Palabras clave: leishmaniasis visceral, diagnóstico, pruebas de aglutinación, Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi), humanos, Venezuela.

La Leishmaniasis visceral (LV) es una de las manifestaciones más severas de la Leishmaniasis. Es endémica en varias partes de África, India y América Latina causando unos 500.000 casos y más de 80.000 muertes por año (OPS, 1996). Salvo en pocas excepciones, esta enfermedad es causada por parásitos de las especies Leishmania donovani y Leishmania infantum. El agente causal de LV en Venezuela es Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi) (Mauricio et al., 1999).

En nuestro país, representa un problema de salud pública ya que en la última década, se ha reportado un incremento en el número de afectados (aproximadamente 50 casos por año), principalmente niños menores de diez años (Sánchez & Tapia, 2005). Esta enfermedad se ha diagnosticado en focos dispersos en las áreas central, sur este y oeste del país (Zulueta et al., 1999). En la actualidad, el foco endémico mas activo es el estado Nueva Esparta, en el cual se ha señalado un importante incremento en la incidencia de esta enfermedad comparado con la incidencia registrada para las otras entidades federales del país (Zerpa et al.,2002).

El síndrome clínico de LV comprende cuadros de fiebre, pérdida de peso, hepato-esplenomegalia, anemia, leucopenia, hiperglobulinemia con la presencia de anticuerpos específicos o no contra el parásito. Igualmente se observa la presencia de auto-anticuerpos y complejos inmunes en los órganos afectados (Bryceson, 1989; Pearson & Wilson, 1989; Smith et al., 1989). La LV es considerada una enfermedad crónica con alto potencial de letalidad y el éxito de su curación depende del diagnóstico temprano y de la instauración de la terapéutica de forma oportuna y precoz (Abdallah et al., 2004; Adhya et al., 1995; Allain & Kagan 1975). Sin embargo, el diagnóstico de la LV es difícil, el mismo se determina según los antecedentes epidemiológicos del paciente, la clínica, la visualización directa del parásito y los resultados de las pruebas serológicas. Si bien la identificación del parásito en aspirados esplénicos, de médula ósea y ganglios linfáticos, es considerada la prueba de oro en el diagnostico de esta enfermedad, en la practica resulta difícil e inconveniente su aplicación debido a las dificultades en obtener y examinar los tejidos de los pacientes. Por lo que se ha incrementado el uso de los métodos serológicos (Sundar & Rai, 2002). En Venezuela, acorde a los lineamientos de la Organización Panamericana de la Salud (OPS, 2002), las pruebas serológicas constituyen las pruebas confirmatorias que soportan al diagnóstico clínico y epidemiológico.

Entre las pruebas inmunoserológicas mas utilizadas para el diagnostico de LV figuran: el test de ELISA con antígenos crudos y definidos de Leishmania tales como el rK39 (Hommel et al.,1978; Anthony et al.,1980; Singh et al.,1995), test de anticuerpos inmunofluorescentes (IFAT) (Duxbury & Sadun, 1964; Badaró et al., 1983) y el test de aglutinación directa (DAT). Este último, permanece como la herramienta de primera línea en el diagnóstico de la LV en muchos países en vías de desarrollo, ya que es un test sencillo, con altas sensibilidad, especificidad y reproducibilidad, fácil de realizar, sin requerimientos de equipos y materiales especializados (Boelaert et al., 1999a,1999b, Schallig et al., 2001, 2002), no invasivo (Zijlstra et al., 1992) y aplicable para programas y estudios seroepidemiológicos a gran escala (el Harith. et al., 1987). Actualmente se cuenta con el FD DAT comercial (KIT Biomedical Research) el cual en estudios reciente, demostramos su aplicabilidad en el diagnostico de LV en Venezuela (Terán-Ángel et al., 2007; 2010). Sin embargo, el mismo es fabricado con promastigotes de L. donovani; lo cual es una limitación ya que es muy importante considerar la variación antigénica regional que sufre el parásito al interactuar con el vector local y con factores del hospedero; además del costo del test comercial. Por ello nos propusimos desarrollar una prueba de DAT con un antígeno de cepa autóctona de L. infantum (syn. L. chagasi) obtenida de perros de la isla de Margarita, Edo. Nueva Esparta.

Se estudiaron veinte sueros de pacientes residentes del estado Nueva Esparta y diagnosticados con LV por criterios clínicos, epidemiológicos y serológicos (ELISA-rK39 positivo); catorce sueros de pacientes con otras patologías: dos sueros de pacientes con Leishmaniasis cutánea difusa, ocho sueros de pacientes con mal de Chagas, dos sueros de pacientes con tuberculosis (TBC) y dos sueros de pacientes con lupus eritematoso sistémico.

El parásito se cultivó estérilmente usando el medio líquido Schneider`s, pH de 7,2; suplementado con Suero Fetal Bovino al 10% y con antibióticos (20 U/mL de penicilina, 20 mg/mL de estreptomicina y 0,1% de gentamicina) 1x105 parásitos de Leishmania infantum (cepa MCAN/VE/98/IBO-78) fueron cultivados en frascos de cultivo de 10 y 50 mL en oscuridad a 26ºC, hasta llegar a la fase tardía de crecimiento, la cual según nuestras condiciones fue al quinto día de cultivo.

Análisis mediante Curvas de Características Operativas del Receptor (Curvas ROC): Con los títulos de anticuerpos resultantes para los sueros ensayados con los dos test de aglutinación evaluados, se ordenaron los datos (resultados de distribución discreta politómica) y se construyeron tablas de contingencia 2x2 para cada punto de corte (título de anticuerpo) posible. Se determinó la sensibilidad, definida como la probabilidad de detectar a los verdaderos positivos; y especificidad, definida como la probabilidad de detectar a los verdaderos negativos, en cada punto de corte a fin de graficar la dispersión de pares (1-especificidad, sensibilidad) y obtener las curvas ROC (Goodenough et al., 1974; Burgueño et al., 1995) del test desarrollado (DATv) y del FD-DAT. Las curvas ROC fueron analizadas por el programa informático EpiDat v.3.1 (OPS, Xunta de Galicia, España). Para cada una se determinó: el Área Bajo la Curva (ABC), la cual define la probabilidad de que el resultado de la prueba evaluada resulte más alterada en un individuo enfermo en comparación a uno sano; y el error estándar asociado al ABC; además de sus respectivos intervalos de confianza. Por otra parte, se evaluó mediante una prueba χ2 la homogeneidad de las áreas, a fin de determinar las similitudes entre los dos test de aglutinación.

Análisis de validez y seguridad de la pruebas: A partir de los resultados obtenidos y empleando los puntos de corte determinados según las curvas ROC, se construyó para cada prueba una tabla de contingencia 2x2, que fueron analizadas a fin de establecer los parámetros de validez y seguridad. Dichos parámetros fueron calculados aplicando las correcciones para la evaluación de pruebas diagnósticas con patrones de referencia imperfectos (Silva, 1988; Valenstein, 1990), se empleó como patrón de referencia a la prueba de ELISA –rK39, cuyas especificidad y sensibilidad, han sido reportadas, ambas, alrededor del 97% (Burn et al., 1993; Qu et al., 1994; Zijlstra et al., 1998; Ozensoy et al., 1998; Sreenivas et al., 2002; Singh et al., 2002; Salotra et al., 2003). Se determinaron los parámetros sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (probabilidad de que un sujeto esté enfermo dado que resultó positivo en el test), valor predictivo negativo (probabilidad de que un sujeto esté sano dado que resultó negativo en el test) y razón de verosimilitud (probabilidad de un resultado particular en enfermos en base a la probabilidad del mismo resultado en sanos), además de sus respectivos intervalos de confianza. Los análisis estadísticos se realizaron usando los programas informáticos EpiDat v.3.1 (OPS, Xunta de Galicia, España) y "Calculadora Pruebas Diagnósticas" v. 1.0.2 (Unidad de Bioestadística Clínica, Hospital Ramón y Cajal, España).

Al establecer los puntos de corte para cada prueba, los resultados de los títulos de anticuerpos se agruparon en tres categorías: controles, enfermos de LV y otras patologías (Fig. 2). Como puede observarse, todos los pacientes con LV confirmada fueron positivos para ambos test. Se presentaron falsos positivos en otras patologías; sin embargo la reacción cruzada fue menor en nuestro ensayo (DATv: en TBC aglutinantes 0/2 y en tripanosomiasis 1/8, FD-DAT: en TBC aglutinantes 2/2 y en tripanosomiasis 4/8), además hubo menos falsos positivos en el grupo de controles.

La Tabla II representa los parámetros de validez de las pruebas. Se observa que ambos tests presentan sensibilidad de 100%, mientras que la especificidad del DATv es considerablemente mayor en comparación con el FD-DAT (98,78% y 82,85% respectivamente). Los demás parámetros determinados también fueron superiores en el DATv con respecto al FD-DAT.

En las últimas décadas, en Venezuela, se ha observado un incremento en la incidencia de LV, particularmente en los estados Falcón, Lara, Guárico, Anzoátegui, Delta Amacuro, Sucre y Nueva Esparta. Éste último se ha convertido en un foco muy importante en el país (Zulueta et al.1999, Zerpa et al., 2002), ya que es en esta entidad donde se ha registrado un mayor porcentaje de perros infectados que actúan como reservorio natural de la enfermedad. De igual modo, se ha evidenciado que la mayoría de los casos de infección se producen en niños de 0 a 9 años de edad; hecho dramático que impulsa el desarrollo de técnicas rápidas y certeras de diagnóstico para evitar las repercusiones de la LV en los niños (Zerpa et al., 2003).

Hasta el presente dos institutos en el mundo ofrecen comercialmente dos antígenos para el test de aglutinación directa; estos son: el Instituto de Medicina Tropical del Príncipe Leopoldo de Antwerp, Bélgica y el del Instituto de Medicina Tropical de Ámsterdam, Holanda, (Biomedical Research). Ambas pruebas comerciales están fabricadas con un antígeno preparado a partir de promastigotes de L. donovani MHOM/SD/68/1S (Meredith et al., 1995). Éste ha sido evaluado en numerosas regiones endémicas de LV alrededor del mundo incluyendo a nuestro país (Terán-Ángel et al., 2007) y ha presentado sensibilidad y especificidad variables en cada una de ellas. En un metanálisis realizado en el año 2006 para evaluar el desempeño del FD-DAT desde su introducción al diagnóstico de LV desde 1986 hasta 2004; se concluyó que a pesar de presentar en la mayoría de los casos sensibilidad mayor del 90% y especificidad comúnmente cercana al 100%, es necesaria la determinación de estos parámetros en las zonas endémicas en las que se inicia su empleo debido a la heterogenicidad de ambos valores con respecto a la localización geográfica de los estudios (Chappuis et al., 2007). En ese contexto, es importante considerar la variación antigénica regional que sufre un parásito en sus epítopes al interactuar con el vector local y con factores de los hospedadores. Por ello, nos propusimos desarrollar una prueba de aglutinación directa empleando como antígeno promastigotes de L. infantum de la isla de Margarita, Edo. Nueva Esparta; que además, abarataría los costos de adquisición del kit frente al existente. Más aún, nuestro test sería más accesible en el medio rural en el cual predomina la enfermedad en el país; además de impulsar la producción nacional.

Clásicamente, la exactitud de una prueba diagnóstica se ha evaluado en función de la sensibilidad y la especificidad, sin contar que éstas varían en función del punto de corte o "cut-off" elegido como criterio discerniente entre la población sana y la enferma. Este hecho se ha convertido en un determinante de la evaluación del FD-DAT, puesto que se han empleado numerosos puntos de corte en las diversas investigaciones: 1:800 (Singla et al., 1993; Silva et al., 2005; Terán-Ángel et al., 2007), 1:1600 (el Harith et al., 1986; Meredith et al., 1995), 1: 6400 (el Harith et al., 1988), 1:3200 (Mohebali et al., 2006); entre otros. Por lo tanto, se empleó una forma más global de conocer la calidad de la prueba diagnóstica desarrollada en un espectro de puntos de corte posibles: la curva ROC (Goodenough et al., 1974), la cual es un instrumento con capacidad discriminativa, entre las condiciones de sano y enfermo, en una prueba a lo largo de todos los puntos de corte permitidos. Esto dibuja una curva en un sistema de ejes cartesianos. En el eje de ordenadas se ubican distintos valores de sensibilidad y en las abscisas las tasas de falsos positivos (1- especificidad), reflejando todos los pares de sensibilidad/especificidad para cada punto de corte (Domínguez Alonso & González Suárez, 2002). Por tanto, el valor de sensibilidad aumenta a medida que la especificidad disminuye. Estas gráficas son útiles para relacionar el equilibrio entre sensibilidad y especificidad de una prueba y permitir decidir cuál es el mejor punto de corte (Streiner & Cairney, 2007) sin que el análisis sea afectado por la distribución paramétrica o no paramétrica de los resultados.

En nuestro trabajo, los descriptores permitieron la comparación entre los dos test de aglutinación, estos fueron: Área Bajo la Curva (ABC), definida como la probabilidad de que el resultado de la prueba evaluada resulte más alterada en un individuo enfermo (Burgueño et al., 1995). Su rango varía entre 1 (discriminación perfecta) y 0,5 (la prueba no es capaz de discernir enfermos de sanos con buena precisión diagnóstica) (Domínguez Alonso & González Suarez, 2002). Puesto que este parámetro es estimado, existe un error estándar asociado denominado EE (Streiner & Cairney, 2007). En esta investigación y, a pesar de que ambos test dibujan una curva ROC muy por encima de la diagonal que refleja el 0,5 de discriminación diagnóstica, se obtuvo una mayor ABC para el test desarrollado (DATv) en comparación con el ABC resultante del FD-DAT, implicando una mayor precisión diagnóstica del primero, específicamente en los focos endémicos de Nueva Esparta, Venezuela, evaluados.

Por otra parte, se tiene la evaluación de Homogeneidad de las áreas p, que establece las similitudes entre áreas de dos curvas trazadas, siempre que ambas presenten coincidencias en sus resultados. Mientras este valor se aproxime a 1, mayor será la homogeneidad de las ABC de los ensayos comparados (Francia et al., 2006). En este caso, la homogeneidad de las ABC de ambos ensayos dista mucho de 1, planteándose así que existen discrepancias importantes en cuanto a sensibilidad y especificidad entre los tests a considerar.

Una vez determinados los puntos de corte de cada prueba de aglutinación y con los resultados obtenidos de títulos de los sueros evaluados, se construyeron tablas de contingencia 2x2, considerando la corrección asociada a un patrón de referencia imperfecto (Valenstein, 1990): ELISA-rK39, a fin de determinar sensibilidad, especificidad, valores predictivos y razón de verosimilitud de las dos pruebas. La validación de herramientas diagnósticas para LV deberían basarse en la comprobación parasitológica como método de referencia; sin embargo, ésta no es siempre posible de realizar; además de tampoco ser un patrón diagnóstico perfecto (depende de la carga parasitaria, el material obtenido por aspirado y la experticia del observador) (Zijlstra et al., 1991). Por tanto, la OPS considera de igual relevancia y precisión el ELISA basado en antígeno rK39 (OPS, 2002). Para esta técnica se ha reportado una especificidad y una sensibilidad ambas de 97%, lo que lo convierte en un patrón de referencia imperfecto al emplearse para la evaluación de métodos diagnósticos de LV. Por lo tanto, y siendo ese el caso en esta investigación se deben emplear las fórmulas de sensibilidad, especificidad, valores predictivos y razón de verosimilitud ajustadas a esta condición del patrón o "gold standard".

Tanto FD-DAT como DATv presentaron una sensibilidad del 100%, como se ha reportado anteriormente en Etiopía, Kenya y Brasil (el Harith et al., 1986; Schallig et al., 2002; Silva et al., 2005; Da Silva et al., 2006) lo que refleja la capacidad de los ensayos en la detección de los casos de LV.

Para ambas pruebas se evidenciaron resultados similares para el grupo de enfermos, cuyos títulos se mantuvieron por encima del punto de corte 1:400 (DATv) ó 1:800 (FD-DAT), afirmando así el diagnóstico positivo que presentaba el paciente. Sin embargo, se presentaron falsos positivos en otras patologías: en el FD-DAT hubo reacción cruzada con mal de Chagas, LUPUS y tuberculosis, como se ha reportado en Brasil (Silva et al., 2005) y Kenya (el Harith et al., 1986) para mal de Chagas y en India para tuberculosis (Kumar et al., 2006); mientras que en DATv solamente se presentar reacción cruzada con los sueros de mal de Chagas. En otros estudios evaluando el FD-DAT no evidencian ninguna reacción cruzada (Meredith et al., 1995; Schallig et al., 2002); sugieren que para las zonas endémicas de LV, también endémicas para tripanosomiasis, se debe elevar el punto de corte del ensayo (Harith et al., 1986), lo cual puede acarrear falsos negativos. La reacción cruzada presentada por el DATv y por FD-DAT con mal de Chagas no afecta la validez de los resultados, ya que se debe tomar en consideración que ambas enfermedades son causadas por parásitos de la misma familia (por lo que es probable que compartan antígenos) además de que las manifestaciones clínicas de estas parasitosis son suficientemente disímiles entre sí, por lo que en el diagnóstico diferencial predomina la clínica. Más es importante mencionar que la isla de Margarita, estado Nueva Esparta no se considera zona endémica para tripanosomiasis (Añez et al., 2004), lo que incrementa el valor diagnóstico del test desarrollado frente al existente. Además en DATv hubo menos falsos positivos en el grupo de controles, por lo que resulta una mayor especificidad de éste comparado con el FD-DAT: DATv obtuvo 98,78% y el FD-DAT 82,85%. En referencia a los valores predictivos positivos, se favorece aún más el DATv con un valor de 98,13% versus 78,64% del FD-DAT. Y la razón de verosimilitud de 86,42% del DATv en comparación con el 6,08% del FD-DAT, implica que en referencia a la prevalencia de la enfermedad en la población, el DATv es mejor que el FD-DAT para el diagnóstico de LV en el foco estudiado. Se han reportado con anterioridad disminuciones en la sensibilidad y especificidad del FD-DAT fuera de Asia y África (Chappuis et al., 2007). A pesar de considerarse comparables, en estudios anteriores se ha obtenido mayor sensibilidad y especificidad con el antígeno acuoso que con el liofilizado (Abdallah et al., 2004; Sundar et al., 2006), lo que sugiere que durante el proceso de liofilización el antígeno resulta afectado.

Es importante reiterar que el DATv es válido por su alta sensibilidad y especificidad como criterio para diagnosticar LV en el estado Nueva Esparta, Venezuela. Estos resultados permiten afirmar que existe respuesta de anticuerpos contra antígenos propios de especie de Leishmania infantum vs Leishmania donovani en el país, implicando la "regionalización" del parásito al entrar en contacto con los hospederos de la isla de Margarita; esto se puede aprovechar para el desarrollo de test serológicos más sofisticados de los existentes en el mercado preparados con promastigotes de L. donovani.

Este trabajo fue financiado por el proyecto grupal de FONACIT Nº G2005000375.

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