This study evaluated concentrations of 1x10⁸ conidia/mL orally administered in white mice (NMRI strain, males and females), pathogenicity of a native isolate LF14 of Beauveria bassiana (Fungi: Ascomycota), highly virulent to Rhodnius prolixus and Triatoma maculata (Triatominae), vectors of Chagas disease in Venezuela. Clinical evaluations were done daily. Clearance of fungus in the faeces was estimated by direct examination and culturing, and infectivity by performing mycological and histopathological tests.Animals showed no discernible pathological changes or death and had 100% active-normal behaviour. In all the mice groups, including control ones, there was an increase in the mean weight gained through time, with statistically significance difference between the sexes (P<0,0000). Viable conidia were observed in faeces until 7 days after consuming the fungus. Anatomopathological changes or germinated conidia were not detected in analysed organs, with normal tissue reactions, suggesting no evidence for fungal multiplication. Results obtained allowed us to conclude that isolate LF14 B. bassiana orally administered is safe and non pathogenic in white mice (NMRI strain).

Key words: Beauveria bassiana, pathogenicity, toxicity, mice, infectivity.

Uno de los inconvenientes más resaltantes por el empleo indiscriminado de pesticidas de origen químico para el control de plagas, tanto de importancia agrícola como aquellos que poseen relevancia en la salud pública humana y animal, es en relación con los efectos tóxicos potenciales de éstos sobre la salud humana y de los animales, y los integrantes de la Biósfera en general (Cook et al., 1996). En este sentido, se tiene que anualmente ocurren entre 10.000 a 20.000 decesos humanos en el globo terráqueo como consecuencia de su aplicación, guarismos que se pueden incrementar hasta diez veces más, particularmente en los denominados países en desarrollo (Klein-Schwartz & Smith, 1997). Esto ha traído como consecuencia que exista un ímpetu por el uso de un enfoque más biorracional, enmarcado dentro de programas de Manejo de Integrado de Plagas (MIP), empleándose entre otros microorganismos, hongos entomopatógenos.

El hongo mitospórico Beauveria bassiana (Ascomycota: Hipocreales) puede infectar a más de 700 especies de insectos de varios órdenes, aunque se tienen aislamientos altamente específicos, siendo una de las especies entomopatógenas más empleadas a nivel mundial (Goettel & Inglis, 1997). El mismo es un excelente candidato para ser utilizado como bioinsecticida contra los triatominos vectores de la enfermedad de Chagas, debido a que establece la infección por contacto, no debiendo ser ingeridos por estos hemípteros de hábitos hematofágicos estrictos (Luz et al., 2004). Varios investigadores han probado cepas/aislamientos de este hongo con una alta virulencia contra varias especies triatominas de importancia epidemiológica (Luz et al., 2004; Cazorla, 2011).

Aunque generalmente los hongos entomopatógenos se consideran inocuos para los vertebrados y particularmente en mamíferos, no obstante, siempre se debe tener presente que éstos, y particularmente B. bassiana, han sido reportados, aunque en casos aislados, como patógenos oportunistas, tanto en humanos como animales (Zimmermann, 2007).

Desde comienzos del año 2000, el equipo de investigación del presente trabajo ha realizado ensayos tendientes a seleccionar aislamientos autóctonos de especies de hongos entomopatógenos. Dichos aislamientos deben exhibir una elevada patogenicidad y virulencia hacia las especies triatominas de mayor importancia epidemiológica en Venezuela, y adaptados a las condiciones bioecológicas de las área endémicas chagásicas del país. En este sentido, el aislamiento LF14 de B. bassiana, entre otros ensayados, ha demostrado ser, especialmente en formulaciones aceitosas, altamente virulento contra las especies triatominas Rhodnius prolixus y Triatoma maculata, vectores de la enfermedad de Chagas en Venezuela (Cazorla, 2011). Estos hallazgos lo convierten en un potencial patotipo para ser empleado en futuros programas de MIP de la tripanosomiasis americana en zonas endémicas del país, y particularmente en la región falconiana.

A pesar de que en un ensayo previo se demostró su inocuidad cuando se expusieron sus conidias a nivel dérmico en ratones (Acosta et al., 2011), no obstante, es perentorio continuar evaluando su bioseguridad y su impacto ambiental como potencial agente de control biorracional, antes de ser ensayado a nivel de campo. El presente trabajo es la continuidad de estas evaluaciones de patogenicidad/toxicidad de LF14 B. bassiana en modelos animales vertebrados, por lo que se les administró el aislamiento por vía oral a ratones albinos.

Los ensayos se realizaron en el LEPAMET, UNEFM, Coro, estado Falcón, Venezuela. Se implementó parte del diseño experimental previsto en el nivel I de evaluación toxicológica de los agentes microbianos para el control de plagas de la Agencia de Protección Ambiental (Environmental Protection Agency: EPA) de los Estados Unidos de América (USEPA, 1996), y se siguieron las normas internacionales y nacionales de bioética y bioseguridad (FONACIT, 2008). El protocolo de investigación fue aprobado por el Comité de Bioética de la UNEFM el 31 de Enero del 2008 (Acosta et al., 2011).

Se utilizaron 12 ratones/sexo albinos heterocigotos NMRI (Mus musculus), entre 6 y 7 semanas de edad (i.e. adultos jóvenes) por cada grupo de ensayo, incluyendo los respectivos controles, cuyos pesos no excedieron ≈20% del peso promedio para cada sexo. Los animales se alojaron individualmente en jaulas metabólicas ad hoc que permitieron la recolección de las heces. El alimento (ratarina: Protinal^_®) y el agua se esterilizaron por vapor húmedo en autoclave y suministrados ad libitum. Los animales se mantuvieron en ciclo de luzoscuridad 12-12 horas (Acosta et al., 2011).

En un intento por homogenizar las varianzas, a los porcentajes de germinación se les aplicaron una transformación angular o arcoseno (Sen^-1√x). Se implementaron las pruebas de análisis de Varianza (ANOVA) de una vía y de comparación múltiple para determinar las diferencias entre las medias de los pesos, % de germinación y cantidad de esporulación (conidias/ mL). Los datos se analizaron mediante paquete estadístico MINITAB versión 13.20 (Minitab Inc. 2000).

La supervivencia en todos los grupos fue del 100%. Todos los ratones consumieron ávidamente la ratarina tratada con las conidias del aislamiento LF14 B. bassiana, durante el periodo de exposición a esta dieta experimental.

La evaluación clínica no reveló cambios o alteraciones discernibles en piel, ojos y/o mucosas, sistemas gastro-intestinal, respiratorio, circulatorio, nervioso central y autonómico, en la actividad somatomotora de los animales, exhibiendo comportamientos de tipo activo-normal, considerado característico para la especie (Tapias & Dussan, 2000). El peso promedio corporal en ambos sexos, tanto en los animales expuestos a LF14 B. bassiana como los controles, se incrementó significativamente (P<0,0000) durante los 14 días de observación (Fig. 1). Las diferencias entre sexos tomando en cuenta el total de peso promedio ganado, fueron estadísticamente significativas (F=53,2; g.l.=1; P<0,00001), aunque cuando se hace el análisis comparativo (ANOVA) para cada sexo en particular entre los ratones inoculados y los no expuestos al hongo, las diferencias no fueron significativas (P>0,05).

El estudio micológico (aclaramiento) reveló que en los animales expuestos, tanto machos como hembras, la evacuación de las conidias del aislamiento LF14 B. bassiana ocurrió hasta la primera semana (i.e., 7 días) después de la administración fúngica, reduciéndose las cantidades de las mismas significativamente en el día 7 (P<0,00001) (Tabla I) (Fig. 2). Las diferencias del promedio de conidias/mL registradas entre sexos no resultaron estadísticamente significativas (P>0,05) (Tabla I). Las tasas promedio de germinación de las conidias para ambos sexos fue ≥99% ( ± D.S.=  99,7±0,5; rango: 99-100% en machos; 99,8±0,6; rango: 99-100% en hembras) a las 24 horas de su incubación, siendo estas diferencias estadísticamente no significativas (P>0,05).

Recuperación de conidias de animales (Infectividad)

Cuando se hace el análisis del estudio de infectividad, se aprecia que sólo se logró aislar las conidias del hifomiceto en los intestinos delgado y grueso a los días 3 y 7 de la necropsia (Tabla II).

Anátomo-histopatología

El examen anatomopatológico correspondiente a la inspección externa y macroscópica de los órganos y cavidades de todos los grupos de estudio, incluyendo los animales controles, no reveló la existencia de alteraciones que pudieran relacionarse con la administración del hongo. El estudio histopatológico no reveló la existencia de alteraciones en los tejidos analizados, no observándose un proceso inflamatorio agudo con infiltrados de macrófagos, neutrófilos y eosinófilos, así como tampoco conidias germinadas ni evidencias fúngicas o histopatológicas de la multiplicación del aislamiento LF14 (Fig. 3).

Contrastando con su requerida y deseada alta virulencia para con el organismo "blanco" o "diana" ("target") (e.g., un insecto plaga en particular) al cual se pretende controlar, los agentes de control biológico pueden presentar potencialmente ciertas características perjudiciales no deseadas, incluyendo i) desplazamiento competitivo de microorganismos no "diana", ii) alergenicidad para humanos y otros vertebrados, iii) toxicidad para organismos no "diana", iv) patogenicidad para organismos no "diana" (Cook et al., 1996). Por ello, antes de ser utilizados "in situ" en el campo, los bioplaguicidas deben pasar por una serie de requerimientos técnicos básicos que aseguren su seguridad para la salud pública y el ambiente, i.e., su bioseguridad.

Los resultados obtenidos en el presente trabajo demostraron que la exposición por vía oral de conidias viables del aislamiento LF14 B. bassiana, aun a concentraciones tan elevadas como 1x10⁸ conidias/mL, no ocasionaron efectos tóxicos ni patogénicos discernibles de consideración sobre los ratones NMRI. Estas observaciones concuerdan con la mayoría de los estudios experimentales hechos con B. bassiana, que muestran que este hifomiceto no es significativamente tóxico ni patogénico para los vertebrados, incluyendo mamíferos y particularmente ratones (Tapias & Dussan, 2000; US-EPA, 2006; Zimmermann, 2007). Similares observaciones se han hecho con otros hongos entomopatógenos, tanto en ratones como en otros vertebrados (Mancebo et al., 2005; Toriello et al., 2006; Zimmermann, 2007).

Cuando se analiza el desarrollo de la dinámica del peso corporal, se tuvo que en todos lo tratamientos, incluyendo los animales inoculados con LF14 B. bassiana, hubo un incremento del peso promedio ganado, lo que coincide con lo que se considera normal en individuos adultos para la especie (Quesada-Domínguez, 1997). Como ya se ha considerado en otras experiencias previas (Acosta et al., 2011), esto lleva a inferir que no existe una acción directa de este hifomiceto (conidias, micelio, metabolitos secundarios) sobre la fisiología de los murinos (Tapias & Dussan, 2000). Otros investigadores han obtenido resultados similares a los del presente estudio, al exponer otros aislamientos/ cepas de B. bassiana, así como también otras especies de hongos entomopatógenos, en ratones (Tapias & Dussan, 2000; Mier et al., 2005; Toriello et al., 2006) y ratas (Mancebo et al., 2005). En relación con las diferencias observadas en los pesos promedio entre ambos sexos, se puede considerar como normal para la especie que los machos por sus características fisiológicas y morfológicas posean un mayor peso corporal (Quesada-Domínguez, 1997; Tapias & Dussan, 2000; Acosta et al., 2011).

El estudio micológico de aclaramiento reveló que las conidias del aislamiento LF14 B. bassiana pudieron recuperarse viables solamente en las heces murinas a los 1-7 días después de su inoculación, lo cual coincide con los hallazgos del estudio de infectividad al detectarse estos propágalos fúngicos a los días 3 y 7 de la necropsia en los intestinos delgado y grueso. El hecho de que se recuperaran las conidias viables en la materia fecal, indica que las mismas se eliminaron rápidamente a través del tracto gastrointestinal; por lo que éste evento asociado al hecho, entre otros posibles factores, de las variaciones de pH del tracto gastrointestinal y la temperatura de 37ºC de los ratones (Quesada-Domínguez, 1997), probablemente afectaron la germinación y desarrollo de las conidias, tal como se ha observado en ratones y ratas, tanto en otras cepas/aislamientos de B. bassiana como de otras especies de hongos entomopatógenos (Tapias & Dussan, 2000; Mier et al., 2005; Mancebo et al., 2005; Toriello et al., 2006; US-EPA, 2006). Es bien documentado que el pH y la temperatura pueden afectar el desarrollo y viabilidad de los hongos entomopatógenos (Padmavathi et al., 2003; Cazorla et al., 2007). Previo al proceso germinativo de los hongos entomopatógenos, en el interior de las conidias se requiere activar una gran variedad de procesos metabólicos, los cuales pueden afectarse por las variaciones de pH, cuyos rangos extremos entre alcalinos y acídicos puede llevar a que se cliven enlaces de hidrógeno de enzimas, bicapa lipídica y del ADN, afectándose la integridad y metabolismo celular (Padmavathi et al., 2003). La solubilidad de los iones metálicos (e.g., Mg, Fe), que son necesarios para el desarrollo y crecimiento de los hongos, puede verse disminuida a ciertos rangos de pH afectando diversas enzimas metabólicas y el proceso de germinación, además de que la permeabilidad celular podría verse afectada por estas variaciones de [H⁺]. Por sólo poner un ejemplo, a pH alcalinos puede existir deficiencias de hierro, calcio, cobre y zinc, y el magnesio y el fosfato forman complejos insolubles, mientras que a pH bajos ambos coexisten en sus formas libres (Griffin, 1994). Los daños a nivel celular que pudieran potencialmente ocasionar las variaciones de temperatura son muy amplios y diversos, incluyendo desnaturalización y desorganización de las membranas, daños a nivel del ADN con la pérdida de bases nitrogenadas y stress oxidativo, disminución del metabolismo con crecimiento limitado y la aparición potencial de mutaciones (Rangel et al., 2005). Cazorla et al. (2007) encontraron In vitro que el aislamiento LF14 B. bassiana presenta tasas de germinación <3% a 35ºC, y a 38ºC prácticamente no germinó. Esto podría llevar a pensar que las conidias de este aislamiento al adquirirse accidentalmente dentro del cuerpo de un vertebrado homeotermo no puedan proliferar, aunque pudieran sobrevivir pocos días. Sin embargo, se han descrito, aunque muy rara vez, en la literatura casos de humanos infectados por Beauveria (Zimmermann, 2007). En este sentido, resulta interesante comentar los hallazgos de Henke et al (2002), quienes reportan el aislamiento de Beauveria en un caso humano que recibió quimioterapia inmunosupresora, pero el cual no creció a 37ºC en medio de cultivo, por lo que estos investigadores sugieren que las infecciones sistémicas por B. bassiana sólo son posibles en pacientes inmunosuprimidos. Como bien lo señala Shimazu (2004), otros hongos oportunistas, e.g., Alternaria, Ulocladium, Fusarium, Sporothrix y Engyodontium, similarmente se han detectado en tejidos profundos de pacientes humanos inmunocomprometidos, y no proliferan a 37ºC en medios de cultivo. Por lo tanto, de estos resultados y comentarios, tanto de los del presente trabajo como de los otros reseñados, se puede sugerir que el límite superior de temperatura para el crecimiento y desarrollo de un hongo hifomiceto "in vitro", puede diferir del requerido "in vivo". Además, se puede inferir que a temperaturas elevadas el hongo no muere inmediatamente, estando como en un "estado quiescente", siendo posible aislarlo de los tejidos humanos (Shimazu, 2004). En el caso de los animales poiquilotermos, cabe la posibilidad de que se encuentren a mayor riesgo, debido a que poseen temperaturas corporales más bajas (Toriello et al., 2006).

La prueba oral de riesgo bio-toxicológico evaluada en el presente trabajo corresponde al Nivel I de la US-EPA, así como también otras similares ensayadas en trabajos previos por vía dérmica e inhalatoria en el modelo ratón NMRI-aislamiento LF14 B. bassiana, en las cuales tampoco se obtuvo infectividad o patogencidad (Acosta et al., 2011; Acosta et al., datos no publicados). Por lo tanto, estos hallazgos avalan el no requerimiento de implementar los siguientes niveles II, III y IV (US-EPA, 1996).

Ala luz del presente protocolo de evaluación de infectividad/patogenicidad/toxicidad, se puede concluir que aún a una elevada concentración administrada oralmenteelaislamientoLF14B.bassianaesseguropara el modelo murino NMRI. A pesar de que se espera que el mismo no sea potencialmente dañino vía alimentaria, no obstante, es recomendable que las personas que manipulen y apliquen (e.g., polvo mojable por aspersión) el producto a nivel de campo en los futuros programas de MIP de los vectores de la enfermedad de Chagas, tengan las precauciones y regulaciones pertinentes, tales como uso de camisas con mangas largas, pantalones largos, guantes impermeables, mascarillas con filtros adecuados, así como la espera de al menos 4 horas para los manipuladores de los insecticidas para entrar a las áreas tratadas (Mier et al., 2005; US-EPA, 1996).

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