamentosos (Marquina, 2005). Muchos materiales lignocelulósicos (celulosa, hemicelulosa y lignina) son  una fuente para la producción de algunos productos de alto valor agregado. Su  interés a nivel industrial se basa en  su aplicación directa o indirecta para la producción de energía, la cual es considerada una energía limpia, abundante y descentralizada. Así mismo, se utiliza en la obtención de azúcares fermentables por la degradación de sus compuestos, y la producción de biocombustible  (Monsalve et al., 2006).

Teniendo en cuenta su estructura, los materiales lignocelulósicos pueden usarse como sustratos para el cultivo de hongos filamentosos capaces de producir enzimas extracelulares con actividades celulasas (Rodríguez y Piñeros, 2007). Las celulasas son proteínas derivadas de los procesos naturales de fermentación, las cuales involucran un complejo enzimático que actúa de forma sinérgica en la degradación de la celulosa y son importantes para la industria de alimentos ya que  evitan la compactación en la producción de purés de frutas, verduras y en polvos instantáneos, son usadas en la extracción de almidón, colorantes, aceites y antioxidantes (Chacón y Waliszewski, 2005); además, se utilizan en la industria de papel, textiles y jabones (Kenealy y Jeffries,  2003).

Uno de los microorganismos celulolíticos más extensamente estudiados ha sido el hongo aerobio y mesófilo Trichoderma reesei, que pertenece al phylum Ascomycota, clase de los Ascomicetos, orden Hipocreales y familia de los Hipocreaceae. A nivel industrial es usado en la producción de celulasas y hemicelulasas para la elaboración de cerveza, vinos y alimentos procesados (Roldan et al., 2006). Lati et al. (2007) reportaron que este  microorganismo cultivado sobre cascarilla de arroz tuvo la mejor producción de celulasas a un rango de temperaturas entre 25 y 30 ºC.

Así mismo, el género de hongos Aspergillus, con más de 200 especies, perteneciente al phylum Ascomycota, clase de los Ascomicetos,  orden Eurotiales y familia de los Thichocomaceae es conocido por ser superior a muchos otros microorganismos en lo que se refiere a su capacidad de producción de β-glucosidasa extracelular, enzima que es particularmente atractiva por su elevada actividad frente a la celobiosa. Este microorganismo es utilizado para la producción de salsa de soya, antibióticos, algunas enzimas y en la degradación de ciertos plásticos (Rodríguez-Mayor et al., 2005).

Uno de los residuos lignocelulósicos con mayor producción durante el procesamiento de aceite de palma son los racimos vacíos o raquis,  con una participación del 25 % de los subproductos. Para el 2006, en Colombia existían alrededor de 303.768 hectáreas cultivadas de palma de aceite, las cuales produjeron 3.543.178 toneladas de frutos y 885.794,5 toneladas  de raquis  (Fedepalma, 2006).  Los racimos vacíos son ricos en lignina (22 %) y celulosa 69 (%) (Siregar et al., 2002), los cuales han sido utilizados para compostaje, combustible para calderas utilizadas en las mismas plantas extractoras  (Del Hierro,  1993), fabricación de papel (Templeton, 2002) y abono orgánico (Fedepalma, 2006). Estos residuos pueden ser aprovechados por los microorganismos Aspergillus sp. y Trichoderma sp. que toman la celulosa como fuente de carbono y  producen celulasas. Al utilizar los racimos vacíos para la producción de celulasas derivadas de Trichoderma sp. se han encontrado las mayores actividades celulolíticas con los sustratos sometidos a  un  pretratamiento biológico con Pleurotus ostreatus y NaNO₃ como fuente de nitrógeno (Rodríguez y Piñeros, 2007).

Alam et al. (2009) utilizaron  Trichoderma harzianum y raquis como sustrato para la producción de celulasas en un bio-reactor con tambor rotatorio y obtuvieron la mayor actividad celulasa en el segundo día de fermentación,  expresada como  actividad sobre papel de filtro (FPA). Así mismo, Hidayah et al. (2008) utilizaron racimos vacíos de palma con Bacillus pumilus EB3 para determinar la actividad endoglucanasas. Incluso, estos residuos han sido pretratados con el fin de producir otros compuestos como xilosa (Rahman et al., 2006).

A pesar de las investigaciones que se han realizado, aún no se han reportado estudios basados en la evaluación del complejo enzimático derivado del cocultivo de las cepas utilizadas en raquis de palma. Por esta razón, este trabajo tuvo como objetivo estudiar  las actividades celulasas totales, endoglucanasas, β-glucosidasas, mediante el cocultivo de Aspergillus sp. y Trichoderma sp., como una alternativa para el aprovechamiento de  algunos residuos de la industria procesadora de palma por medio de procesos biotecnológicos. 

MATERIALES Y MÉTODOS 

Se obtuvieron cepas de Trichoderma sp. (R1, R2, T12, T29, T9-2, T4-3, T7-3) y Aspergillus sp. (A1, A2, A3) aisladas  de una colección del Laboratorio de  Biotecnología de la Universidad Jorge Tadeo Lozano, en Bogotá, y las mismas fueron  conservados a 4ºC en agar papa dextrosa  (PDA). Los inóculos se realizaron en medio de cultivo Mandels  estéril (Mandels y Weber, 1969).

El medio se suplementó con  5 g·L^-1 de glucosa y 5 g·L^-1 de raquis molidos como fuentes de carbono. Se realizaron cultivos de 25 mL en frascos de 100 mL, los cuales se inocularon con 1 mL de suspensión de esporas de Aspergillus sp. (2,85 x 10⁸ esporas·mL^-1) y Trichoderma sp. (2,05 x 10⁸ esporas·mL^-1). Se incubaron a 30 ºC sobre un agitador orbital a 150 rpm, durante 7 días. Para seleccionar las cepas del experimento se evaluó la actividad celulasa en azúcares reductores utilizando racimos vacíos como sustrato.

Pretratamiento biológico de los racimos vacíos

Los racimos vacíos o raquis se obtuvieron de cultivos de palma localizados en Cumaral, departamento del Meta, en el mes de abril de 2007, los cuales fueron lavados, desinfectados, secados y cortados hasta un tamaño de partícula de 3-4 cm. El pretratamiento biológico se realizó  sembrando sobre  los racimos vacíos cortados  el hongo Pleurotus ostreatus (semillas comerciales al 4 % en peso) durante 20 días a 28 ºC con la finalidad de modificar la estructura lignocelulósica del residuo.  El procedimiento se realizó en bolsas esterilizables en polipropileno biorientado, con tapón de algodón para realizar la fermentación a condiciones aerobias, y humedad del sustrato de 66 %, para lograr el crecimiento micelar sobre los residuos. Después del tratamiento, los residuos fueron lavados con el fin de retirar los restos miceliares y secados a 80 °C durante 2 días (Rodríguez y Piñeros, 2007).

Cultivo en fase sólida de Trichoderma sp. y Aspergillus sp.

El cultivo en fase sólida se realizó en bolsas esterilizables de polipropileno biorientado, con tapón de algodón, 80 g  de sustrato (pretratado biológicamente) y humedad del 66 %. A cada bolsa se le adicionaron 15 mL de medio básico de Mandels; se esterilizaron durante 30 min a 121 °C, se enfriaron y se les adicionó 25 mL de inóculo. La fermentación se llevó a cabo a 30 ºC en oscuridad, durante 16 días para cada uno de los tratamientos estipulados (Cuadro 1). El primer subíndice indica el número de días  que el microorganismo se mantuvo en las unidades de fermentación como cepa individual y el segundo subíndice indica el tiempo que estuvo en un sistema de cocultivo. La letra inicial coincide con el orden de adición de cada cepa. Se tomaron muestras en el tiempo de acuerdo al diseño experimental.

Cuadro 1. Tratamientos utilizados para la fermentación en fase sólida

Análisis enzimáticos

La extracción del complejo enzimático se llevó a cabo con 20 mL de buffer de citratos (0,05 M -pH 4,8) para 5 g de sustrato. Posteriormente se centrifugó a 3000 rpm durante 1 h y el  sobrenadante fue utilizado para medir las actividades enzimáticas. La actividad celulasa total se determinó como actividad sobre papel de filtro (FPA), utilizando 500 mL del extracto suspendido en 1 mL del buffer de citratos, se adicionó 50 mg de papel filtro y se incubó durante una 1 h a 50°C.  Posteriormente se determinaron los azúcares reductores liberados. La actividad endoglucanasa o CM Casa se midió valorando la formación de azúcares reductores liberados de una solución de CMC al 1 %, con el buffer de citratos e incubados a 50º C por 30 min (Rodríguez y Piñeros, 2007).

La actividad β-glucosidasa o celobiasa se determinó utilizando 1 mL del filtrado y 1 mL de salicina 10 mM en buffer acetato de sodio 1M (pH 6,0); se incubó a 50ºC durante 30 min y se determinó la liberación  de azúcares reductores (Ceroni y Gutiérrez, 1988; Bernier y Stutzenberger, 1989; Ramírez y Coha, 2003). El contenido de azúcares reductores fue determinado usando el método de ácido 5-dinitrosalicílico (DNS), con glucosa como patrón (Miller, 1959) y midiendo la absorbancia en un espectrofotómetro (Unicam Helios B NC 9432 UVB 1000E, Termo Spectronic) a una longitud de onda de 575 nm.

El estudio se condujo bajo un diseño experimental aleatorio de medidas repetidas con los factores de tiempo y tratamiento. Las determinaciones se realizaron en los días 2, 4, 7, 9, 11, 14 y 16, y los niveles de los tratamientos se muestran en el Cuadro 1. Los tratamientos se realizaron por triplicado, y los resultados de las

Análisis enzimáticos

La extracción del complejo enzimático se llevó a cabo con 20 mL de buffer de citratos (0,05 M -pH 4,8) para 5 g de sustrato. Posteriormente se centrifugó a 3000 rpm durante 1 h y el  sobrenadante fue utilizado para medir las actividades enzimáticas. La actividad celulasa total se determinó como actividad sobre papel de filtro (FPA), utilizando 500 mL del extracto suspendido en 1 mL del buffer de citratos, se adicionó 50 mg de papel filtro y se incubó durante una 1 h a 50°C.  Posteriormente se determinaron los azúcares reductores liberados. La actividad endoglucanasa o CM Casa se midió valorando la formación de azúcares reductores liberados de una solución de CMC al 1 %, con el buffer de citratos e incubados a 50º C por 30 min (Rodríguez y Piñeros, 2007).

La actividad ß-glucosidasa o celobiasa se determinó utilizando 1 mL del filtrado y 1 mL de salicina 10 mM en buffer acetato de sodio 1M (pH 6,0); se incubó a 50ºC durante 30 min y se determinó la liberación  de azúcares reductores (Ceroni y Gutiérrez, 1988; Bernier y Stutzenberger, 1989; Ramírez y Coha, 2003). El contenido de azúcares reductores fue determinado usando el método de ácido 5-dinitrosalicílico (DNS), con glucosa como patrón (Miller, 1959) y midiendo la absorbancia en un espectrofotómetro (Unicam Helios B NC 9432 UVB 1000E, Termo Spectronic) a una longitud de onda de 575 nm.

El estudio se condujo bajo un diseño experimental aleatorio de medidas repetidas con los factores de tiempo y tratamiento. Las determinaciones se realizaron en los días 2, 4, 7, 9, 11, 14 y 16, y los niveles de los tratamientos se muestran en el Cuadro 1. Los tratamientos se realizaron por triplicado, y los resultados de las actividades de celulasas totales (FPasa), endoglucanasa (CMCasa) y ß-glucosidasa (Celobiasa) se analizaron mediante ANOVA y prueba de Duncan utilizando el programa Statgraphics Plus V.5.1.

RESULTADOS

La cepa T12 correspondiente a  Trichoderma sp. y la A3 perteneciente a Aspergillus sp. fueron las que tuvieron mayor producción de azúcares reductores (Cuadro 2), y por lo tanto las seleccionadas  para la experimentación.

Cuadro 2. Actividad celulasa (en azúcares reductores de diferentes cepas de Trichoderma sp. y Aspergillus sp.

Actividad de celulasa total (FPasa)

Los cultivos realizados de forma individual presentaron diferencias significativas (P≤0,05), siendo superior el Aspergillus sp. (A₁₆T₀) al Trichoderma sp (A₀T₁₆) (Figuras 1 y 2). Los tratamientos donde estuvo presente el Aspergillus sp. no mostraron diferencias significativas (P>0,05) entre sí, a diferencia de los tratamientos con Trichoderma sp. donde estas diferencias sí estuvieron presentes. Los datos indican que la cepa de Trichoderma sp. es inferior en su capacidad celulolítica a la cepa de Aspergillus sp., bajo las condiciones de experimentación utilizadas, donde se obtuvo un  valor máximo de actividad FPasa de 0,149±0,07 UI·mL^-1 en el noveno día de cultivo para el tratamiento A₁₆T₀ (Figura 1), lo que demuestra  que esta cepa produce complejos con mayor actividad celulasa y en un menor tiempo de cultivo si se compara con el tratamiento A₀T₁₆ en el cual la máxima actividad FPasa se alcanzó en el día 16 y sólo superó ligeramente los 0,100 UI·mL^-1 (Figura 2). Esta diferencia se atribuye a que la cepa de Trichoderma sp es productora de altas cantidades de β-glucosidasa, lo que sugiere presencia de celobiosa, disacárido que inhibe la actividad de las celulasas, específicamente endoglucanasas y β-glucosidasas (Alam et al., 2009). En este contexto, el  Aspergillus  sp.  hidrolizaría  al  disacárido  de una forma más eficiente que la cepa de Trichoderma sp.

Kang et al. (2004) encontraron cepas de Aspergillus sp. superiores a las de Trichoderma sp. para la producción de celulasas sobre cascarilla de arroz obteniendo valores de 19 UI·g^-1 con Aspergillus niger KK2 y 7,7 UI·g^-1 con Trichoderma reesei MGC77. Por su parte, Couri et al. (2000) obtuvieron celulasas mediante cultivo de Aspergillus niger sobre salvado de trigo, con valores de actividad de 0,65 UI·mL^-1 durante dos días de fermentación, mientras que el valor obtenido en el presente trabajo fue 4,3 veces menor, lo cual puede deberse a las diferentes condiciones de experimentación tanto en la fermentación como en las características del sustrato y la competencia por los nutrientes disponibles en éste.  En cuanto al cocultivo A₁₆T₁₆ (Figura 3) la mayor actividad enzimática encontrada fue de 0,105 UI·mL^-1 al séptimo día de cultivo. Los valores son intermedios entre los producidos de forma individual por cada cepa. Este comportamiento se atribuye a la interacción de los dos microorganismos y la competencia en el  consumo de ciertos nutrientes contenidos en los racimos vacíos que se necesitan para su metabolismo, por lo que los valores de la actividad enzimática no fueron superiores a los mostrados por Aspergillus sp.

Comportamientos similares se observaron para los tratamientos A₉T₇ y T₉A₇ (Figuras 4 y 5) cuyos valores máximos de celulasas encontrados fueron 0,112 y 0,113 UI·mL^-1, respectivamente, en las determinaciones realizadas después del día 9, tiempo en el cual se colocaron las cepas complementarias como cocultivo. La actividad sobre papel filtro aumentó en el caso de T₉A₇, donde la presencia de Aspergillus sp. después del noveno día logró aumentar la actividad en 30 %.  La actividad celulasa total disminuyó luego de realizar el cocultivo en el tratamiento A₉T₇ y se mantuvo constante en las determinaciones posteriores.

Actividad de endoglucanasa (CMCasa)

El tratamiento que presentó los valores más altos de CMCasa  fue  el A₁₆T₀  con una actividad de 0,329 UI·mL^-1  en un tiempo de 2 días (Figura 1),  mientras que el tratamiento  con los valores más bajos fue el A₀T₁₆ el cual mostró en el día 7 una actividad de 0,178 UI·mL^-1 (Figura 2). Esta actividad logró un máximo con Aspergillus sp. y luego disminuyó durante el tiempo del ensayo, probablemente debido a que este microorganismo en su primera fase de crecimiento necesita producir endoglucanasas para hidrolizar el sustrato y realizar su metabolismo. Botella et al. (2005) reportaron resultados de esta actividad  utilizando Aspergillus awamori con residuos de uvas como sustrato, y obtuvieron un valor máximo de 0,113 UI·mL^-1, que disminuyó posteriormente. Esto permite comparar el comportamiento del cultivo, aunque no los datos numéricos, ya que los sustratos y las condiciones del ensayo fueron diferentes.

El  tratamiento A₁₆T₁₆ (Figura 3)  presentó valores intermedios entre los dos tratamientos de las cepas  individuales, incrementando en 31 % la actividad  de endoglucanasa con respecto a la que se obtuvo con  A₀T₁₆, lo cual resulta ser una alternativa para alcanzar mejores niveles de endoglucanasa utilizando los racimos vacíos de palma. Lo anterior demuestra que Aspergillus sp. es superior en su capacidad de degradación de los materiales lignocelulósicos presentes en el raquis  comparando con la cepa de Trichoderma sp. bajo las condiciones de experimentación propuestas en este estudio. En otra investigación (Gutiérrez et al., 1999), las cepas de Aspergillus sp. fueron superiores a las de Trichoderma sp. en la producción de endoglucanasas utilizando bagazo de caña como sustrato, obteniéndose valores de 65,8 UI·g^-1 seco con A. niger y 57,2 UI·g^-1 seco con T. reesei LM- UC4; además de lograr buenos resultados con el sistema de cocultivo.

Actividad de β-glucosidasa (Celobiosa)

Los cultivos realizados de forma individual presentaron diferencias significativas (P≤0,05) entre ellos, siendo superior el tratamiento A₁₆T₀ que el A₀T₁₆  con actividades de 0,187 y 0,122 UI·mL^-1 a los 16 y  2 días de fermentación, respectivamente (Figuras 1 y 2). El tratamiento ^A₀T₁₆ presentó los menores valores de actividad ß-glucosidasa, y las cepas utilizadas para este trabajo confirman lo encontrado en otros estudios donde cepas de Aspergillus sp. fueron superiores a las de Trichoderma sp. para la producción de ß-glucosidasa con valores de 27,3 UI·g^-1 seco con A. niger y 8,8 UI·g^-1 seco con T. ressei LM-UC4 sobre bagazo de caña y suplementado con fuentes de nitrógeno (Gutiérrez et al., 1999). Kang  et al. (2004) investigaron el potencial de Aspergillus sp. para la producción de esta enzima en fermentación sólida durante 16 días sobre cascarilla de arroz y salvado de trigo, encontrando que la  actividad ß-glucosidasa fue de 100 UI·g^-1 seco.

El tratamiento A₁₆T₁₆ mostró la máxima actividad a los dos días de fermentación con 0,125 UI·mL^-1. Los tratamientos A₉T₇ y T₉A₇, presentaron máxima actividad ß-glucosidasa de 0,141 y 0,114 UI·mL^-1, en un tiempo de 9 y 16 días, respectivamente. En general, el comportamiento de los cocultivos fue similar a  los resultados obtenidos con A₀T₁₆. La presencia de Aspergillus sp. en los cocultivos pudo sostener la actividad en el tiempo, mientras que con sólo Trichoderma ésta disminuyó luego del máximo. Otros reportes también demuestran el potencial de A. phoenicis para  la producción de  esta enzima en comparación con T. reesei utilizando residuos de origen animal donde obtuvo valores de 0,7 y 0,09 UI·mL^-1, respectivamente. En presencia de T. ressei esta actividad  se incrementó utilizando A. phoenicis en cocultivo (Zhiyou et al., 2005). Los tratamientos A₉T₇ y T₉A₇  (Figuras 4 y 5) no mostraron diferencias significativas; sin embargo, estos grupos fueron superiores (P≤0,05) con el tratamiento de cocultivo durante los 16 días. 

DISCUSIÓN

El potencial que tiene el Aspergillus sp. para la producción de celulasas ya ha sido previamente reportado (Szendefy et al., 2006); y la producción de celulasas con cepas de Trichoderma sp. se ha estudiado de forma amplia utilizando sustratos como madera  (Reczey et al., 1996), residuos de maíz (Xia y Shen, 2004) y residuos de trigo (Smits   et al., 1996), los cuales resultaron apropiados para este proceso.

De acuerdo a nuestra investigación, cuando se utilizan residuos de palma como sustrato, la cepa de Trichoderma sp. presenta una menor actividad celulolítica que la cepa de Aspergillus sp. Este último hongo produce principalmente enzimas degradadoras de xilano, el polisacárido que da origen a la xilosa.  Algunos autores reportan una producción de xilosa de 29,4 g·L^-1 de racimos de palma de aceite hidrolizada (Rahman et al., 2006). Esta característica del sustrato pudo haber influido en el mejor desempeño del Aspergillus sp. Así mismo, la literatura reporta que el Trichoderma sp. generalmente produce niveles muy bajos de β-glucosidasa (Zhiyou et al., 2005), contrario al Aspergillus sp., el cual es buen productor de esta enzima (Flachner et al., 1999).

Diferentes investigaciones han utilizado  cultivos de Trichoderma sp. y Aspergillus sp. sobre residuos lignocelulósicos tales como bagazo de caña, salvado de trigo, cascarillas de arroz y  residuos de la industria láctea en cultivos independientes y bajo cocultivo (Gutiérrez et al., 1999; Kang et al.,2004; Zhiyou et al., 2005). En todas ellas el comportamiento de los cultivos ha sido comparable al de la presente investigación a pesar de las diferencias en cuanto a las cepas, el sustrato y las condiciones generales de cultivo.

Gutiérrez et al. (1999) indicaron que los cultivos mixtos de Aspergillus sp y Trichoderma sp.  tienen los mejores resultados en la producción de enzimas celulolíticas. Los resultados del presente trabajo indican que el sistema de cocultivo presenta ciertas deficiencias al utilizar raquis como sustrato, por lo que se podría deducir que las características del sustrato, como la baja cantidad de nitrógeno (0,52 %, según Suhami y Ong, 2001), genera competencia por los nutrientes entre las dos cepas, afectando la producción de las enzimas. Además la  alta concentración de xilano podría favorecer más la actividad celulolítica del Aspergillus sp. teniendo en cuenta su metabolismo. Esto podría sugerir el uso del raquis de palma y la utilización de xilanos para la producción de xilosa, que a su vez se podría emplear en la obtención de xilitol y transformarlo en etanol mediante rutas biotecnológicas.

La presencia de Aspergillus sp. en los cocultivos mantuvo la actividad ß-glucosidasa en el tiempo, mientras que con sólo Trichoderma ésta disminuyó luego de alcanzar un máximo. Es decir, Aspergillus sp. potenció la actividad β-glucosidasa. Zhiyou et al. (2005) reportaron que T.  reesei en cocultivo con  A. phoenicis aumentó los valores de esta actividad de 0,56 a 0,64 UI·mL^-1; sin embargo, también confirmaron que la cepa Aspergillus individual resulta ser mejor productora de β-glucosidasa  (0,72 UI·mL^-1), lo cual concuerda con varios estudios donde muestran que esta cepa tiene un potencial para la producción de la enzima.

CONCLUSIONES

La cepa  A3 de Aspergillus sp. produjo celulasas con una mayor capacidad que la cepa T12 de Trichoderma sp.  El sistema de cocultivo resultó tener valores más elevados que la cepa de Trichoderma sp.; sin embargo, en ninguna de las actividades superó el potencial del Aspergillus sp. en cultivo individual para la producción de celulasas. Este tratamiento mostró la mayor actividad FPasa, CMCasa y β-glucosidasa bajo las condiciones experimentales de este trabajo con valores de 0,149; 0,329 y 0,187 UI·mL^-1 en los días 2, 9 y 16  de cultivo, respectivamente. 

El tipo de tratamiento y el tiempo influyeron de forma significativa sobre todas las actividades enzimáticas evaluadas. Las características del sustrato son un factor determinante en el comportamiento de las cepas cultivadas bajo el sistema de cocultivo, debido probablemente a su composición en cuanto a nitrógeno y alta concentración de xilano.

Este trabajo permite dar algunos lineamientos del manejo y aprovechamiento de residuos lignocelulósicos de palma de aceite utilizando cocultivo para la producción de enzimas.

AGRADECIMIENTO

Trabajo financiado por el proyecto 002IA de la Universidad Jorge Tadeo Lozano de Bogotá.

LITERATURA CITADA

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