Análisis cuantitativo del crecimiento y cambio morfométrico en poblaciones de Leishmania chagasi y Trypanosoma cruzi mantenidos en cultivos axénicos puros y mixtos

Palabras clave: Leishmania chagasi, Trypanosoma cruzi, morfometría, in vitro.

INTRODUCCIÓN

Leishmania chagasi y Trypanosoma cruzi son los agentes etiológicos de importantes y heterogéneas patologías humanas (WHO, 1990; WHO, 1991) que, además, pueden establecer infecciones simultáneas en mamíferos (incluyendo humanos) de la misma área geográfica (Travi et al., 1994; Corredor-Arjona et al., 1999; Bastrenta et al., 2003; Mendes et al., 2007).

La diversidad de la severidad de la Enfermedad de Chagas y otras infecciones por tripanosomas, entre otras cualidades, ha sido atribuida al pleomorfismo (Andrade, 1985; Brener, 1985; Guzmán-Marín et al., 1999; Ziccardi & Lourenço-de-Oliveira, 1999; Karbowiak & Wita, 2004; Davies et al., 2005), fenómeno que corresponde a la variabilidad celular que expresa un genotipo originando diferentes fenotipos como respuesta acomodaticia a las condiciones ambientales (Overath et al., 1983). Es más, en el torrente circulatorio de los mamíferos pueden coexistir tripanosomas del mismo estadio, reconocibles morfológica y morfométricamente (Urdaneta-Morales, 1983; Tyler et al., 1997; Urdaneta-Morales & Tejero, 1992). En el género Leishmania la situación es un tanto controversial. Urdaneta & Scorza (1982), describieron especies venezolanas de Leishmania con criterios morfométricos, y está bien documentada la heterogeneidad morfológica de los promastigotes en el tubo digestivo de los Phlebotominae (Walters et al., 1989; Killick-Kendrick & Rioux, 1991; Walters et al., 1993; Gossage et al., 2003; Bates & Rogers, 2004), a pesar de lo cual Lukes et al. (2007) establecieron que las leishmanias del grupo donovani son indistinguibles en términos clínicos y morfológicos.

En este contexto de diversidad morfométrica, Rohlf & Marcus (1993) y Adams & Funk (1997) establecieron que, al margen de expresar las características genéticas de los organismos, podría indicar multiplicidad de estadios de desarrollo, diversidad de orígenes geográficos e, incluso, resultaría de la acción de efectos ambientales sobre los organismos. Si bien la heterogeneidad genómica de los Kinetoplastida se ha revisado (Simpson et al., 2006), la diversidad morfométrica ha sido poco considerada.

El estudio de la dimensionalidad de los Trypanosomatidae, incluyendo L. chagasi y T. cruzi, históricamente se ha restringido al registro puntual del tamaño en un momento particular del ciclo de vida (Vickerman, 1976; Vickerman & Preston, 1976; Lom, 1979; Molyneux y Ashford, 1983; Gardiner, 1989; Ashford y Crewe, 2003; Tayler & Engman, 2001; Kochhar, 2004). No obstante, Urdaneta-Morales & Tejero (1992), caracterizaron morfométricamente secuencias pleomórficas en los tripomastigotes hematozoicos de T. rangeli, un parásito que según Guhl et al. (1987), complica las infecciones humanas por T. cruzi.

A pesar de estos antecedentes, el análisis cuantitativo del cambio morfométrico como función del tiempo que se presenta en cultivos puros de L. chagasi y T. cruzi, así como en cultivos mixtos (L. chagasi-T. cruzi) es un tema no investigado que merece atención por cuanto Durán et al. (2009), demostraron que L. chagasi, T. cruzi e isomezclas de L. chagasi y T. cruzi mantenidas in vitro utilizan diferencialmente los sustratos tróficos del medio de cultivo. Así, la caracterización cuantitativa del cambio morfométrico pudiera ser útil en el diseño de estrategias de control de estos importantes parásitos humanos.

Mediante la estimación del crecimiento de las poblaciones y del registro numérico de variables morfométricas indicadas por Hoare (1972), en este trabajo se investigaron las características cuantitativas del cambio morfométrico a lo largo del desarrollo de poblaciones de L. chagasi y T. cruzi mantenidas en cultivos axénicos puros, así como de isomezclas axénicas L. chagasi-T. cruzi.

Se emplearon las cepas MHOM/BR/74/PP75 de L. chagasi e Y de T. cruzi. Los parásitos se mantuvieron en medio bifásico "Brain Heart Infusion" (BHI) con fase líquida de NaCl 0,85% y glucosa 1% a la que se añadieron 0,1 mg/mL de gentamicina, 100 IU/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de estreptomicina y 250 μg/mL de anfotericina B, todo a pH final 7,4 ± 0,2. Los experimentos consistieron en tres grupos: cultivos axénicos puros de L. chagasi, cultivos axénicos puros de T. cruzi y cultivos axénicos mixtos L. chagasi-T. cruzi (1:1).

Interdiariamente durante 35 días, de la fase líquida de cada grupo experimental (L. chagasi, T. cruzi y L. chagasi-T. cruzi) se tomaron 10 μL; con 5μL se cuantificó el crecimiento de las formas viables (Freshney, 1987) en cámara de Neubauer (400x) y con los 5μL restantes se hicieron extendidos sobre portaobjetos que se fijaron (glutaraldehído 0,25% en amortiguador fosfato salino glucosado) y colorearon (Giemsa 10%).

Los extendidos fueron observados en microscopio óptico (1000X) provisto de cámara digital. Siguiendo un patrón de avance sistemático (Gundersen, 1978; Miles, 1978), se registraron 60 promastigotes/extendido en el cultivo puro de L. chagasi, 60 epimastigotes/extendido en el cultivo puro de T. cruzi, así como 30 epimastigotes/extendido y 30 promastigotes/extendido en el cultivo mixto (L. chagasi-T. cruzi). Los argumentos establecidos por Fernández (1996) garantizaron la pertinencia del tamaño muestral y la robustez del análisis estadístico realizado. En cada uno de los parásitos se determinó la magnitud numérica de la longitud total (LT), la longitud corporal sin incluir el largo del flagelo libre (LC), el ancho máximo a nivel del núcleo (A), la distancia que separa el extremo anterior del centro del núcleo (AN), la distancia que se encuentra entre el extremo posterior y el centro del núcleo (PN), la distancia que hay del centro del núcleo al centro del cinetoplasto (CN), la distancia que se encuentra entre el extremo anterior y el centro del cinetoplasto (AC), la distancia que se encuentra entre el extremo posterior y el centro del cinetoplasto (PC) y la longitud del flagelo libre (F), tal cual lo estableció Hoare (1972). Además, se calculó la superficie del núcleo (SN), la superficie del cinetoplasto (SC) y la superficie total sin incluir el flagelo libre (ST).

Si bien los conteos del número de organismos viables por mililitro de sobrenadante se realizaron con todos los estadios observados, el registro dimensional y el cálculo de las superficies sólo se hizo con promastigotes (L. chagasi) y epimastigotes (T. cruzi), ya que la metodología empleada no permite diferenciar interespecíficamente los otros estadios observados (amastigotes, esferomastigotes y formas aberrantes).

La cinética de cambio en la densidad de las poblaciones muestra los picos máximos y mínimos del número de organismos viables/ml, así como el tiempo requerido para alcanzarlos; los resultados sugieren diferencias entre los tres grupos experimentales. Nótese además que la curva correspondiente al cultivo mixto (L. chagasi-T. cruzi) pareciera diferir de sus contrapartes puras. No obstante los rangos de error estándar insinúan similitudes consistentes, al menos en porciones particulares de las curvas (Fig. 1).

Los resultados de la Tabla I, si bien indica diferencias significativas en las medias, no aporta información referente a la dinámica del cambio en sí. En consecuencia, se procedió con un ARTC, ensayo que, mediante el estadístico χ2, estudia la diferencia entre valores observados y esperados (residuos) evaluando la desviación de la hipótesis de independencia u homogeneidad (Bulla, 1981; Bulla, 1995); el ARTC compara cuantitativamente los perfiles de las curvas de la Fig. 1. En el ARTC (Fig. 2) las barras representan los perfiles de las curvas examinadas (L. chagasi, T. cruzi y L. chagasi-T. cruzi). Si el residuo de una barra es 0, la barra no aparece representada. Por su parte, si una barra sobrepasa la línea punteada, implica que existe diferencia significativa en el residual. En la figura también se demuestra que los perfiles de las curvas de la Fig. 1, son diferentes en función del tiempo. La probabilidad asociada al χ2 (P = 0,0003) avala la robustez del análisis.

Con base en la reducción dimensional experimentada, en criterios de significancia estadística (datos no mostrados) y de la preeminencia morfológica que características como longitud total, ancho máximo y distancia núcleo-cinetoplasto tienen sobre la forma de los promastigotes y los epimastigotes, las magnitudes numéricas de las variables LT, A y CN se utilizaron en ensayos biométricos exploratorios como primera aproximación cuantitativa al entendimiento del cambio morfométrico en promastigotes de L. chagasi y epimastigotes de T. cruzi bajo estrés selectivo in vitro.

La Tabla II presenta las medias y el error estándar que las variables LT, A, CN de L. chagasi y T. cruzi alcanzaron en cultivos puros y mixtos.

Ciertamente que los números presentados en la Tabla II son diferentes, pero carecen de significancia estadística. El ANOVA (Sokal & Rohlf, 1995) realizado sobre las medias de las variables LT, A y CN registradas durante 35 días en promastigotes de L. chagasi mantenidos en cultivo puro y mixto, así como en los epimastigotes de T. cruzi presentes en cultivo puro y mixto (Tabla I), demostró diferencias significativas (Tabla III).

El ANOVA probó inequívocamente que existen diferencias entre las medias de las variables LT, A y CN de promastigotes y epimastigotes, pero no aportó información acerca del proceso de cambio que esas variables experimentan a lo largo de los 35 días de cultivo. Es evidente que esta heterogeneidad dimensional resume un proceso natural más complejo enmarcado en el contexto de la historia del decrecimiento de las variables LT, A y CN in vitro, que se debe abordar en un contexto dinámico capaz de explorar y relacionar los patrones de cambio registrados en las variables seleccionadas.

Mediante planos (3D), la Fig. 3 muestra diferencias en las relaciones dinámicas que se establecen entre las variables LT, A y CN de promastigotes de L. chagasi a lo largo de los 35 días de cultivo; el plano de la Figura 3A corresponde a las relaciones en el cultivo puro y el de la Figura 3B en el cultivo mixto.

Los planos 3D que se presentan en la Fig. 4 evidencias las relaciones que aparecen entre las variables LT, A y CN de los epimastigotes de T. cruzi presentes en cultivos puros y en cultivos mixtos en medio BHI; el plano de la Fig. 4A corresponde a las relaciones en el cultivo puro y el de la Figura 4B en el cultivo mixto.

La Fig. 5 muestra cuatro nubes de puntos representadas en un espacio 3D que corresponden a las magnitudes numéricas de las variables morfométricas registradas en los promastigotes de L. chagasi en cultivo puro (nube 1) y mixto (nube 2), así como

de los epimastigotes de T. cruzi en cultivo mixto (nube 3) y puro (nube 4). Los conjuntos numéricos están representados en un espacio reducido 3D en el que destaca la segregación de las nubes, llamando particularmente la atención las correspondientes al mismo estadio en condiciones de cultivo diferente (puro o mixto). También se aprecia mayor separación entre las nubes de L. chagasi (promastigotes en cultivo puro y mixto) que en las de T. cruzi (epimastigotes en cultivo puro y mixto).

Las variaciones observadas en la densidad de las poblaciones de L. chagasi y T. cruzi en cultivos puros, así como de las isomezclas (L. chagasi-T. cruzi), mostraron patrones gráficos, a primera vista disímiles (Fig. 1), caracterizados por picos poblacionales máximos desiguales que aparecen a tiempos diferentes, son particularidades que en el ARTC se representan como barras positivas y negativas que, con significancia estadística, demuestran gráficamente la disparidad de las curvas de variación de la densidad poblacional en la fase líquida del medio BHI (Fig. 2).

La presencia de curvas con picos de densidades poblacionales particulares indicaría la expresión de propiedades morfo-funcionales específicas en los cultivos puros de L. chagasi y T. cruzi, así como en las isomezclas L. chagasi-T. cruzi que gestionarían condiciones fisicoquímicas propias de períodos particulares en un medio ambiente que se modifica en forma continua, deletérea e irreversible por merma de substratos tróficos, modificación del pH (Duran et al., 2009) y acumulación de metabolitos tóxicos o potencialmente tóxicos (Mauel, 1984; Schuster & Sullina, 2002). En consecuencia, los cambios observados en este trabajo confirmarían lo indicado por Tejero et al. (2004), por cuanto resultarían de la expresión de mecanismos moduladores de la forma y la función. Según Tejero et al. (1984), estos comportamientos corresponden a características definidas que, junto a otras propiedades, son específicas de las especies leishmánicas mantenidas in vitro. En este sentido, y conforme a lo demostrado por Duran et al. (2009), las poblaciones de L. chagasi y T. cruzi presentes en cultivos mixtos, utilizan los recursos disponibles en el sobrenadante del medio BHI de forma diferente a como lo hacen al ser mantenidos en cultivos puros en condiciones idénticas.

Las magnitudes numéricas de las variables morfométricas registradas en L. chagasi y T. cruzi, pudiera asociarse con aspectos numerarios meramente taxonómicos de comparación inter-específica que, además, estarían poco relacionados con la dinámica multiviariante de su biología. No obstante, el estudio de la variación dimensional, por ser expresión cuantitativa de la ontogenia de los tripanosomas (Tejero et al., 2008), enriquece la perspectiva, por cuanto permite investigar el dinamismo de las relaciones que se establecen entre las variables morfométricas que, en el transcurso del tiempo, se traduce en la expresión secuencial de fenómenos no excluyentes como aparición de estadios diferentes o de variantes fenotípicas de un estadio particular (pleomorfismo).

Los análisis exploratorios adelantados reflejaron diferencias de magnitud numérica (Tabla II) y de relaciones dimensionales en términos intra-específicos (promastigotes de L. chagasi en cultivo puro y mixto; epimastigotes de T. cruzi en cultivo puro y mixto) e inter-específicos (promastigotes y epimastigotes), pero por no ser pruebas diseñadas para segregar, no suministraron información cuantitativa que permitiera comparar los procesos de cambio morfométrico asociados a promastigotes y epimastigotes sometidos a diferentes fuentes de estrés: competencia intra-específica (cultivo puro) y competencia intra- e inter-específicas (cultivo mixto).

El ACP, además de demostrar discriminación morfométrica inter-específica, una propiedad obvia por cuanto se trata de epimastigotes (T. cruzi) y promastigotes (L. chagasi), prueba taxativamente discriminación morfométrica intra-específica. En efecto, al comparar la dimensionalidad de los promastigotes (L. chagasi) de los cultivos puros con la dimensionalidad de los promastigotes (L. chagasi) de los cultivos mixtos, se aprecian dos nubes de puntos diferentes y separadas. Situación análoga se observa al cotejar las características dimensionales de los epimastigotes (T. cruzi) de los cultivos puros con las medidas de los epimastigotes (T. cruzi) de los cultivos mixtos. Los atributos dimensionales, tanto de promastigotes (L. chagasi) como de epimastigotes (T. cruzi) en los cultivos puros y mixtos, son significativamente diferentes. Bock y Von Wahlert (1965), establecieron que la capacidad de transformación observada en las especies como respuesta a los cambios medioambientales, es un atributo que evita la extinción.

Es bien conocido que los tripomastigotes hematozoicos de T. brucei (Vickerman, 1989), T. rangeli (Urdaneta-Morales & Tejero, 1992) y T. cruzi (Penin et al., 1996), cambian de aspecto en el transcurso de la infección sin dejar de ser tripomastigotes. Al margen del significado adaptativo de dicha transformación, es menester analizar las propiedades del cambio per se desde la óptica de la coexistencia temporal de las formas involucradas. En tal sentido, Reuner et al. (1997), expresaron que la diferenciación de los tripomastigotes delgados de T. brucei en tripomastigotes rechonchos, está relacionada con el número de flagelados, por cuanto limita el tamaño de las poblaciones sin depender de la respuesta inmune del hospedador. Los autores al comparar la diferenciación in vitro e in vivo, concluyen que el cambio in vitro refleja lo acontecido en los procesos naturales. Es más, el significado de los resultados obtenidos in vitro y su relación con resultados similares derivados de experimentos in vivo, ha sido demostrado. Hecker & Brun (1982), establecieron similitudes biológicas entre poblaciones de T. brucei mantenidas in vitro y sus contrapartes mantenidas in vivo y Gamboa et al. (2008) indicaron que los patrones de infectividad in vitro se corresponden con la estructura geográfica de poblaciones de Leishmania.

El éxito evolutivo que han alcanzado los Trypanosomatidae es incuestionable (Vickerman, 1994; Kerr, 2000). En este contexto, la relación forma-función constituye una faceta en la que sería apropiado considerar que la modulación endógena y/o exógena en poblaciones de L. chagasi y T. cruzi constituiría un elemento que, junto a otras características, avalaría la notoriedad adaptativa que han logrado.

El análisis morfométrico-poblacional de L. chagasi y T. cruzi con metodologías multivariantes permitió discriminar poblaciones del mismo estadio (promastigotes de L. chagasi y epimastigotes de T. cruzi) como función del estrés ambiental, por cuanto demuestran propiedades morfométricas y poblacionales disímiles en ambientes diferentes (cultivos axénicos puros y los cultivos axénicos mixtos). El análisis también reveló que tal disparidad es más acentuada en L. chagasi que en T. cruzi, ya que la segregación de los promastigotes es mayor que la observada entre los epimastigotes, demostrando así la interacción-dependencia de la forma y la función en estos Trypanosomatidae. Este planteamiento permite hipotetizar que las características particulares de la leishmaniasis visceral y de la Enfermedad de Chagas pudieran diferir en condiciones de infección natural concomitante L. chagasi-T. cruzi.

1. Adams D. C. & Funk D. (1997). Morphometric inferences on sibling species and sexual dimorphism in Neoclamisus bebianae leaf beetles: multivariate applications of the thin-plate spline. Systematic Biol. 46: 108-194.         [ Links ]

2. Andrade S. G. (1985). Morphological and behavioural characterization of Trypanosoma cruzi strains. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 18(Suppl): 39-46.         [ Links ]

3. Ashford C.W. & Crewe W. (2003). The Parasites of Homo sapiens. Taylor & Francis, London, U.K.        [ Links ]

4. Bates P. D. & Rogers M. E. (2004). New insights into the developmental biology and transmission mechanisms of Leishmania. Curr. Mol. Med. 4: 601-609.        [ Links ]

5. Bastrenta B., Mita N., Buitrago R., Vargas F., Flores M., Machane M., et al. (2003). Human mixed infections of Leishmania spp. and Leishmania-Trypanosoma cruzi in a sub Andean Bolivian area: identification by polymerase chain reaction/hybridization and isoenzyme. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 98: 255-264.        [ Links ]

6. Brener Z. (1985). General review on Trypanosoma cruzi classification and taxonomy. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 18(Suppl): 1-8.        [ Links ]

7. Bock W. & Von Wahlert G. (1965). Adaptation and the form-function complex. Evolution. 19: 296-299.        [ Links ]

8. Bulla L. A. (1981). La vegetación del módulo experimental de Mantecal. Trabajo de Ascenso en el Escalafón Universitario. Facultad de Ciencias. Universidad Central de Venezuela.        [ Links ]

9. Bulla L. A. (1995). El análisis de componentes principales en ecología. Trabajo de Ascenso en el Escalafón Universitario. Facultad de Ciencias. Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela.        [ Links ]

10. Cleveland W. S. (1979). Locally weighted regression and smoothing scatterplots. J. Am. Stat. Assoc. 74: 829-836.        [ Links ]

11. Cleveland W. S. & Devlin S. J. (1988). Locally weighted regression: an approach to regression analysis by local fitting. J. Am. Stat. Assoc. 83: 596-610.        [ Links ]

12. Corredor-Arjona A., Alvarez-Moreno C. A., Agudelo C. A., Bueno M., Lopez M. C., Caceres E., et al. (1999). Prevalence of Trypanosoma cruzi and Leishmania chagasi infection and risk factors in a Colombian indigenous population. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo. 41: 229-234.        [ Links ]

13. Davies A. J., Gibson W., Ferris V., Basson L. & Smit N. J. (2005). Two genotypic groups of morphologically similar fish trypanosomes from the Okavango Delta, Botswana. Dis. Aquat. Organ. 66: 215-220.        [ Links ]

14. Durán C., Quiroga M. F., Díaz-Bello Z., Silva S., Roschman-González A., Strauss M. & Tejero F. (2009). Leishmania chagasi y Trypanosoma cruzi: Conducta trófica en cultivos axénicos puros y mixtos. Bol. Mal. Salud Amb. 49: 97-106.         [ Links ]

15. Fernández P. (1996). Determinación del tamaño muestral. Cuad. Gestión Atención Primaria. 3: 138-141.         [ Links ]

16. Freshney R. (1987). Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. Alan R Liss., New York, USA.        [ Links ]

17. Gamboa D., Torres K., De Doncker S., Zimic M., Arevalo J. & Dujardin J. C. (2008). Evaluation of an in vitro model for experimental infection with Leishmania (Viannia) braziliensis and L. (V.) peruviana. Parasitology. 135: 319-326.        [ Links ]

19. Gardiner P. R. (1989). Recent studies of the biology of Trypanosoma vivax. Adv. Parasitol. 28: 229-317.        [ Links ]

20. Godfrey K. (1985). Comparing the means of several groups. New Engl. J. Med. 313: 1450-1456.        [ Links ]

21. Gossage S. M., Rogers M. E. & Bates P. A. (2003). Two separate growth phases during the development of Leishmania in sandflies: implications for understanding the life cycle. Int. J. Parasitol. 33: 1027-1034.        [ Links ]

22. Guhl F., Hudson L., Marinkelle C. J., Jaramillo C. A. & Bridge D. (1987). Clinical Trypanosoma rangeli infection as a complication of Chagas’ disease. Parasitology. 94: 475-484.        [ Links ]

23. Gundersen H. J. G. (1978). Estimators of the number of objects per area unbiased by edge effects. Microsc. Acta. 81: 107-117.        [ Links ]

24. Guzmán-Marín E. S., Zavala-Castro J. E., Acosta-Viana K. Y. & Rosado-Barrera M. E. (1999). Importancia de la caracterización de cepas de Trypanosoma cruzi. Rev. Biomed. 10: 177-184.        [ Links ]

25. Hecker H. & Brun R. (1984). Comparative morphometric analysis of bloodstream and lymph forms of Trypanosoma (T.) brucei brucei grown in vitro and in vivo. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 76: 692-697.        [ Links ]

26. Jolliffe I. T. (1986). Principal Component Analysis. Springer-Verlag, New York, U.S.A.        [ Links ]

27. Karbowiak G. & Wita I. (2004). Trypanosoma (Herpetosoma) grosi kosewiense subsp. n., the Parasite of the Yellow-Necked Mouse Apodemus flavicollis (Melchior, 1834). Acta Protozool. 43: 173-178.        [ Links ]

28. Kerr S. F. (2000). Paleartic origin of Leishmania. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 95: 75-80.        [ Links ]

29. Killick-Kendrick R. & Rioux J. A. (1991). Intravectorial cycle of Leishmania in sandflies. Ann. Parasitol. Hum. Comp. 66(Suppl 1): 71-74.        [ Links ]

30. Kochhar S. K. (2004). A Textbook of Parasitology. Dominant, New Deli.         [ Links ]

31. Lom J. (1979). Biology of the trypanosomes and trypanoplasms of fish. pp. 269-338. En: Biology of the Kinetoplastida. Vol. 2. Eds. Lumsden W.H.R. & Evans D.A. Academic Press. London, U.K.         [ Links ]

32. Lukes J., Mauricio I. L., Schöninan G., Dujardin J. C., Soteriadou K., Dedet J. P., et al. (2007). Evolutionary and geographical history of the Leishmania donovani complex with a revision of current taxonomy. PNAS. 104: 9375-9380.         [ Links ]

33. Mauel J. (1984). Mechanisms of survival of protozoan parasites in mononuclear phagocytes. Parasitology. 88: 579-592.        [ Links ]

34. Mendes D. G., Lauria-Pires L., Nitz N., Lozzi S. P., Nascimento R. J., Monteiro P. S., et al. (2007). Exposure to mixed asymptomatic infections with Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis and Leishmania chagasi in the hunab population of the greater Amazon. Trop. Med. Int. Health. 12: 629-636.        [ Links ]

35. Miles R. E. (1978). The sampling by quadrants of planar aggregates. J. Microsc. 113: 257-267.        [ Links ]

36. Molyneux D. H. & Ashford R. W. (1983). The Biology of Trypanosoma and Leishmania, Parasites of Man and Domestic Animals. Eds.Taylor & Francis, London, U.K.        [ Links ]

37. Overath P., Czichos J., Stock U. & Nonnengaesser C. (1983). Repression of glycoproteins synthesis and release of surface coat during transformation of Trypanosma brucei. EMBO J. 2: 1721-1728.        [ Links ]

38. Penin P., Gamallo C. & de Diego J. A. (1996). Biological comparison between three clones of Trypanosoma cruzi and the strain of origin (Bolivia) with reference to clonal evolution studies. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 91: 285-291.        [ Links ]

39. Rohlf F. J. & Marcus L. F. (1993). A revolution in morphometrics. Trends Ecol. Evol. 8: 129-132.        [ Links ]

40. Reuner B., Vassella E., Yutzy B. & Boshart M. (1997). Cell density triggers slender to stumpy differentiation of Trypanosoma brucei bloodstream forms in culture. Mol. Bioch. Parasitol. 90: 269-280.        [ Links ]

41. Simpson A. G., Stevens J. R. & Lukes J. (2006). The evolution and diversity of kinetoplastid flagellates. Trends Parasitol. 22: 168-174.        [ Links ]

42. Schuster F. L. & Sullivan J. J. (2002). Cultivation of clinically significant hemoflagellates. Clin. Microbiol. Rev. 15: 374-389.        [ Links ]

43. Sokal R. R. & Rohlf F. J. (1995). Biometry: The principles and practice of statistics in biological research. W. H. Freeman. New York, U.S.A.        [ Links ]

44. Tayler K. M. & Engman D. M. (1991). The life cycle of Trypanosoma cruzi revisited. Int. J. Parasitol. 31: 472-481.        [ Links ]

45. Tejero F., Arispe M. & Silva S. (1984). Growth characteristics of Leishmania spp. in semi-defined and complex media. Rev. Bras. Biol. 44: 417-423.        [ Links ]

46. Tejero F., Duran C. & Rodríguez D. (2004). Morphological Changes in Crithidia. A Density-dependent Model. Proceedings of the IX European Multicolloquium of Parasitology. pp. 127-135.        [ Links ]

47. Tejero F., Roschman-González A., Perrone-Carmona T. M. & Aso P. M. (2008). Trypanosoma evansi: A quantitative approach to the undersatnding of the morphometry-hematology relationship throughout experimental murine infections. J. Protozool. Res. 18: 34-47.        [ Links ]

48. Travi B. L., Jaramillo C., Montoya J., Segura I., Zea A., Goncalves A. & Velez I. D. (1994). Didelphis marsupialis, an important reservoir of Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi and Leishmania (Leishmania) chagasi in Colombia. Am. J. Trop. Med. Hyg. 50: 557-565.         [ Links ]

49. Tyler K. M., Matthews K. R. & Gull K. (1997). The bloodstream differentiation-division of Trypanosoma brucei studied using mitochondrial markers. Proc. Roy. Soc. London B. 264: 1481-1490.        [ Links ]

50. Urdaneta H. & Scorza J. V. (1982). Bases experimentales para la identificaciónde de Leishmania spp. de américa por morfometría de amastigotos. Mem. Inst. Oswaldro Cruz. 77: 335-351.        [ Links ]

51. Urdaneta-Morales, S. (1983). Pleomorphism in trypomastigotes of Trypanosoma cruzi from blood and cell culture. Tropenmed. Parasitol. 34: 225-228.        [ Links ]

52. Urdaneta-Morales S. & Tejero F. (1992). Trypanosoma rangeli (Tejera, 1920): Observations upon pleomorphism. Mem. Inst. Oswaldro Cruz. 87: 511-516.        [ Links ]

53. Walters L. L., Modi G. B., Chaplin G. L. & Tesh R. B. (1989). Ultrastructural development of Leishmania chagasi in its vector, Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae). Am. J. Trop. Med. Hyg. 41: 295-317.        [ Links ]

54. Walters L. L., Irons K. P., Chaplin G. L. & Tesh R. B. (1993). Life cycle of Leishmania major (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) in the neotropical sand fly Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae). J. Med. Entomol. 30: 699-718.        [ Links ]

55. WHO Expert Committee. (1990). Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. 793: 1-158.        [ Links ]

56. WHO Expert Committee. (1991). Control of Chagas’ disease. World Health Organization Technical Report Series. 811: 1-95.        [ Links ]

57. Vickerman K. (1976). The diversity of Kinetoplastida flagellates. pp. 1-34. En: Biology of the Kinetoplastida. Vol.1 Eds. Lumsden W.H.R. & Evans D.A.. Academic Press. London, U.K.        [ Links ]

58. Vickerman K. & PrestonT. M. (1976). Comparative cell biology of the kinetoplastid flagellates. pp. 35-130. En: Biology of the Kinetoplastida. Vol. 1. Eds. Lumsden W.H.R. & Evans D.A. Academic Press. London. U.K.        [ Links ]

59. Vickerman K. (1989). Trypanosome sociology and antigen variation. Parasitology. 99: S37-S47.        [ Links ]

60. Vickerman K. (1994). The evolutionary expansion of the trypanosomatids flagellates. Int. J. Parasitol. 24: 1317-1331.        [ Links ]

61. Ziccardi Z. & Lourenço-de-Oliveira R. (1999). Polymorphism in trypomastigotes of Trypanosoma (Megatrypanum) minasense in the blood of experimentally infected squirrel monkey and marmosets. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 94: 649-653.         [ Links ]