1 Departamento de Parasitología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo Sede Aragua, Maracay, estado Aragua, Venezuela.

2 Instituto de Investigaciones Biomédicas “Dr. Francisco Triana-Alonso” (BIOMED) Universidad de Carabobo Sede Aragua, Maracay, estado Aragua, Venezuela.

3 Laboratorio de Microscopía Electrónica, Centro de Investigación y Análisis Docente Asistencial Núcleo Aragua (CIADANA), Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo Sede Aragua, Maracay, estado Aragua, Venezuela.

*Autor de correspondencia: elizabeth.ferrer@gmail.com

RESUMEN

La toxocariasis o síndrome de larva migrans visceral es causada por un nemátode del género Toxocara, parásito de animales domésticos (perros y gatos). El hombre es un hospedador accidental, al contaminarse con huevos embrionados del parásito. Las larvas invaden la pared intestinal y son transportadas a vísceras, musculatura o globo ocular, donde son atacadas por una reacción granulomatosa del hospedador. El diagnóstico de la enfermedad es complicado debido a la sintomatología inespecífica y que las larvas solo pueden ser evidenciadas por biopsias, que es un método invasivo. Los métodos inmunológicos son una alternativa, en tal sentido en esta investigación se planteó como objetivo estandarizar una técnica inmunológica para la determinación de anticuerpos anti-T.canis para el diagnóstico de toxocariasis humana. Los parásitos adultos expulsados por cachorros infectados se identificaron por microscopia óptica y electrónica, se obtuvieron los huevos, los cuales se hicieron embrionar para la liberación de las larvas, y éstas se mantuvieron en cultivo, para luego obtener y purificar los antígenos de excreción/secreción. Se estandarizaron las condiciones de reacción de la ELISA, obteniéndose como concentraciones óptimas 2 μg/mL de antígeno, dilución de suero y conjugado fueron de 1/400 y 1/20000 respectivamente. Los índices diagnósticos fueron: sensibilidad 100%, especificidad 98,9%, valor predictivo positivo 94,4% y valor predictivo negativo 100%. Con la técnica estandarizada se pudieron diferenciar los sueros de pacientes con Toxocariasis, con respecto a los de pacientes con otras helmintiasis y muestras de suero de individuos sanos, logrando el diagnóstico de Toxocariasis humana.

Palabras clave: Toxocariasis, ELISA, Toxocara canis,Inmunodiagnóstico, Antígeno de Excreción/Secreción.

SUMMARY

The toxocariasis or visceral larva migrans syndrome is caused by a nematode of the genus Toxocara, a parasite of domestic animals (dogs and cats). Man is an accidental host, by oral contamination with embryonated eggs of the parasite. The larvae invade the intestinal wall and are transported to the viscera, muscle or eyeball, where they are attacked by a granulomatous reaction of the host. The diagnosis of the disease is complicated by nonspecific symptoms and the larvae can only be demonstrated by biopsy which is an invasive method. Immunological methods are an alternative. The objective of this study was standardizing an immunological technique for the determination of anti-T. canis antibodies for diagnosis of human Toxocariasis. We identified by optical and electron microscopy, adult worms expelled by infected pups and we obtained eggs, which became embryos that released the larvae. These were maintained in culture. Excretion/secretion antigens (E/S) were purified from the culture. Subsequently, we standardized reaction conditions of the ELISA technique, obtaining as optimal concentrations 2 mg/mL of antigen, serum dilution and conjugate 1/400 and 1/20000 respectively. With the standard technique we evaluated 17 serum samples from patients with confirmed Toxocariasis, 50 patients with other helminth infections and 40 healthy individuals. The diagnostic indexes were sensitivity 100%, specificity 99%, 94% positive predictive value and negative predictive value 100%. The diagnostic indexes obtained show that the ELISA using excretion/secretion antigen of the parasite is suitable for immunodiagnosis of human Toxocariasis.

Key words: Toxocariasis, ELISA, Toxocara canis, Immunodiagnosis, Excreted/Secreted antigen

Recibido el 28/11/2011 Aceptado el 11/03/2012

INTRODUCCIÓN

Toxocara canis desarrolla un ciclo de vida completo en el perro cachorro menor de 5 meses. La infección comienza con la ingesta de huevos embrionados que se encuentran en el suelo, los cuales eclosionan y liberan sus larvas, una vez que llegan al intestino delgado, éstas migran hasta los pulmones, pasando por el árbol bronquial donde son deglutidas, hasta llegar nuevamente al intestino, donde alcanzan el estadio adulto. Una vez ocurrida la fecundación, se liberan huevos no embrionados con las heces del perro y el desarrollo del embrión ocurre en el suelo (Noemi & Rugiero, 2001; Manson et al., 2003).

El hombre es un hospedador accidental, siendo los niños los más afectados debido a sus hábitos de juegos en parques y patios de casa contaminados con huevos del parásito (Delgado & Rodríguez, 2009). En este caso, no se da el desarrollo completo de T. canis, sólo sobrevive el estadio larvario. La infección sobreviene cuando el humano ingiere los huevos embrionados del parásito. Las larvas libres invaden la pared intestinal, entran en las vénulas mesentéricas o por los vasos linfáticos y son transportadas principalmente a hígado, pulmón, cerebro, globo ocular, musculatura etc. Las larvas son atacadas por una reacción celular del hospedador, de naturaleza granulomatosa. De este modo se produce una patología conocida como Síndrome Larva Migrans Visceral (SLMV) o Síndrome Larva Migrans Oftálmica (SLMO) en el caso que afecte al globo ocular (Despommier, 2003; Delgado & Rodríguez, 2009).

Actualmente el diagnóstico se fundamenta en la sospecha clínica, antecedentes de geofagia, contacto con caninos y las técnicas inmunológicas, pero en Venezuela generalmente no se realiza el diagnóstico inmunológico en los laboratorios de rutina, solo en pocos laboratorios de referencia, como el Instituto de Medicina Tropical de la UCV, y algunos laboratorios privados donde se utilizan kit comerciales muy costosos. Debido a lo anteriormente expuesto, el objetivo principal del presente trabajo fue la estandarización de una técnica inmunológica para el diagnóstico de dicha infección y que pueda ser utilizada en estudios epidemiológicos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se obtuvieron 56 parásitos adultos, expulsados por 6 cachorros infectados (33 hembras y 23 machos). Se seleccionaron cachorros que estuvieron expuestos a la infección de manera natural, a los cuales se les aplicó tratamiento desparasitante y se recogieron las heces con los parásitos expulsados.

Para la determinación de la concentración óptima del antígeno E/S de T. canis se probaron concentraciones desde 2 a 8 μg/mL (2, 4, 6, 8 μg/ mL) diluidos en tampón carbonato–bicarbonato a pH 9,6. Para determinar la dilución óptima de los sueros se realizó la técnica de ELISA con el antígeno a la concentración óptima determinada previamente, empleando diferentes diluciones de suero desde 1/50 hasta 1/800 (1/50, 1/100, 1/200, 1/400 y 1/800). Para determinar la dilución óptima del conjugado antiinmunoglobulina humana IgG acoplada a peroxidasa, se realizaron diferentes diluciones desde 1/10000 hasta 1/30000 (1/10000, 1/15000, 1/20000, 1/25000 y 1/30000). Para estas titulaciones se utilizaron sueros controles positivos y negativos para anticuerpos anti-T. canis en todos los casos. La concentración óptima de antígeno y las diluciones óptimas de sueros y conjugado fueron aquellas en la cuales se obtuvo mayor diferencia entre los sueros controles negativos y positivos.

El punto de corte se realizó aplicando la técnica de ELISA utilizando las condiciones óptimas determinadas. Se utilizaron los sueros controles negativos y el punto de corte fue el valor de la media más 3 desviaciones estándar ( + 3 DS). Todos aquellos valores que se encontraron por encima del punto de corte fueron considerados positivos (+) y los que se encontraron por debajo negativos (-). Todas las muestras que se ubicaron ±10% del punto de corte se estimaron como dudosas.

con 100 μL de solución tampón fosfato salino y albúmina al 1% (PBS-BSA por sus siglas en inglés Phosphate Buffer Saline-Bovine Serum Albumin), y fueron incubadas a 37ºC durante 45 minutos. Se lavó siguiendo el procedimiento ya descrito. Se colocaron en los pocillos 100 μL de cada suero, a las diluciones que se establecieron experimentalmente, y se incubaron a 37ºC durante 45 minutos. Se lavó de igual forma y se agregaron 100 μL del conjugado anti-IgG humana acoplado a peroxidasa (Pierce) a la dilución óptima establecida e incubo a 37 °C durante una hora. Se lavaron las placas de la forma antes descrita y se añadió 100 μL del sustrato ABTS (por sus siglas en inglés Azinobis 2.2 ácido 3-ethylbenzthiazoline-6-Sulphonic)

en tampón citrato-fosfato-perborato a pH 7,0 y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos aproximadamente. Posteriormente se efectuó la lectura de absorbancias a 405 nm, utilizando el lector de ELISA (Multiskan Ascent).

Se determinaron los índices diagnósticos de sensibilidad (S), especificidad (E) y valores predictivos positivos (VPP) y negativos (VPN), según las siguientes fórmulas: S=VP/VP+FN x 100, E= VN/VN+FP x 100, VPP, VPP=VP/VP+FP x 100 y VPN=VN/VN+FN x 100 (VP= verdaderos positivos FN= falsos negativos VN= verdaderos negativos FP= falsos positivos) (Greenberg et al., 2002).

Todas las muestras utilizadas fueron colectadas para otros proyectos de investigación, con aval del respectivo Comité de Bioética y provenientes de individuos que mediante consentimiento informado aceptaron que sus muestras fuesen empleadas para otros fines, siempre y cuando fuesen de investigación.

RESULTADOS

Identificación de los parásitos adultos Los parásitos adultos expulsados por los cachorros infectados se identificaron mediante microscopia óptica y Microscopia Electrónica de Barrido (MEB).

Mediante microscopia óptica se observaron vermes de un tamaño aproximado de 5 a 10 cm de longitud, de color blanco marfil y cutícula anillada, a través del microscopio estereoscópico se pudo observar en la región cefálica dos expansiones laterales de la misma cutícula en forma de aletas. La diferencia entre macho y hembra se aprecia por el tamaño, siendo la hembra más grande, alcanzando una longitud de 10 cm en algunos especímenes y el extremo caudal ligeramente más fino terminando en una punta roma. Los machos se diferencian por ser más pequeños y delgados, midiendo entre 5 a 7 cm de longitud y en el extremo caudal se observa una espícula (Fig. 1).

También se realizó la identificación del parásito a través de microscopia electrónica de barrido. Como se aprecia en la Fig. 2, se pudo observar un nematode de gran tamaño, con aletas cervicales (Fig. 2a y 2c) y prominentes labios (Fig. 2b y 2c). El parásito está recubierto por una cutícula que presenta pequeñas depresiones, en forma de anillo (Fig. 2d). Machos y hembras se distinguen por su variable tamaño entre ambos, siendo la hembra más grande y su extremo caudal en forma de fino apéndice (Fig. 2e). El macho se observa de contextura más fina, más pequeño y en su extremo caudal se aprecia una espícula bien definida (Fig. 2f).

Todas las características descritas nos permitieron identificar como Toxocara canis a los parásitos recuperados.

Después de 45 días de incubación de los huevos liberados a partir de la disección de los úteros de los parásitos adultos, se obtuvo 70% de huevos embrionados en todos los lotes. (Fig. 3 a-d). Luego de la ruptura de las cubiertas de los huevos, se obtuvo la liberación de las larvas, las cuales se lavaron y se mantuvieron en medio líquido para cultivo (Fig. 3e).

Después de 7 días de cultivo de las larvas, se colectó el sobrenadante, obteniéndose 8 lotes de cultivo con 10 mL cada uno (80 mL). Este volumen se concentró 10 veces mediante liofilización y se purificó por diálisis. Se determinó la concentración de proteínas mediante el método de Bradford (micrométodo), obteniéndose 1,64 mg/mL.

Luego de obtenido el Antígeno E/S se procedió a determinar las condiciones óptimas para el desarrollo de la técnica. La concentración óptima deAg E/S fue de 2 μg/mL donde se obtuvo mayor diferencia entre los sueros controles negativos y positivos. La dilució ótima de sueros utilizando el Ag de E/S de T. canis fue de 1/400, mientras que la dilución óptima del conjugado anti-Inmunoglobulina Humana IgG acoplada a peroxidasa, fue de 1/20000. Estas fueron las condiciones donde se apreció mayor diferencia entre los sueros controles positivos y negativos. Por otro lado, se realizaron lecturas cada 5 minutos durante una hora, observando el tiempo de reacción óptimo a los 20 minutos. Una vez obtenidas las condiciones óptimas de trabajo se procedió a determinar el punto de corte, el cual fue de 0,200 (valor de + 3 DS).

DISCUSIÓN

Para lograr la liberación de las larvas, los huevos embrionados fueron lavados, pasados por cloro y colocados en recipientes con perlas de vidrio para romper las cáscaras. Una vez liberadas las larvas fueron colocadas en medio líquido para cultivo, sin retirar previamente las cáscaras, hecho que no afectó el óptimo desarrollo del cultivo. El medio RPMI solo contenía aminoácidos, lo que permitió obtener exclusivamente proteínas del parásito.

A partir de los cultivos se recuperaron 80 mL de sobrenadante, menor cantidad que la obtenida por Espinoza et al. (2003), los cuales obtuvieron 200 mL, ya que partieron de mayor número de larvas. Posteriormente el sobrenadante fue liofilizado para concentrarlo y luego dializado para purificarlo, obteniendo una concentración de Ag de E/S de 1,64 mg/mL, a diferencia del proceso realizado por Morales (1999) donde se mantuvo el cultivo por seis meses, no se dializó y se obtuvo una concentración proteica de Ag E/S de 1 mg/mL, aunque por supuesto con mayor volumen de antígeno.

Robertson et al. en 1989 realizaron un estudio sobre las enzimas proteolíticas secretadas por las larvas de T. canis cultivadas in vitro y afirman que varias especies de nemátodes incluyendo Toxocara presentan actividad proteasa en los productos de excreción/secreción. Estas proteasas secretadas in vitro son capaces de degradar componentes del antígeno, perdiendo este la capacidad de reacción en las pruebas inmunológicas, por lo que se agregó inhibidores de proteasas al antígeno E/S de T. canis ya purificado para poder conservarlo.

En la estandarización del ELISA, la concentración óptima de antígeno fue 2 μg/mL, una cantidad mínima en comparación con la utilizada por Espinoza et al. (2003) de 50 μg/mL, lo que demuestra la elevada reactividad del antígeno obtenido. La dilución del suero fue 1/400, una dilución favorable dado que se necesita muy poca cantidad de muestra para aplicar la técnica, tomando en consideración que la mayoría de los pacientes afectados por esta parasitosis son niños en edad preescolar cuya obtención de muestra es más complicada.

Los resultados de la técnica con los sueros controles positivos demostraron una alta sensibilidad. Aunque las muestras eran de pacientes residentes en España, estos eran todos inmigrantes latinoamericanos, con poco tiempo de residencia en España, donde recientemente se ha observado la detección de toxocariasis en inmigrantes (Turrientes et al., 2011). Es importante resaltar que aunque es común en Latinoamérica el poliparasitismo y las infecciones con diferentes tipos de helmintos que pudiesen dar reactividad cruzada, en este caso, podemos afirmar que se trata de infección solo por Toxocara sp., debido al exhaustivo diagnóstico de los pacientes. Se utilizaron esas muestras precisamente por ese diagnóstico certero, para poderlas utilizar como verdaderos controles positivos y no incurrir en el uso de falsos positivos para la valoración de la técnica. En este primer trabajo se demuestra que los sueros de los pacientes con toxocariasis son capaces de reconocer los antígenos de T. canis preparados, de manera que la técnica podría ser usada para trabajos posteriores, analizando previamente la reactividad en muestras no tan controladas, donde quizás sería necesaria una previa absorción de los sueros con antígenos de Ascaris sp. como ha sido sugerido por varios autores (Roldán et al., 2006; Manson et al, 2003).

Se aplicó la técnica de ELISA con sueros de individuos con otras parasitosis evaluando la capacidad discriminatoria del antígeno, los resultados demostraron que solamente se observó un caso estimado como sospechoso con el suero de un paciente infectado con esquistosomiasis, obteniéndose un ELISA altamente específico. Por supuesto, aunque en los sueros heterólogos evaluados, no se observó casi reactividad cruzada, para estudios posteriores es necesaria la evaluación de mayor cantidad y diversidad de muestras de individuos con otras helmintiasis. Es importante resaltar, que aunque se trabajó con antígeno de T. canis, la toxocariasis puede ser también producida por T. catis y dada la similitud antigénica de estos parásitos (Nunes et al., 1999), se podría esperar que la técnica podría ser de utilidad en los casos de toxocariasis por T. catis.

Los índices diagnósticos obtenidos en la prueba estandarizada son elevados y adecuados, comparados con los que han sido reportados en términos generales; sensibilidad 78% y especificidad 93% (Manson et al., 2003), incluso mejores que los reportados por los kits de ELISA comerciales que señalan una sensibilidad de 91% a 95% y especificidad entre 84% y 95%. Los índices diagnósticos obtenidos sugieren que la técnica diseñada y estandarizada en esta investigación podría ser utilizada para estudios posteriores, evaluando sus índices diagnósticos con mayor cantidad y diversidad de muestras para poder determinar su utilidad en el inmunodiagnóstico de toxocariasis humana y en estudios epidemiológicos.

CONFLICTO DE INTERESES

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses de ninguna índole con respecto al presente trabajo.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a las Dras. Teresa Gárate y Esperanza Rodríguez del Servicio de Parasitología del Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España, por las muestras de suero de pacientes con toxocariasis. De igual manera, a la Prof. Iris Dávila del Departamento de Parasitología de la Universidad de Carabobo, Valencia, por algunas muestras de suero de pacientes con otras parasitosis. También se agradece la colaboración de la Dra. María Elena García del laboratorio de Parasitología de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UCV, por su ayuda en la colecta del material parasitario y al Prof. Gilberto González del Laboratorio de Microscopía Electrónica del CIADANA, Universidad de Carabobo Sede Aragua, por su colaboración en el desecado de las muestras para microscopía electrónica.

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