Cryptosporidium spp., Giardia lamblia y Encephalitozoon intestinalis, oportunistas emergentes

Cryptosporidium spp., Giardia lamblia y Encephalitozoon intestinalis emergent opportunists

Joana Barbosa^1,4*, Maria José Espinar^1,2,4, Acácio Gonçalves Rodrigues^1,3,4 & Cidália Pina-Vaz^1,2,4

1 Department of Microbiology, Faculty of Medicine, University of Porto, Porto, Portugal

2 Department of Microbiology, Hospital S. João, Porto, Portugal

3 Burn Unit and Department of Plastica and Reconstructive Surgery, Hospital S. João, Porto, Portugal

4 CINTESIS (Centro de Investigação em Tecnologias e Sistemas de Informação em Saúde), Faculty of Medicine, University of Porto, Porto, Portugal

*Autor de correspondencia: gui75@sapo.pt

RESUMEN

Es un hecho conocido que las infecciones oportunistas por protozoos y hongos han aumentado en los últimos años, debido especialmente al aumento de las infecciones por VIH. Cryptosporidium spp., Giardia lamblia y Encephalitozoon intestinalis son protozoos y hongo, respectivamente, mundialmente reconocidos como agentes oportunistas emergentes, responsables de brotes epidémicos provocados por la ingestión de agua potable contaminada, incluso después de una correcta desinfección. La ingestión de estos protozoos puede provocar diferentes grados de enfermedad, entre aguda o leve (población sana) hasta situaciones más graves y agresivas, hasta a veces mortales (pacientes inmunocomprometidos y/o inmunodeprimidos). A pesar de ser responsables de muchos brotes epidémicos, su diagnóstico de laboratorio permanece arduo y trabajoso, incluso utilizando las nuevas técnicas desarrolladas en los últimos años. En esta revisión se resumen las consideraciones generales de estos oportunistas emergentes, así como los métodos de diagnóstico más usuales, incluso los más recientes y específicos.

Palabras clave: Oportunistas emergentes, protozoos, hongos, Cryptosporidium spp., Giardia lamblia, Encephalitozoon intestinalis.

SUMMARY

Epidemiological data, regarding parasitic and fungi opportunist infections, have changed in the last years, especially due to HIV infection. Cryptosporidium spp., Giardia lamblia and Encephalitozoon intestinalis are protozoan and fungi, respectively, worldwide known as opportunistic emergent agents, being responsible by epidemic outbreaks after ingestion of contaminated water, even following a correct disinfection treatment. Its ingestion can cause different effects on individuals’ health, from light or acute among the healthy population, to serious, aggressive or even deadly among the immunodepressed or immunocompromised patients. Contaminated water ingestion can result in outbreaks but protozoa laboratory diagnosis still remains very laborious, even after the development of more sensitive and specific techniques in the last years. In this paper, a revision of these emergent opportunists, their main characteristics and diagnostic tools are described, including the most recent and specific techniques.

Keywords: emergent opportunists, protozoan, fungi, Cryptosporidium spp., Giardia lamblia, Encephalitozoon intestinalis.

Recibido el 22/11/2012 Aceptado el 19/09/2013

INTRODUCCIÓN

Desde los tiempos antiguos, las enfermedades parasitarias han sido reconocidas como causa de enfermedad en el ser humano. Su impacto en la salud mundial sigue siendo, hoy en día, muy importante, suponiendo gran parte del gasto sanitario de un país. Estas infecciones pueden causar enfermedad aguda o leve en población sana, y de forma más grave, agresiva y hasta a veces mortal en pacientes inmunocomprometidos, trasplantados, neutropénicos y, sobre todo, en los infectados con VIH (Virus de Inmunodeficiencia Humana).

Las infecciones causadas por agentes parasitarios oportunistas han aumentado en los últimos años. Muchos de los brotes epidémicos descritos se deben a una baja vigilancia epidemiológica, fallo en las medidas de control, desconocimiento de la fuente y, a veces, de la vía de transmisión de la enfermedad. Algunas especies de protozoos, como Cryptosporidium spp y Giardia lamblia, y el hongo Encephalitozoon intestinalis, están reconocidos mundialmente como responsables de brotes epidémicos después de ingestión de agua potable contaminada (Fayer et al., 2000; Canada, 2004; Fricker et al., 2004). La ingestión de este tipo de parásitos puede provocar diferentes grados de enfermedad, siendo la diarrea aguda y/o crónica el síntoma más común (Ali & Hill, 2003; Aygun et al., 2005; Davies & Chalmers, 2009). Debido a sus grandes potenciales patogénicos C. spp., G. lamblia y E. intestinalis fueron incluidos en la lista de la EPA (Environmental Protection Agency) de contaminantes microbianos del agua potable, “NIAID Category A, B, and C Priority Pathogens” (Didier & Weiss, 2006).

Cryptosporidium spp.

Cryptosporidium spp. fue identificado como patógeno oportunista humano en inmunodeprimidos en 1976 y, después del brote infeccioso ocurrido en 1992 en Milwaukee (Wisconsin, E.U.A.) en que cerca de 403 000 individuos fueron infectados con agua contaminada con C. parvum, fue reconocido como agente infeccioso también en inmunocompetentes (Arora & Arora, 2009; Coco et al., 2009). A pesar de que el género Cryptosporidium es diferente de los otros coccidios, actualmente se reconocen 17 especies siendo C. parvum y C. hominis los más frecuentemente aislados en el hombre (Garcia & Bruckner, 1997; Carey et al., 2004). Todo su ciclo de vida ocurre en un único hospedador (humanos, animales y aves) e incluyen las fases de reproducción sexual y asexual, terminando con la liberación de ooquistes de las heces contaminadas al medio ambiente (Aygun et al., 2005; Coco et al., 2009). Los ooquistes son redondos (4-6 μm de diámetro), poseen 4 esporozoítos (estructuras internas infecciosas) y, debido a su doble pared celular, presentan elevada resistencia a los desinfectantes y oxidantes usados para tratamiento del agua (Garcia & Bruckner, 1997; Carey et al., 2004). Permanecen viables en el medio ambiente hasta 6 meses (20ºC) o 18 meses (4ºC) (Canada, 2004; Fricker et al., 2004). Las vías de transmisión son fecal-oral y por ingestión del agua y/o alimentos contaminados; está descrita también la transmisión por contacto directo con personas o animales contaminados (Fricker et al., 2004; Davies & Chalmers, 2009). En los últimos años se han descritos en Reino Unido, Japón, Australia y E.U.A. varios brotes epidémicos provocados por la ingestión de agua contaminada con Cryptosporidium spp. debido a la práctica de deportes en piscinas públicas, por la ingesta de vegetales y por el consumo de bebidas contaminados (Aygun et al., 2005; Coco et al., 2009; Smith et al., 2007). Dentro del género, C. parvum es de los protozoos más prevalentes en todo mundo y su incidencia alcanza el 40% entre la población de riesgo, los inmunodeprimidos especialmente los afectados por HIV/Sida (Carey et al., 2004); en países desarrollados la prevalencia en la población con Sida es de 10-15% de las diarreas crónicas y de 30-50% en países en desarrollo (Barboni et al., 2008). Actualmente, ha sido detectada su presencia asintomática en lactantes y niños con edades inferiores a 5 años (Davies & Chalmers, 2009).

La enfermedad resultante de la infección es la criptosporidiosis, con sintomatología intestinal (dolores abdominales tipo cólico, nauseas y vómitos) y el 92% de los infectados presentan diarrea líquida con moco pero sin sangre ni leucocitos, dependiendo del estado inmunológico del hospedador (Carey et al., 2004; Coco et al., 2009; Davies & Chalmers, 2009). La infección en inmunocompetentes se considera autolimitada y el tratamiento se basa en rehidratación (oral o intravenosa), dieta y toma de antiosmóticos (Canada, 2004; Pantenburg et al., 2009). No obstante, para inmunodeprimidos existe el riesgo de desarrollar diarreas fulminantes siendo necesaria la administración de antirretrovirales (ARV) con inhibidores de la proteasa a fin de aumentar el número de CD4+ (Davies & Chalmers, 2009; Pantenburg et al., 2009). En cuanto a la terapéutica utilizada, hasta ahora ninguno de los fármacos experimentados in vivo e in vitro resultó totalmente eficaz aunque nitazoxanida, paromomycina y espiramicina pueden ayudar en el control de los síntomas (Arora & Arora, 2009; Coco et al., 2009; Davies & Chalmers, 2009; Pantenburg et al., 2009). Sin embargo, lo más práctico es reducir o eliminar la presencia de ooquistes en el medio ambiente con la aplicación de medidas de prevención y tratamiento en aguas potables (Arora & Arora, 2009; Coco et al., 2009). En Estados Unidos y Europa ya existe una reglamentación especifica que determina que el nivel máximo permitido en agua de consumo humano es de 10 ooquistes/100L, así como otros indicadores de detección, control e higiene (Canada, 2004; Karanis et al., 2007). Se recomienda, también, la higiene personal y el aislamiento de niños y trabajadores en recuperación con criptosporidiosis (Davies & Chalmers, 2009); así como los profesionales de la salud que tratan los pacientes con criptosporidiosis (Arora & Arora, 2009).

Giardia lamblia

Giardia spp, descrita por Van Leeuwenhoek en 1681, fue denominada Giardia lamblia (syn: duodenalis, syn: intestinalis) en 1915 por Styles. Su taxonomía y clasificación genotípica ha sido muy discutida ya que depende del hospedador (Ali & Hill, 2003; Garcia & Bruckner, 1997; Smith et al., 2007). Actualmente se considera que las estirpes que infectan a humanos pertenecen a assemblage A y B, y son de origen animal (Ali & Hill, 2003; Hunter & Thompson, 2005; Smith et al., 2007). El ciclo de vida es directo y simple, sin hospedadores intermediarios, y con dos formas celulares: una vegetativa (trofozoíto) y una forma de latencia (quiste). Esta es muy resistente y viable hasta 3 meses en condiciones favorables en el medio ambiente (Fricker et al., 2004; García & Bruckner, 1997). Una vez ingerido el quiste, se liberan en el intestino delgado los dos trofozoítos, que se adhieren a mucosa intestinal y se reproducen asexualmente por fisión binaria longitudinal. Puede ocurrir que en condiciones desfavorables, el enquistamiento ocurra en el íleon, originando quistes y liberándolos a través de las heces al medio ambiente (García & Bruckner, 1997). Es posible reproducir el ciclo de vida in vitro de desenquistamiento y enquistamiento, en condiciones controladas y medios de cultivo propios (bicarbonato, tripsina, sales biliares y otros) (Lauwaet et al., 2007).

Este parasito se encuentra distribuido mundialmente y su reservorio principal es el hombre, que elimina quistes para el medio ambiente, pudiendo reiniciarse así de nuevo el ciclo de vida (Dorny et al., 2009; Fricker et al., 2004; Smith et al., 2007). La transmisión ocurre por vía fecal – oral, desde que haya contacto con material, agua o alimentos contaminados con heces; necesita una dosis infectante baja (10 a 100 quistes viables). Esto, asociado a la alta resistencia que posee a los diferentes tratamientos explica su elevada incidencia mundial (Canada, 2004; Dorny et al., 2009). Es más frecuente entre niños, sobre todo en guarderías, hospitales y orfanatos; en Europa y América del Norte, su incidencia es de 2-7% en cuanto que en países subdesarrollados puede superar el 40%.

La infección por G. lamblia se denomina giardiasis, se presenta clínicamente desde asintomática hasta una diarrea acuosa ligera o crónica (Ali & Hill, 2003). Puede ser erradicada naturalmente sin necesidad de fármacos (Robertson et al., 2010); sin embargo para evitar el desarrollo de una enfermedad crónica se puede utilizar antimicrobianos (Busatti et al., 2009; Garcia & Bruckner, 1997). Metronidazol es el antibiótico más utilizado, aunque actualmente se han descrito casos de G. lamblia resistentes. No obstante, existen otros (albendazol, tinidazol o furazolidona) que pueden ser usados como antiparasitarios en casos de colonización intestinal con estirpes resistentes pero la reproducibilidad de resultados in vitro es diferente del in vivo (Cruz et al., 2003; Gomes, 2009). Igual al Cryptosporidium spp., también es importante la prevención puesto que, según la OMS, los dos protozoos normalmente están presentes en simultaneo en aguas contaminadas (Canada, 2004; Fricker et al., 2004).

Encephalitozoon intestinalis

Encephalitozoon intestinalis pertenece al Microsporidios (o Microspora), un grupo inicialmente llamado de “yeast like fungi”, pero reclasificado de Sporozoa en 1882 por Edouard-Gérard Balbiani pues que era assemblage de los protozoa intracelulares obligatorios formadores de esporos (Corradi & Keeling, 2009). En la según mitad del siglo XX, con los estudios de microscopia electrónica que han demostrado la ausencia de algunas de características de los eucariotas (e.g. aparatos de Golgi y mitocondrias), así como los estudios de rRNA, se creó que los Microsporidios serían descendientes directos de Archeozoa. No obstante, con la descodificación del genoma de Encephalitozoon cuniculi y la descubierta de mitosomas, entre otras características típicas de hongos (como la quitina en la pared celular), todos los Microspora fueran reclasificados para el Reino Fungi, filo Zygomycota y clase Microsporidia (Corradi & Keeling, 2009; Capella-Gutiérrez et al., 2012). La infección en hombres causada por Microsporidios se denomina de microsporidiosis y, por tradición y por la sintomatología, se sigue estudiando en muchos casos relacionado con el grupo de los protozoos.

Encephalitozoon intestinalis es uno de los Microsporidios que infectan el hombre y uno de los más prevalentes, como también el Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon hellem y Encephalitozoon cuniculi; estos también son muy prevalentes en pacientes inmunodeprimidos con microsporidiosis (Arora & Arora, 2009; Thellier & Breton, 2008). Los esporos, sus formas de resistencia fuera del hospedador infectado, pueden variar de tamaño (1-4 μm), forma (oval o redonda) y de ciclo de vida entre especies (reproducción - fisión binaria, mitosis o múltiplo – y localización celular) (Keeling & Fast, 2002; Thellier & Breton, 2008). A pesar de eucariotas, presentan ribosomas 70S y túbulos o filamentos polares, característica específica e importante para la invasión de la célula infectada. Varios estudios han demostrado que pueden permanecer viables desde 98 días hasta 2 años (4ºC) o 16 días – meses (22ºC) (Didier et al., 2004). La infección puede causar diarrea grave persistente y síndrome de mala absorción, principalmente en pacientes con SIDA, así como en niños, pacientes trasplantados, viajeros y ancianos (Arora & Arora, 2009; Didier & Weiss, 2006). No está claro cómo se produce la infección con este parásito y se desconoce las diferentes vías de transmisión (Marshall et al., 1997; Wiwanitkit, 2006). La prevalencia es mundial pero sólo fueron reseñadas tasas de 1 y 50% de infección, dependiendo de los métodos de diagnóstico, región geográfica y población estudiada (Marshall et al., 1997; Noda Albelo et al., 2013).

La diarrea líquida es el principal síntoma de la infección por E. intestinalis, junto con dolor abdominal, pérdida de peso, pérdida de apetito, deshidratación y gases (flatulencia); en algunos casos puede cursar con la muerte (Leiro et al., 2004). La microsporidiosis no es exclusiva de aquellos infectados por el virus del VIH y con concentraciones de linfocitos T CD4 + por debajo de 50/mL, también afecta a receptores de trasplantes de órganos, pacientes sometidos a quimioterapia inmunosupresora y entre individuos inmunocompetentes, tales como, viajeros, niños y ancianos (Noda Albelo et al., 2013). Actualmente no existe un tratamiento totalmente eficaz para la microsporidiosis y los fármacos más utilizados son albendazol (un inhibidor de la tubulina) y fumagillin (antibiótico derivado del hongo Aspergillus fumigatus) entre otros menos eficaces (Santillana-Hayat et al., 2004). Albendazol es efectivo contra la mayoría de los microsporidios particularmente para los Encephalitozoon spp., pero contra Enterocytozoon bieneusi muestra una modesta eficacia. Así, para la infección por E. bieneusi, fumagillin sistémica ha mostrado beneficios en el tratamiento de pacientes VIH positivos (dosis recomendada: 60 mg/día por 14 días) y en pacientes portadores con compromiso inmune diferentes al ocasionado por el VIH. Pero, como fumagillin es medulotóxico, se puede usar un análogo menos tóxico, TNP-470, como opción para los pacientes (Noda Albelo et al., 2013). Sin embargo, el mejor tratamiento es el usado para tratar la infección con el VIH, medicamentos ARV, igual que en la criptosporidiosis (Didier et al., 2004; Didier & Weiss, 2006). La forma más efectiva de prevenir es evitar la transmisión a través del agua y alimentos contaminados, al igual que Cryptosporidium spp. y G. lamblia, usando desinfectantes, radiaciones gama o UV y ebullición del agua durante 5 min (Didier & Weiss, 2006, Santillana-Hayat et al., 2004).

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO

La identificación y diagnóstico de todos los agentes infecciosos oportunistas anteriormente descritos (Cryptosporidium spp., G. lamblia y E. intestinalis) se puede realizar a través de variadas técnicas (directas o indirectas), con diferentes especificidades, sensibilidades, limitaciones, ventajas, desventajas y dependen del tipo de muestra usada. Las heces son normalmente la muestra más utilizada para identificación de los (o) quistes/esporos y se utilizan técnicas de concentración (sedimentación o flotación) de muestras, seguida de separación de los detritus orgánicos y células parasitarias (Fricker et al., 2004, Thiriat et al., 1998). Cuando se pretende detectar en agua, los métodos son diferentes, requiriendo 100 a 1000L de agua para concentración (Fricker et al., 2004). Es importante indicar que la recuperación de los parásitos es variable según la solución y técnica ejecutada para concentración.

Para una mejor visualización microscópica convencional y aumento de sensibilidad deben ser utilizadas diferentes coloraciones, dependiendo del patógeno protozoario a identificar. El método tradicional de diagnóstico para Cryptosporidium spp es la microscopia tras tinción por Ziehl-Neelsen, para G. lamblia puede ser con tricromo y para E. intestinalis la Gram modificada, tricromo modificada o plata. Pero, el tiempo de realización de las técnicas de tinción es largo y necesita de expertos microscopistas para observar las formas de latencia de los protozoos (Gutiérrez- Cisneros et al., 2011).

No obstante, la utilización de anticuerpos específicos asociados con fluorocromos ha sido usada en microscopia de inmunofluorescencia (IMF) con mejores resultados de sensibilidad y especificidad, y es la técnica aplicada en la rutina clínica (Thiriat et al., 1998). También, han sido utilizadas técnicas para la identificación de antígenos a través de pruebas inmunoenzimáticos EIA (Enzyme Immunosorbent Assay) o ELISA (Enzyme – Linked – I Immunosorbent – Assay) pero con resultados variados (Lequin, 2005).

Otros métodos son los ensayos inmunocromatográficos para la detección de antígenos de Giardia spp. y Cryptosporidium spp. en heces. Esos son fáciles de realizar, rápidos, no requieren personal con experiencia ni equipos especiales y procesan muestras individuales; pero, la mayoría de los casos, es necesario utilizar heces recientes (< 24h), sin conservantes, o congeladas a -20ºC. En estudios ya realizados se ha demostrado una menor sensibilidad que los ELISA (sensibilidad 58-97,2%, especificidad 99- 100%) y grandes diferencias entre los distintos métodos inmunocromatográficos comercializados (Fuentes Corripio et al., 2010; Gutiérrez-Cisneros et al., 2011).

Desde los años 90 ha sido ampliamente utilizadas técnicas moleculares, como la PCR (Polymerase Chain Reaction), para la identificación de parásitos en muestras clínicas y ambientales presentando elevada sensibilidad e especificidad (Sousa et al., 2006), aunque no son muy utilizadas en rutina debido a su elevado precio.

Por último, otro método que presenta gran sensibilidad y especificidad es la Citometria de Flujo asociada a fluorescence activated cell sorting. Este método, desarrollado en los años 60, utiliza diferentes fluorocromos y presenta sensibilidades y especificidades superiores que todas las otras técnicas. El análisis celular multiparamétrico permite la medida simultánea de varios parámetros en una misma célula. Las principales ventajas de CMF son la automatización, la rapidez y permite el procesamiento de un gran número de muestras por día, así como el análisis sin lisar de las células (Alvarez-Barrientos, 2000; Givan, 2005; Shapiro & Nebe-von-Caron, 2005; Pina-Vaz & Rodrigues, 2010). Ya están disponibles diferentes protocolos citométricos aplicados a la Microbiología, en los últimos años han sido desarrollados protocolos para detección de los protozoos emergentes (Barbosa et al., 2008a; 2008b; 2009; Hsu et al., 2005; Montemayor et al., 2007).

CONCLUSIÓN

Los protozoos (Cryptosporidium spp. y G. lamblia) y el hongo (E. intestinalis) emergentes son responsables de enfermedades intestinales en el hombre, pero con diferentes grados de gravedad dependiendo del tipo de estado inmunológico de los pacientes. La contaminación del hombre puede ocurrir por diferentes vías, pero el agua es la principal vía de infección, una vez que estos protozoos son resistentes a gran mayoría de los tratamientos físico químicos usados para desinfección del agua potable. No hay un tratamiento antiparasitario totalmente eficaz para criptosporidiosis y microsporidiosis, siendo el mejor tratamiento la combinación de fármacos antiparasitarios con medicamentos ARV; para giardiasis, el antibiótico más común es el metronidazol pero actualmente han sido descritos casos de resistencia. Así, la aplicación de diferentes medidas de prevención en el tratamiento del agua, es importante para evitar brotes epidémicos en la población.

Por fin, nuevas metodologías de diagnóstico en Parasitología han sido desarrolladas en los últimos años, aumentando la sensibilidad de diagnostico de estos protozoos; no obstante, es necesario continuar a desarrollar o optimizar técnicas que sean sensibles, específicas, rápidas y más informativas para el diagnóstico de las infecciones de estos protozoos emergentes.

Conflicto de intereses Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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