Resistencia a Fluoroquinolonas en Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus aislados de tejidos blandos en pacientes con Diabetes Mellitus, estado Aragua.

Resistance to Fluorquinolones in Pseudomona aeruginosa and Staphiloccus aureus isolated from soft tissue in patients with Diabetes Mellitus, Aragua state.

Andrea Contreras¹, Ana R. Durán¹, Bethelgeuse Sibrian², María V. Méndez³

¹Escuela de Bioanálisis. Universidad de Carabobo. Núcleo Aragua. ²Departamento de Microbiología. Escuela de Bioanálisis.Universidad de Carabobo. Núcleo Aragua. ³Unidad de Diagnóstico Microbiológico y Parasitológico. Dpto Clínico Integral. Escuela de Bioanálisis. Universidad de Carabobo. Núcleo Aragua. Correspondencia: mvmendezster@gmail.com

RESUMEN

Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus, son microorganismos que se encuentran involucrados en diversos procesos infecciosos en pacientes con Diabetes Mellitus. Además, son capaces de desarrollar resistencia a diversas familias de antibióticos. Es por ello que el objetivo de la investigación fue evaluar la resistencia a fluoroquinolonas en Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus aislados de tejidos blandos en pacientes con Diabetes Mellitus, en el Centro de Atención Regional de Podología (CARPO) Estado Aragua. El estudio fue de tipo descriptivo y corte transversal. La estrategia metodológica usada se basó en el uso de cultivos bacteriológicos, técnicas de identificación bacteriana y finalmente, el método de Kirby Bauer para evaluar la resistencia de ambos microorganismos a fluoroquinolonas. Se procesaron 150 muestras, 67 fueron positivas para los microorganismos en estudio. En la presente investigación, Pseudomonas aeruginosa fue el organismo principalmente aislado (33,8%), mientras que, Staphylococcus aureus, fue el mas frecuente entre los cocos gram positivos (13,4%). Se encontró alta resistencia a fluoroquinolonas, siendo para Pseudomonas aeruginosa de 95,83% y S. aureus de 89,47%. Los factores epidemiológicos y la posibilidad de infección por cepas resistentes, no presentaron asociación estadística. Por el contrario, el tratamiento previo con fluoroquinolonas y el grado de lesión, mostraron tener relación con el microorganismo aislado (p <0,05), lo que indica que, P.aeruginosa y S. aureus están pacientes diabéticos. .

PALABRAS CLAVE: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, resistencia a fluoroquinolonas, Diabetes Mellitus.

ABSTRACT

Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus are microorganisms involved in various infectious diseases in patients diagnosed with Diabetes Mellitus. They have high resistance to certain antibiotics. The aim of the study was to evaluate the resistance to fluoroquinolones in Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus isolated from soft tissue in patients with Diabetes Mellitus in the Regional Service Center Podiatry (CARPO) Aragua State. The study was descriptive and cross-section. The methodological approach was based on the use of bacterial cultures, use of identification techniques and the Kirby Bauer method to evaluate the resistance of both organisms to fluoroquinolones. 150 samples were analized, 67 were positive for microorganisms under study. In this study, Pseudomonas aeruginosa was the organism isolated mainly (33.8%), while Staphylococcus aureus was the most frequent grampositivecocci (13.4%). A high resistance to fluorquinolones was found. Pseudomonas aeruginosa showed 95,83% and S. aureus 89.47%. The epidemiological factors and infection with resistant strains showed no statistical association. By contrast, prior treatment with fluoroquinolones and the degree of injury were found to have a relation with the organism isolated (p <0.05), indicating that P. aeruginosa and S. aureus are involved in serious injury in diabetic patients. .

KEY WORDS: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, resistance to fluoroquinolones, Diabetes Mellitus.

Recibido: Octubre, 2010 Aprobado: Marzo, 2011

La Diabetes Mellitus, afecta a casi 24 millones de personas en Estados Unidos, constituyendo la séptima causa de muerte para esta región.¹ En Venezuela según estadísticas del Ministerio del Poder Popular para La Salud (MPPS, 2006) la mortalidad por alguna complicación de la Diabetes constituye la sexta causa de muerte con 5,91%. ² Esta patología, ocasiona graves complicaciones como enfermedades cardíacas, ceguera, insuficiencia renal y procesos infecciosos en extremidades inferiores1. El llamado "pie diabético", es el resultado de la coexistencia de neuropatía, vasculopatía e infección.³ Este tipo de afeccion, es la principal causa de hospitalización del paciente diabético y conduce con frecuencia a la amputación, por lo que representan un problema de salud pública.⁴

Los pacientes con Diabetes tienen una mayor tasa de colonización por Staphylococcus aureus, lo que aumenta el riesgo de infección como consecuencia de lesiones en la piel o mucosas.⁵ En ese sentido, S. aureus es uno de los principales agentes patógenos en infecciones del pie diabético.⁶ Por otra parte, se ha demostrado que entre las bacterias gram negativas, Pseudomonas aeruginosa se encuentra asociada a infección y ulceras de pie en pacientes diabéticos.^7,8,9 Uno de los principales problemas en las infecciones causadas por P. aeruginosa y S. aureus, es que pueden exhibir un alto grado de resistencia a diferentes familias de antibióticos, entre los que destacan las fluorquinolonas.¹⁰

Las fluoroquinolonas, son antibióticos que bloquean las síntesis de los ácidos nucleicos mediante la inhibición de las enzimas Topoisomerasas de tipo II (en bacterias Gram negativas) y tipo IV (en bacterias Gram positivas), las cuales son necesarias para la replicación, recombinación y reparación del ADN de las bacterias.¹¹ Frente a Gram negativos la fluoroquinolona más potente es la ciprofloxacina, mientras que, la levofloxacina y la moxifloxacina tienen una actividad aumentada frente a Gram positivos.¹² Sin embargo, Pseudomonas, Estafilococos y Enterococos pueden desarrollar resistencia, originada por mutaciones en el sitio diana de acción de estos antibióticos o por la presencia de bombas de eflujo.¹¹

En ese orden de ideas, el porcentaje de resistencia de P. aeruginosa a fluoroquinolonas según el Centro de Control de Enfermedades de Atlanta (CDC), para el año 2000 fue de 27% en unidades de cuidados intensivos.¹³ En Venezuela para el año 2007, según el "Programa Venezolano de Vigilancia de Resistencia a los Antimicrobianos" de 1401 cepas de P. aeruginosa aisladas en el país, 43,45% presentaron resistencia a fluoroquinolonas.¹⁴ En el caso de S. aureus en el año 2008 de 331 cepas aisladas en Venezuela, 21,17% resultaron ser resistentes a este grupo de antimicrobianos.¹⁴

Investigaciones previas han encontrado que la adquisición de infección por P. aeruginosa y S. aureus multirresistentes, puede estar asociada a determinados factores como estancias hospitalarias prolongadas, tratamiento previo con fluoroquinolonas y antibióticos ? - Lactámicos, alteraciones de las barreras protectoras, la edad y la gravedad del paciente.^15,16,17

Por lo antes expuesto, la alta incidencia de Diabetes Mellitus, la mayor susceptibilidad de estos pacientes a contraer infecciones bacterianas por P. aeruginosa y S. aureus, y la alta resistencia reportada a las fluoroquinolonas, se planteó como objetivo de la presente investigación, evaluar la resistencia a Fluoroquinolonas en cepas de P. aeruginosa y S. aureus, aisladas de piel y tejidos blandos en pacientes con Diabetes Mellitus, en el Centro de Atención Regional de Podología (CARPO) Estado Aragua, entre Mayo y Agosto del año 2010. Adicionalmente, se determinaron los posibles factores asociados a adquirir infección por P. aeruginosa y S. aureus, así como, aquellos factores asociados con la resistencia a Fluoroquinolonas.

Fue realizada una investigación descriptiva y de corte transversal. La población fue constituida por todos los pacientes diabéticos que asistieron al Centro de Atención Regional de Podología (CARPO), Estado Aragua en el período Mayo-Agosto de 2010. Se efectuó un muestreo por cuotas para escoger la muestra en estudio. Los criterios de inclusión empleados estuvieron regidos por el grado de lesión según la escala de Wagner,¹⁸ que permite clasificar la lesión en el Pie Diabético según su severidad (tabla 1). Los pacientes cuyo grado de lesión se identificó como 2, 3 ó 4, fueron seleccionados para pertenecer a la muestra. Finalmente, la muestra estuvo representada por un total de 150 pacientes.

Los pacientes que participaron voluntariamente en la investigación, firmaron un consentimiento informado. Seguidamente, se realizó una encuesta epidemiológica, adaptada a la investigación, que permitió incluir las variables objeto de estudio (edad, sexo, antecedentes de hospitalización en el último año, antecedentes de antibioticoterapia con fluorquinolonas y grado de la lesión reportada). El análisis de los datos consistió en frecuencias absolutas y relativas. Se empleó el programa Epi Info versión 3.5.1. Los parámetros estadísticos utilizados fueron Odds Ratio (OR) con límites de confianza del 95%, Chi cuadrado (c²) y la Prueba Exacta de Fisher. Un valor estadísticamente significativo estuvo representado por una p<0,05.

Para la recolección de las muestras de las lesiones en piel y tejidos blandos, se realizó la asepsia correspondiente (limpieza de la zona con gasa y solución salina), con el fin de evitar contaminación con microbiota normal. Posteriormente, se tomó la muestra empleando un Culturette. En el caso de lesiones cerradas, se utilizó una lanceta estéril para realizar una punción y obtener material exudativo. La muestra se introdujo en el medio de transporte Stuart y se trasladó al laboratorio para su análisis bacteriológico.¹⁹

Para la identificación de los microorganismos en estudio (P. aeruginosa y S. aureus), se realizó un cultivo en medios de enriquecimiento y diferenciales poco selectivos (BBL: Agar con Sangre de Carnero al 5% y Agar Mc Conkey respectivamente). Luego de 24 horas de incubación a 35ºC, las colonias con características sospechosas fueron identificadas utilizando las pruebas estandarizadas y recomendadas por la literatura.¹⁹

La resistencia a fluorquinolonas se detectó utilizando el método de Disco-difusión en Agar (método de Kirby Bauer), siguiendo las recomendaciones del Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio.²⁰ Se utilizaron discos BBL de Ciprofloxacina 5μg, Levofloxacina 5μg, Lomefloxacina 10μg, Ofloxacina 5μg. Se emplearon como cepas control de P. aeruginosa la ATCC 27853 y S. aureus ATCC 25923.

Se estudiaron 150 muestras de piel y tejidos blandos de pacientes Diabéticos, que asistieron a la sala de cura del Centro de Atención Regional de Podología (CARPO) Estado Aragua. De estas, 67 muestras (45%) fueron positivas para aislados de S. aureus y P. aeruginosa y las 83 restantes (55%) correspondieron a otros microorganismos.

En las lesiones de piel y tejidos blandos de pacientes diabéticos, el gérmen principalmente aislado fue P.aeruginosa, seguido de especies de Enterobacterias, S. aureus y bacilos gram negativos no fermentadores diferentes a Pseudomonas, mientras que, Enterococcus spp., Micrococcus spp., Estafilococos coagulasa negativa, Streptococcus spp. y bacilos Gram positivos se aislaron con muy poca frecuencia (Figura 1) De tal manera que, P. aeruginosa fue el más frecuente entre los gérmenes Gram negativos y S. aureus el más predominante entre las bacterias Gram positivas.

Posteriormente, se determinaron los perfiles de resistencia frente a fluoroquinolonas (ciprofloxacina, levofloxacina, lomefloxacina y ofloxacina) en los aislamientos de P. aeruginosa y S. aureus. Se encontró una alta resistencia a esta familia de antibióticos. De los 48 aislamientos de P. aeruginosa, 46 (95,83%) resultaron resistentes y solo dos (2) aislados sensibles (4,17%). En relación a S. aureus 17 (89,47%) mostraron ser resistentes a fluoroquinolonas, mientras que, solo dos aislamientos (10,53%) fueron sensibles a fluoroquinolonas. En ese sentido, la resistencia observada para P. aeruginosa fue mayor que la obtenida para los aislados de S. aureus.

La evaluación de la resistencia a cada una de las fluorquinolonas objeto de estudio (ciprofloxacina, levofloxacina, ofloxacina y lomefloxacina) fue elevada. En las cepas de P. aeruginosa fue 95,83% para ciprofloxacina, levofoloxacina y ofloxacina. Sin embargo, el porcentaje de resistencia de P. aeruginosa para lomefloxacina, fue ligeramente más alto (97,83%). Por otra parte, las cepas de S. aureus presentaron una resistencia de 89,47% a todas las fluoroquinolonas probadas.

Una vez determinados los perfiles de resistencia a los microorganismos en estudio, se realizó el análisis de los factores epidemiológicos asociados al microorganismo aislado, donde se encontró que no existe relación alguna con el grupo etario, sexo del paciente y antecedentes de hospitalización previa. Sin embargo, los factores como tratamiento previo con fluoroquinolonas, y el grado de lesión de acuerdo a la escala de Wagner, presentaron asociación con el microorganismo aislado, siendo estadísticamente significativo (p <0,05) (Tabla 2).

La aplicación de Odds Ratio (OR), permitió determinar que tanto P. aeruginosa como S. aureus se encontraban involucrados en las lesiones de mayor severidad (Grado de lesión 3 y 4) con respecto al resto de los microorganismos aislados, con valores de OR superiores a 1 y estadísticamente significativo (p<0,05) (Tabla 3).

En cuanto a la asociación de los factores epidemiológicos y la resistencia a fluoroquinolonas, se obtuvo que grupo etario, sexo y hospitalización previa, arrojaron un resultado de OR>1, sin significación estadística (p> 0,05), lo que indica que la probabilidad de riesgo es baja o inexistente. El tratamiento previo con fluoroquinolonas y el grado de lesión mostraron un riesgo disminuido (OR<1), siendo estadísticamente significativo solo para el grado de lesión (p<0,05) (Tabla 4).

Las infecciones bacterianas son una de las complicaciones habituales en pacientes diabéticos y la causa más frecuente de hospitalización. Este tipo de infecciones, generalmente se localizan en la piel, tejidos blandos, pero no es inusual que el hueso se vea afectado.¹⁵ Los principales patógenos descritos como causantes de infección en lesiones de piel y tejidos blandos en diabéticos son: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, otros bacilos Gram negativos (Enterobacterias) y anaerobios (Bacteroides spp., Peptostreptococcus spp., entre otros).²¹

De los antibióticos más utilizados en la práctica clínica destacan las fluoroquinolonas. Sin embargo, en los últimos años ha aumentado la resistencia por parte de los microorganismos a las mismas.¹⁰ La presencia de microorganismos resistentes a antibióticos, aumentan la morbimortalidad y el costo del tratamiento.²² Adicionalmente, existen tres (3) aspectos que pueden asociarse a un alto riesgo de aparición de microorganismos multirresistentes, entre los que destacan: a) cronicidad; b) tratamiento antibiótico inadecuado y c) hospitalización.²³

En el presente trabajo de investigación, se encontró que el microorganismo aislado con mayor frecuencia en las lesiones de pacientes diabéticos fue P. aeruginosa, mientras que, entre los cocos Gram positivos, S. aureus fue el más predominante. Los resultados obtenidos, concuerdan con otras investigaciones que han reportado que Pseudomonas aeruginosa representó el patógeno más aislado, seguido de S. aureus.^9,24 No obstante, el porcentaje de aislamiento obtenido en esta investigación, fue mayor en comparación con estudios previos.^9,24

La alta frecuencia de aislados de P. aeruginosa, podría relacionarse con su amplia distribución en el ambiente, su capacidad de crecimiento en condiciones de humedad, y ser un patógeno oportunista.^11,25 En ese sentido, los pacientes con pie diabético cumplen las condiciones necesarias como: (I) El desarrollo de la úlcera, y (II) Alteración de las defensas normales del huésped.¹⁵ P. aeruginosa se desarrolla particularmente en úlceras exudativas o tratadas con vendajes húmedos o hidroterapia.¹⁵

En la presente investigación, se encontró que S. aureus fue el más predominante entre los cocos Gram positivos. Resultados similares han sido reportados previamente.²⁴ Otros estudios como el de Johnston (2008), sugirió que dado el alto grado de colonización de este microorganismo en piel, se produce un aumento del riesgo de desarrollar un proceso infeccioso a consecuencia de lesiones.⁵ Otros autores han propuesto que S. aureus es uno de los principales agentes patógenos en infecciones del pie diabético.^{6, 23}

La utilidad clínica de las fluoroquinolonas actualmente está disminuyendo debido a la rápida aparición de cepas resistentes.²⁶ Basados en esto, se determinó la frecuencia de aislados de P. aeruginosa y S. aureus resistentes a esta familia de antimicrobianos. Los resultados obtenidos reflejaron un alto porcentaje de resistencia en cepas de P. aeruginosa (95,83%); y S. aureus (89,47%). El "Programa Venezolano de Vigilancia de Resistencia a los Antimicrobianos" en los años 2007 y 2008, reportó porcentajes más bajos de resistencia a fluoroquinolonas para P. aeruginosa (43,45%) y S. aureus (21,87%)4, en comparación a los obtenidos en el presente estudio.

Por otra parte, la resistencia a ciprofloxacina y levofloxacina en cepas de P. aeruginosa reportada en esta investigación fue 95,83%. Varios autores coinciden en la alta resistencia a estos antibióticos.^27,28 Lujan y colaboradores (2008), reportaron que P. aeruginosa presentaba 57% de resistencia a ciprofloxacina.28 Por otro lado, Martínez y colaboradores (2009), encontraron 68,4% de resistencia para ciprofloxacina y 78,9% para levofloxacina. ²³

En relación a S. aureus, los resultados obtenidos revelaron un alto grado de resistencia (89,47%). Hidalgo y colaboradores (2008), también reportaron alta resistencia a Ciprofloxacina (92,3%) especialmente en aislados meticilino resistentes.²⁹

La alta resistencia observada puede deberse al uso generalizado de las fluoroquinolonas en el tratamiento de diversos procesos infecciosos. En unidades de cuidados intensivos en EEUU, se ha reportado un aumento considerable en la resistencia de P. aeruginosa a ciprofloxacina, asociado con un mayor uso del mismo.³⁰

En relación al análisis de posibles factores epidemiológicos que pudieran estar asociados al microorganismo causante de la infección y la resistencia a fluoroquinolonas, se observó que el tratamiento previo con fluoroquinolonas y el grado de la lesión presentaron una relación estadísticamente significativa (Tabla 2). Barberán (2009),¹⁵ sugiere que en aquellos pacientes que han estado sometidos a tratamiento antimicrobiano, se facilita la colonización e infección por microorganismos multirresistentes, como Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus y que los individuos sometidos a largos periodos de hospitalización son susceptibles a infecciones por este tipo de microorganismos. Sin embargo, en el presente estudio no se encontró asociación epidemiológica con antecedentes de hospitalización previa.

Con respecto a la asociación encontrada entre el grado de lesión y el microorganismo aislado, se encontró que P. aeruginosa y S. aureus representan un factor asociado importante en la producción de lesiones de mayor severidad (Grado 3 y 4) a diferencia del resto de los microorganismos aislados (tabla 3). Este resultado, podría deberse a la presencia de factores y mecanismos de patogenicidad propios de estos gérmenes. En ese sentido, las cepas de P. aeruginosa presentan en su estructura una cápsula de polisacáridos, se caracterizan por ser productoras de biopelículas, piocianina y toxinas, entre otros.¹⁰ Por su parte, Staphylococcus aureus es capaz de producir toxinas como citotoxinas (á, â, ä ã), toxinas exfoliativas y enterotoxinas, que provocan toxicidad celular, estimulación de proliferación de la linfocitos T y mediadores inflamatorios.¹¹

Al hecho anteriormente descrito, se suma la condición del paciente diabético, cuyas barreras de defensa natural se encuentran alteradas, por lo que poseen mayor susceptibilidad de contraer infecciones bacterianas por microorganismos multirresistentes.^15,21

Finalmente, el análisis de factores de riesgo asociados a resistencia a fluoroquinolonas, reveló la existencia de bajo riesgo con respecto al grupo etario, sexo, hospitalización previa, tratamiento previo con fluoroquinolonas y el grado de la lesión, siendo este ultimo estadísticamente significativo (Tabla 4). Estos resultados difieren con otras investigaciones que reportaron que el tratamiento previo con fluoroquinolonas (ciprofloxacina), la estancia hospitalaria y antecedentes de infección, representaban factores asociados al aislamiento de microorganismos resistentes a fluoroquinolonas.^16,31

Se concluye en la presente investigación, que se encontró un alto porcentaje de resistencia a fluorquinolonas en P. aeruginosa y S. aureus, aislados de pacientes diabéticos que asistieron al Centro de Atención Regional de Podología (CARPO) del Estado Aragua. Los análisis estadísticos sugieren que, P. aeruginosa y S. aureus parecen estar asociados a lesiones de mayor grado de severidad en el paciente diabético, a diferencia del resto de los microorganismos. Estos resultados deben llamar poderosamente la atención, ya que indican que es necesario implementar mecanismos de vigilancia bacteriológica en los pacientes con ulcera diabética que asisten a la institución. Las medidas deben incluir: i) La implementación rutinaria de cultivos bacteriológicos en lesiones de pacientes diabéticos. ii) Evaluación de susceptibilidad a otras familias de antimicrobianos, con el fin de ofrecer otras opciones terapéuticas en este tipo de pacientes y iii) Realizar de manera permanente, estudios para detectar resistencia a diferentes familias de antibióticos como medida preventiva.

A la Dra. Esther Machado, Directora del Centro de Atención Regional de Podología (CARPO) del Estado Aragua y a todo el personal que labora en esta institución. Al personal del Dpto. de Microbiología de la Escuela de Bioanálisis. Al personal de la Unidad de Diagnóstico Microbiológico y Parasitológico-Escuela de Bioanálisis-Sede Aragua. A la Profesora Argelia Celis por su asesoría a nivel metodológico. Al Profesor Luis Manuel Pérez por su apoyo en el análisis estadístico.

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