Identificación del agente causal de la marchitez de Stevia rebaudiana Bertoni en muestras provenientes del estado Aragua, Venezuela

Luis Salazar¹, Diego Diamont¹ y Glenda Aponte¹

¹ Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA-CENIAP), Unidad de Protección Vegetal, Maracay. Venezuela.  e-mail: luisagronomia@gmail.com; ddiamont@yahoo.com; gaponteve@gmail.com

Resumen

Al servicio de diagnóstico de enfermedades producidas por hongos fitopatógenos del INIA-CENIAP, en Maracay, Venezuela, ingresaron dos muestras de Stevia rebaudiana que presentaban marchitez ascendente con necrosis en la base del tallo. Esta especie ha sido introducida como cultivo en el país por su potencial como edulcorante. Para el aislamiento del patógeno se procedió a realizar siembra directa, la cual consistió en separar cada órgano de la planta, desinfectarlos con NaClO al 2 % y colocarlos en medio de cultivo de papa dextrosa agar (PDA, con estreptomicina), bajo condiciones de cámara de aislamiento; se incubó a 28 ºC por 48 h. Luego, se aislaron las colonias típicas en PDA con estreptomicina. Una vez obtenidos los cultivos puros, se procedió con los postulados de Koch. Para la inoculación se utilizaron plantas de estevia de 60 días de edad cultivadas en sustrato estéril. Las plantas fueron inoculadas por infiltración con una suspensión de 1x10⁶ conidios por mL del patógeno para luego ser colocadas en cámara húmeda. Se realizaron observaciones diarias hasta la visualización de los síntomas. A partir del reaislamiento del hongo se procedió a describir sus características macro y microscópicas y se utilizaron claves taxonómicas para su identificación. Se observaron colonias blancas que se tornaron posteriormente a color púrpura, así como conidios, macroconidios y clamidosporas. La prueba de patogenicidad demostró que el hongo Fusarium oxysporum fue el causante de la enfermedad en plantas de estevia.

Palabras clave adicionales: Aislados, Fusarium, patógeno

Identification of the causing agent of Stevia rebaudiana  wilt in samples from Aragua State, Venezuela

Abstract

Two samples of Stevia rebaudiana, presenting upward necrotic wilt in the stem, were brought to the diagnostic service for phytopathogen-produced diseases of INIA-CENIAP, en Maracay, Venezuela. This species has been introduced in the country due to its potential as a sweetener. The pathogen was isolated by direct seeding, which consisted in separating each plant organ, disinfecting them with 2 % NaClO, and placed in potato dextrose agar culture medium (PDA, with streptomycin), under conditions of isolation chamber; tissue was incubated at 28 °C / 48 h. Then, typical colonies were isolated on PDA with streptomycin. After obtaining pure cultures, we proceeded with Koch's postulates. For inoculation 60-days old Stevia plants, grown in sterile substrate, were used. Plants were inoculated by infiltration using a suspension of 1x10⁶ conidia of the pathogen per mL. Inoculated plants were placed in a wet chamber and daily observations were made until symptoms onset. Fungus was reisolated and macro and microscopic aspects of the fungus were characterized. Identification of the pathogen was achieved by using a taxonomic identification key. White colonies were observed which later became purple. Microscopic structures such as conidia, chlamydospores and macroconidia were also observed. The pathogenicity test demonstrated that the fungus Fusarium oxysporum was causing of the disease in Stevia plants.

Additional key words: Fusarium, isolates, pathogen

Recibido: Agosto 7, 2014 Aceptado: Febrero 9, 2015

Introducción

A nivel mundial, el consumo de edulcorantes naturales ha incrementado considerablemente, por lo que es común su venta en supermercados y tiendas naturistas. Uno de los edulcorantes más importantes proviene de plantas de estevia, cuya industrialización  produce mates, néctares y  hojas  micropulverizadas  (Jarma  et  al.,  2010; Vázquez et al., 2014). En Venezuela son pocos los estados en que actualmente se produce estevia y sólo existen reportes de áreas cultivadas en el estado Aragua (González et al., 2014), así como en Monagas, Mérida, Sucre y Yaracuy en donde ya se tienen experiencias en el manejo del cultivo en pequeñas unidades de producción; sin embargo, no existe información acerca del comportamiento y la interacción  de  hongos  patógenos  con  el  cultivo, ni se han diseñado alternativas de biocontrol para ser integradas en el manejo agronómico en condiciones tropicales. De no ser consideradas estas medidas, se corre el riesgo de que se presenten los mismos problemas ya reportados en otros países, en donde los hongos fitopatógenos afectan, además de raíces y tallos, a las hojas, de las cuales se extrae el edulcorante (Zañon, 2000).

En el país no hay señalamientos sobre los problemas de fitopatogenicidad en las unidades de producción de estevia por ser un cultivo nuevo; sin embargo, el desconocimiento de la biología de los patógenos dificulta el desarrollo de tecnologías para el cultivo y su respectivos controles fitosanitarios, considerando que las enfermedades de tipo fúngico son las más importantes. En Paraguay y Brasil se reportan los géneros Phomopsis, Curvularia, Botryodiplodia, Phlyctaena, Aspergillus, Colletotrichum, Septoria, Alternaria, Rhizoctonia, Sclerotinia, Sclerotium y Fusarium (Zañon, 2000).

Las manchas causadas en las hojas por Septoria sp. y Alternaria sp. reducen el valor y calidad comercial de las mismas, mientras que los ataques al cuello de la raíz causados por Rhizoctonia sp., son abundantes, especialmente en épocas de altas temperaturas (Martínez, 2000; Zañon, 2000; Niño, 2003). Estos aspectos son indicadores importantes para elaborar un programa de manejo fitosanitario, donde constantemente se evalúen las distintas opciones y poder detectar a tiempo el agente causal de la marchitez en cultivo de estevia.

El objetivo de esta investigación fue identificar el agente causal de la marchitez de plantas de estevia en muestras provenientes del estado Aragua en Venezuela.

Materiales y métodos

Las muestras fueron consignadas al Laboratorio de Diagnóstico de Enfermedades Causadas por Hongos de la Unidad de Protección Vegetal del INIA-CENIAP. El material vegetal provino de la hacienda Tucupido, ubicada en el sector Tucupido del municipio Santiago Mariño, estado Aragua.

Las plantas procesadas presentaron marchitez ascendente con necrosis en la base del tallo. Para el aislamiento del patógeno las muestras fueron llevadas al laboratorio, donde las hojas, tallo y raíz fueron separadas, lavadas con agua corriente y desinfectadas con hipoclorito de sodio (NaClO) al 2 % durante 2 minutos. Luego se secaron con papel absorbente y posteriormente se tomaron secciones de aproximadamente 3 mm que fueron sembradas en medio de cultivo artificial papa dextrosa agar (PDA con estreptomicina) en una cámara de aislamiento. Las placas fueron incubadas a temperatura de 28 ºC por un lapso de 48 horas; luego las colonias se sembraron en PDA con el propósito de obtener un cultivo puro.

Identificación del patógeno. Se utilizaron aislados de tres y de siete días de crecimiento para evaluar las características macroscópicas y microscópicas de valor taxonómico. En los aislados de tres días de crecimiento se observaron las características macroscópicas como el diámetro de la colonia, color y aspecto del micelio, mientras que en las colonias de siete días se realizaron las observaciones y mediciones microscópicas de macroconidios, microconidios y clamidosporas usando un ocular micrométrico en preparados permanentes. En el caso de la esporulación, ésta se cuantificó mediante el uso de una cámara de Neubauer. Para la identificación del agente causal se utilizaron la claves taxonómicas (Toussoun y Nelson, 1976).

Obtención del inóculo para las pruebas de patogenicidad. Una vez obtenidas las colonias de cultivo puro, se realizó la preparación del inóculo utilizando el hongo patógeno, cultivado por siete días creciendo en PDA con estreptomicina a 28 °C. Cumplido el tiempo, se agregó a cada placa 20 mL de agua destilada estéril (ADE) y con un bisturí se separó suavemente el micelio y los conidios del hongo. Para determinar la concentración del inóculo, se colocó una gota de esta suspensión en la cámara de Neubauer, se procedió a contar con un microscopio compuesto. La concentración del inóculo fue de 1x10⁶ conidios por mL.

Para  comprobar  la  patogenicidad  del  aislado se utilizaron 12 plantas sanas de estevia de 60 días de edad, sembradas en bolsas de polietileno de 2 L con  sustrato  estéril.  Se  inocularon  10  plantas por  el  método  de  infiltración  en  la  base  del tallo  con  la  suspensión  de  conidios  del patógeno y se colocaron en un umbráculo donde se realizaron las observaciones periódicas hasta visualizar los primeros síntomas. Se dejaron dos plantas inoculadas con ADE como testigos. Una vez transcurrido este lapso, se hicieron reaislamientos del tejido vegetal con síntomas típicos de los cuales crecieron colonias de la misma especie.

Resultados y discusiÓn

Identificación del agente patógeno. Se obtuvieron colonias de un hongo en medio de cultivo PDA con estreptomicina, de crecimiento moderado, inicialmente de micelio algodonoso, abundante, de color blanco, luego de tres días cambió a color púrpura, con una dimensión de 4 cm de diámetro en seis días. Se evidenció la presencia de microconidios de 6,9-16,3 µm de largo y 2,3-4,6 de ancho, usualmente unicelulares o con un septo, de forma oval a elipsoidal, tipo amerospora sin tabiques, de pared lisa, algunos rectos o curvos, originados de fiálides  cortas laterales y macroconidios con 3 a 5 septos transversales, de forma falcada, tipo alantospora (su forma se asemeja a una banana), de 25,5-32,5 µm de largo y 4,6-6,9 µm de ancho, clamidosporas globosas,  solitarias  o  en  pares,  intercalares  6,9-11,6 µm de largo y 6,9-11,6 µm de ancho (Figura 1). Las características del aislamiento corresponden a la descripción dada por Toussoun y Nelson (1976) para la identificación taxonómica de Fusarium oxysporum.

Prueba de patogenicidad. Los síntomas desarrollados en las plantas se evidenciaron luego de cuatro días de ser inoculadas con el microorganismo. En la Figura 2 se pueden observar las lesiones de color pardo en la zona del cuello, que luego se extendieron por todo el tallo. Estas necrosis avanzaron progresivamente hacia la parte superior y produjeron estrangulamiento en la zona de avance. De igual forma, las hojas presentaron síntomas de marchitez. Las plantas murieron en un período de siete días. A partir de las lesiones se realizó el reaislamiento y se pudo constatar la presencia de Fusarium oxysporum. Los testigos inoculados sólo con agua destilada estéril no presentaron síntoma de la enfermedad.

Los resultados de esta investigación coinciden con los reportados por Arturo et al. (2009) quienes evaluaron dos localidades cultivadas de estevia en Colombia y mediante las pruebas de patogenicidad lograron determinar que el hongo con mayor incidencia en las muestras analizadas era Fusarium sp.  La sintomatología fue similar a la mencionada por Orrego (2001), Maya (2003) y Llanos (2004).

Las condiciones agroecológicas, el manejo inadecuado de sistemas de riego y el mal empleo de las prácticas agronómicas favorecen el desarrollo de Fusarium oxysporum (Agrios, 1991; Arturo et al., 2009). El hongo se presenta en la plantación de estevia de acuerdo con las condiciones ambientales, suele desarrollarse en   ausencia de lluvias pero con alta humedad ambiental, concordando con las condiciones climáticas presentes en el cultivo (Orrego, 2001)

Se ha reportado que la incidencia de Fusarium puede causar secamiento de plantas  hasta  en  11,7 % y el hongo fue señalado en 1997 como el agente causal de marchitez y pudrición de raíces y tallos de S. rebaudiana en la zona de San Lorenzo, Paraguay (Herrera et al., 2012).

En diferentes países, algunas especies de hongos identificadas como causantes de enfermedades en S. rebaudiana son Erysiphe cichoracearum, Rhizoctonia solani, Sclerotium dephinii, Septoria steviae, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotium rolfsii y Alternaria steviae (Lovering y Reeleeder, 1996; Kamalakannan et al., 2006; Maiti, et al., 2007), así como Septoria steviae y Sclerotinia sclerotiorum (Maya, 2003). Para el caso de Venezuela, el presente reporte señala a Fusarium oxysporum como causante de marchitez en estevia.

Conclusiones

A partir de plantas enfermas de estevia con síntomas de marchitez se logró aislar a  Fusarium oxysporum. Tanto las características morfológicas y culturales, como  las pruebas de patogenicidad permitieron demostrar que este hongo es el causante de la patología en la planta.

Este estudio representa el primer reporte que señala a este microorganismo como causante de marchitez en el cultivo de estevia en el país.

Literatura citada 

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3. González, C., M.S. Tapia, E. Pérez, M. Dornier y G. Morel. 2014. Caracterización de cultivares de Stevia rebaudiana Bertoni de diferentes procedencias. Bioagro 26(2): 79-88.

4. Herrera, F., L. Gómez y C. González. 2012. El cultivo de stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) en condiciones agroambientales de Nayarit, México. INIFAP. Folleto Técnico N° 19.

5. Jarma, J., E. Combatt y J. Cleves. 2010. Aspectos nutricionales y metabolismo de Stevia rebaudiana (Bertoni). Una revisión. Agronomía Colombiana 28(2): 199-208.

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