Efecto biocida in vitro del extracto foliar de Azadirachta indica en Staphylococcus sp y Pseudomonas sp.

Doris Reyes de Fuentes, Rafael Fernández Da Silva.

Universidad de Carabobo. Facultad Experimental de Ciencias y Tecnología (Facyt). Departamento de Biología, Unidad de Biotecnología Aplicada (UBA) Universidad de Carabobo; Valencia. Venezuela

Correspondencia: Rafael Fernández Da Silva.

RESUMEN

El Neem es una planta de interés etnobotánico, por las potenciales propiedades medicinales, en enfermedades de distinto origen, corroborándose el efecto de sus extractos en estudios in vitro e in vivo. Se evaluó la actividad antimicrobiana del extracto etanólico foliar del Neem (5-80%), cualitativamente por la turbidez del cultivo en medio líquido y cuantitativamente en unidades formadoras de colonia (UFC) en medio sólido, determinando la concentración mínima inhibitoria (CMI), bactericida (CMB) y fungicida (CMF) en 50 μl del inoculo de microorganismos de interés clínico a 37ºC a 24 y 48 h. Las cepas evaluadas fueron el complejo Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Streptococcus mutans. Encontrándose a las 24 horas, una CMI de 30, 40 y 45% y una CMB de 35, 45 y 50%, para S. aureus, S. mutans y P. aeruginosa, respectivamente, mientras que en el complejo C. albicans, no se detectó efecto fungicida pero si fungistático parcial. A las 48 horas de exposición S. mutans no creció a ninguna concentración, considerándose la CMB 5%, mientras que la CMI para S. aureus fue de 25%, para el complejo C. albicans de 30% y en P. aeruginosa de 35%, en tanto que la CMB para S. aureus fue de 30%, en P. aeruginosa de 40% y la CMF para el complejo C. albicans fue a 35%. El mayor tiempo de exposición del extracto a bajas concentraciones, tiene un gran potencial biocida para estos microorganismos tan importantes clínicamente, lo que sugiere la posibilidad de utilizarlo para el tratamiento tópico de afecciones causadas por los mismos.

Palabras clave: bactericida, fungicida, extracto etanólico, Neem

Neem is a plant of ethnobotanical interest, for its medicinal properties in diseases of different origin, corroborating the effect in vitro and in vivo of extracts. This study evaluated the antimicrobial activity, in the ethanol extract of neem leaf (5-80%), qualitatively by the turbidity of the culture in liquid medium and quantitatively in colony forming units (CFU) on solid medium, determining the minimum inhibitory concentration (MIC), bactericidal (BIC) and fungicidal (FIC), in 50 ul of the inoculum of microorganisms of clinical interest at 37°C at 24 and 48 h: The strains tested were complex Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans. Found that at 24 hours, MIC was 30, 40 and 45% and BIC was 35, 45 and 50% for S. aureus, S. mutans and P. aeruginosa, respectively, whereas to complex Candida albicans not detected fungicidal but fungistatic partial. After 48 hours of culture S. mutans did not grow at any concentration, 5% considered bactericidal, while 25% for S. aureus, 30% in complex Candida albicans and 35% P. aeruginosa were MIC, being 30 and 40% for S. aureus and P. aeruginosa were BIC respectively and fungicidal for C. albicans was 35%. The longer exposure to low concentrations of the extract, has great potential as a biocide for these clinically important microorganisms, can be effectively used in the production of generic drugs of low economic value to treat conditions caused by them.

Key words: bactericidal, fungicidal, ethanol extract, Neem.

Recibido: Mayo 2013 Aprobado: Octubre 2013

El árbol de Azadirachta indica A. Juss, conocido como Neem, margosa, nimba o lila de la India (en sánscrito "Arishta" que significa aliviador de enfermedades) pertenece a la familia Meliaceae. Es originario de la India y actualmente se distribuye en Asia, América, Australia y el Caribe (1). Esta planta en un icono histórico y cultural de la India, debido a sus diversos usos curativos. La primera evidencia de su empleo como tratamiento médico, se reporta en el año 4.500 aC en textos del sistema hindú "Ayuvédico" de curación natural. Esto ha permitido realizar investigaciones de diferente índole, sobre todo del tipo etnobotánico, para obtener diversos productos agrícolas y farmacéuticos (2). En Venezuela el Neem ha sido empleado en programas de reforestación y en investigaciones como insecticida natural desde 1959 en Dabajuro (Edo. Falcón). Asimismo, se emplea en la recuperación de los suelos, produciendo abono orgánico con sus partes leñosas, cubiertas de semillas y hojarasca, los cuales estabilizan el pH y aportan nitrógeno (3).

No obstante, actualmente esta planta es conocida como una de las más versátiles plantas medicinales del siglo XXI, debido al amplio espectro de actividad biológica que presenta, ya que los extractos obtenidos de sus diversas partes vegetativas, están conformados por metabolitos secundarios como fenoles, quinonas, flavonoides y alcaloides, con poca presencia de metabolitos protóxicos alérgenicos (4-6), que se utilizan en medicina popular para el tratamiento de enfermedades tales como: la lepra, los resfriados, la psoriasis, el reumatismo, las irregularidades digestivas, las úlceras péptico-duodenales, la gastritis, los eczemas, la artritis, el estrés, la viruela, la malaria, la diabetes, malaria, mal de chagas y problemas dermatológicos. Asimismo, se utilizan como emolientes, purgantes, antihelmínticos, antiinflamatorios, antisifilíticos y anticonceptivo (7- 9). Recientemente en tratamientos antivirales e inmunoestimulantes, contra virus tipo-2 del dengue y en herpex-simplex en ratones. Además fue probado en humanos contra el virus del VIH, evidenciando un aumento de peso y hemoglobina en los pacientes tratados (3, 9-10). En estudios de cáncer hepático in vivo con ratones y ratas se evidencia la actividad antioxidante, hepatoprotectora, anticancerígena y antitumoral de los extractos (11).

Además, presenta un amplio espectro de actividad contra microorganismos Gram-negativos y Gram-positivos, incluyendo cepas resistentes a la estreptomicina (3, 12- 22). Sobre la base de estos hallazgos, se han realizado investigaciones acerca de la actividad antimicrobiana de extractos puros acuosos, etanólicos y cetónicos de Neem en E. coli enteroinvasiva, E. coli enterotóxica, P. aeruginosa ATCC 27853 (21). Por otra parte, en estudios in vitro, el extracto foliar también inhibió el crecimiento de 14 cepas bacterianas, incluyendo V. cholerae, M. tuberculosis y S. pyogenes (3). Así, la margolona proveniente de la corteza es activa contra Klebsiella, Staphylococcus y Serratia sp; mientras que la mahmodina tiene una acción antibacterial moderada contra bacterias patógenas humanas. Por otra parte, la Neembolida también tiene actividad contra Staphylococcus aureus S. coagulasa negativa (3). También se ha demostrado la actividad antifúngica que ofrecen los extractos foliares y aceites esenciales de Neem en los géneros: Trichophyton, Epidermophyton, Microsporum, Trichosporon, Geotrichum y Candida (3). Los extractos foliares acuosos también tienen actividad antiviral in vitro, contra los virus Vaccinia, Chikunmgemya y paperas (parotiditis) (3). En este orden de ideas, hoy en día se buscan mecanismos alternativos económicos, sencillos, versátiles y novedosos para el tratamiento de diversas enfermedades infecciosas, debido a la rápida aparición de nuevas cepas microbiales resistentes a los antibióticos convencionales. Por lo cual, muchos investigadores evalúan diferentes metabolitos vegetales, como potencial solución en el control del crecimiento de nuevas cepas de microorganismos. En este sentido, en función de los antecedentes ya descritos y los estudios etnobotánicos en Venezuela acerca del Neem como antimicrobiano natural y antiséptico en heridas (23,24), la actividad sobre los microorganismos que se propone no se han evaluado exhaustivamente, por lo que se justifica esta investigación, ya que al determinar el efecto antimicrobiano del extracto etanólico foliar del Neem, pudiera establecerse como producto terapéutico efectivo de uso externo, seguro al ambiente y a bajo costo para la comunidad, en aras de subsanar las diversas infecciones en heridas ocasionada por diversos microorganismos de interés clínico.

Material Vegetal. Las hojas maduras de Neem (Azadiractha indica A. Juss) tomadas de plantas en el Campus de la Universidad de Carabobo (Municipio Naguanagua), se secaron en estufa a 60ºC durante 72 horas, para luego molerlas hasta obtener 25 g del polvo foliar, el cual fue disuelto en 25mL de etanol al 80% en agitación continua por 24 horas, luego de las cuales se procedió a la evaporación del etanol, obteniéndose una solución a una concentración del 100%, a partir de la cual se diluyo para realizar la evaluación biocida (13-16).

Microorganismos. Cepas liofilizadas ATCC (American Type Culture Collection) de Streptococcus mutans (CVCM656), Staphylococcus aureus (CVCM691), Pseudomonas aeruginosa (CVCM43) y complejo Candida albicans (CVCM1363) suministradas por el Centro Venezolano de Colecciones de Microorganismos (CVCM) del Instituto de Biología Experiental (IBE) de la Universidad Central de Venezuela (UCV).

Preparación de las suspensiones microbianas. Las cepas liofilizadas se prehidrataron en caldo infusión cerebro corazón (BHI), para luego incubarse por 24 horas a 37°C para su reproducció en condiciones normales de gases, excepto para Streptococcus mutans que requiere un ambiente microaerofíico (5% oxíeno y 10% CO₂). Luego se resembraron en Agar BHI, a excepció de Streptococcus mutans que fue sembrado en Agar Sangre en condició microaerofíica, incubádose por 24 horas a 37°C. Luego se seleccionaron colonias aisladas suspendiédolas en Caldo BHI por 24 h a 37°C, hasta ajustar la turbidez de las mismas al patró de 0,5% Mc. Farland (medida a 540 nm), equivalente a 1.5 x 10⁸ UFC/mL, posteriormente se tomóuna alíuota de 750 μL de la suspensió microbiana en 2250 μL de BHI, para que interactú con la dilució del extracto respectiva.

Preparación de las diluciones. A partir del extracto concentrado obtenido, se realizaron diluciones puntuales (0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 y 80%) con Caldo BHI estéil en tubos 13x100.

Determinación de la CMI, CMB y CMF. Luego de transcurrido el tiempo de exposició de los microorganismos, se procedióa inocular 50 μL de la suspensió microbiana en placas con Agar BHI, utilizando la ténica de siembra en superficie con espáula de Drigalski, asícomo en tubos con caldo BHI, mediante asa de platino calibrada de 10 μL. En ambos casos se incubódurante 24 y 48 horas a 37º, evaluando cuantitativamente el primero a travé del núero de unidades formadoras de colonias (UFC) y cualitativamente el segundo mediante la turbidez del medio (14-16), estableciédose para las tres cepas bacterianas la concentració míima inhibitoria (CMI) que determina el efecto bacteriostáico y la concentració míima bactericida (CMB), asícomo la CMI y CMF para la levadura, que establece respectivamente el efecto fungistáico y fungicida.

Controles. El medio de cultivo con solo extracto para verificar la presencia de contaminantes microbianos fue el control negativo, mientras que el medio con la cepa pura sin el extracto fue el control positivo, ya que verifica la viabilidad celular. Adicionalmente, se realizaron evaluaciones microscópicas (tinción Gram) y pruebas bioquímicas convencionales para constatar la pureza de los cultivos. Por último, se verifico que posibles remanentes del etanol en la solución concentrada final, no tuviera efecto antimicrobiano, asegurando que dicho solvente se haya evaporado por completo durante el proceso de obtención del extracto al 100%, realizando para ello los ensayos con diluciones de una solución sin polvo foliar de Neem, evidenciándose crecimiento microbial de todas las cepas en todas las condiciones.

Análisis de los resultados. Los datos obtenidos por cuadriplicado que verificaron la reproducibilidad de los resultados, se manejaron mediante el programa estadístico: Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) 18.

Al realizar la evaluación del extracto etanólico foliar de Neem en el crecimiento de microorganismos de interés clínico, se encontró una respuesta diferencial significativa en cuanto al tiempo de cultivo (24 y 48 horas) y a la especie microbial. En primer lugar, se evidenció tanto en el medio líquido como en el sólido, un crecimiento similar en función a la concentración del extracto, en el efecto bacteriostático y bactericida en S. aureus, S. mutans y P. aeruginosa, así como el efecto fungistático y fungicida en C. albicans. En este sentido, se encontró que a las 24 horas se inhibe parcialmente el crecimiento microbiano tanto en medio líquido como sólido en el complejo C. albicans, observándose un efecto fungistático parcial, pero no fungicida, mientras que para S. aureus, S. mutans y P. aeruginosa, las CMI fueron 30, 40 y 45% y las CMB fueron 35, 45 y 50% respectivamente. A las 48 horas de cultivo S. mutans no creció a ninguna concentración, considerándose bactericida el extracto al 5%, mientras que las CMI para S. aureus, complejo C. albicans y P. aeruginosa fueron extractos al 25%, 30% y 35% respectivamente. Mientras que efecto bactericida (CMB) para S. aureus y P. aeruginosa se logró a extractos al 30% y 40% respectivamente y el efecto fungicida para el complejo C. albicans fue con un extracto al 35% (Tabla 1).

La CMI es la menor concentración de una sustancia que inhibe total o parcialmente el desarrollo microbial en medio sólido, mas no en el líquido, ya que en el medio sólido el factor de dilución es mínimo, por tanto en ciertas circunstancias los microorganismos que vienen estresados por la presencia de alguna sustancia inhibidora pueden no crecer en el agar, observándose así el efecto bacteriostático o fungistático, mientras que en el medio líquido el factor de dilución es grande, de tal forma, que los microorganismos que vengan estresados, en el caldo se elimina por completo la sustancia inhibidora y por ello crecen, por lo cual, la CMB o CMF es la concentración mínima, en la que no se observa el crecimiento en medio sólido y líquido de bacterias y hongos, corroborándose el efecto bactericida y fungicida respectivamente (25).

En este sentido, los resultados obtenidos muestran que el extracto etanólico foliar de Neem utilizado, es de alta efectividad, ya que posee actividad bacteriostática y bactericida en las bacterias Gram positivas S. aureus y S. mutans y Gram negativa P. aeruginosa, así como el efecto fungistático y fungicida en el complejo C. albicans, tal como se ha evidenciado en diversos trabajos publicados con extractos acuosos, etanólicos, metanólicos y acetónicos de distintos órganos vegetales de esta planta (26-29).

Asimismo, a mayor tiempo de exposición (48 h) al extracto se obtuvo una actividad superior, ya que el crecimiento de todas las cepas de microorganismos estudiadas fue erradicado a bajas concentraciones del mismo, lo que podría ser debido a lo lento del proceso de desacople o inhibición de los sistemas estructurales o funcionales de la célula microbial, por parte de los metabolitos secundarios presentes en el extracto (30, 31). Tal es el caso del complejo C. albicans, donde solo se observa el efecto fungicida a las 48 h de exposición, o en el caso de las cepas bacterianas donde la CMB se redujo de 5 a 35% en relación al tiempo de 24 h.

En el presente estudio, el S. mutans mostró efecto bactericida a las 24 horas utilizando el extracto etanólico foliar al 45%, concentración mayor a la empleada de un extracto acetónico de corteza (20%) sobre S. sobrinus (25). Además, a las 48 horas de exposición la CMB fue del 5%, un resultado no reportado con anterioridad, con este extracto para esta cepa

En el caso de S. aureus se encontró una tendencia similar, donde un incremento en el tiempo de exposición determina un mayor efecto bactericida, reduciendo a un 5% la CMB a las 48 horas, no encontrando crecimiento bacteriano con el extracto al 30%, una concentración superior a la indicada, por otros autores, utilizando extractos metanólicos, de cloroformo de hojas y de callo embriogénico al 0.01% y 0.02% respectivamente a las 4 horas (29), así como en extractos metanólicos de corteza al 0,1% a las 8 horas de cultivo (13, 32), en extractos hexanólicos de semillas al 0.1% a las 24 horas (33), en éter de petróleo de corteza u hojas al 0,1% a las 24 horas (34), en extractos etanólicos de corteza al 0.2% a las 24 horas (35) y extractos metanólicos y acetónicos de semillas al 10% a las 24 horas (27). De tal manera que al ser los extractos provenientes de tejidos y solventes distintos al estudio, se puede inferir que los mismos presentan una diferente proporción y numero de metabolitos secundarios potencialmente biocidas a la cepa, siendo los resultados de este trabajo pioneros para este microorganismo con este tipo de extracto.

Con respecto a P. aeruginosa, se obtuvo una respuesta parecida a las indicadas en las dos cepas bacterianas anteriores, donde un incremento en el tiempo de exposición influyo en un mayor efecto bactericida, reduciendo a un 5% la CMB a las 48 horas, no encontrando crecimiento bacteriano con un extracto al 40%, una concentración inferior al 50% señalada con extracto hexanólico de semillas a las 24 horas de cultivo (35), una prometedor resultado no reportado antes con el extracto de Neem para esta cepa.

En cuanto al complejo C. albicans, no se observó efecto fungicida a las 24 horas de cultivo, aspecto logrado a las 48 horas de exposición con el extracto al 35%, CMF superior a la indicada al emplear extractos metanólicos y de cloroformo de hojas y de callo embriogénico al 0.01% y 0.02% respectivamente a las 4 horas de cultivo (29), o 0,8% del extracto metanólico de corteza a las 8 horas de cultivo (13), aspecto posiblemente atribuible a que los extractos al ser diferentes al empleado en este estudio, pueden presentar una distinta proporción de compuestos biocidas a la cepa. Sin embargo, se reporta efectos fungicidas en cultivos de 24 horas con extractos etanólicos foliares al 0,05% (36), lo cual pudo deberse a que la cepa utilizada en este trabajo presento un mayor grado de resistencia al extracto.

Finalmente, se puede concluir que el mayor efecto biocida se logra a las 48 horas de exposición a bajas concentraciones del extracto etanólico foliar. A este tiempo de cultivo, a partir del extracto al 5%, la cepa más sensible fue S. mutans, a diferencia de las cepas S. aureus, P. aeruginosa y complejo C. albicans que fueron más resistentes, dado que se requirieron mayores concentraciones del extracto (30-40%). De tal forma, que sustentándose en los resultados hallados con este extracto in vitro, se puede sugerir la posibilidad de su efectivo empleo en la elaboración de medicamentos genéricos de uso tópico de bajo valor económico, para el tratamiento de las afecciones causadas por estos microorganismos tan importantes clínicamente, previa evaluación de su efectividad y seguridad, aunado a que no hay contraindicaciones alergénicas que se hayan reportado en productos con esta planta (3).

Agradecimiento. Este trabajo fue subvencionado por el Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad de Carabobo (CDCH-UC) según oficio Nº CDCH-AM-0477-10 del 07//12/2010. Asimismo al personal asistente de la Unidad de Biotecnología Aplicada (UBA) del Departamento de Biología de la Universidad de Carabobo (Naguanagua-Edo. Carabobo) por el apoyo en la ejecución de esta investigación.

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