¿Es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) una alternativa al diagnóstico microscópico de la malaria en el estado Bolívar, Venezuela? Comparación de ambos métodos

Is the polymerase chain reaction (PCR) an alternative to microscopic diagnosis of malaria in Bolivar State, Venezuela? Comparison of both methods

Sandra Abou Orm¹, Angélica Jiménez¹, Irma F. Agrela¹, Nardi Torres² & Flor Herrera^1*

¹ Instituto de Investigaciones Biomédicas (BIOMED), Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo, Sede Aragua; Maracay, estado Aragua. Venezuela.

RESUMEN

A pesar de las limitaciones señaladas para el diagnóstico microscópico de la malaria (gota gruesa y extendido), éste es el método usado en las áreas endémicas del mundo. Con el propósito de evaluar nuevas herramientas que permitan superar las limitaciones del diagnóstico microscópico, se estandarizó una prueba molecular basada en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) en sólo dos microtubos y se comparó con el diagnóstico microscópico. Para ello se realizaron ambos diagnósticos en 73 muestras sanguíneas obtenidas a partir de personas con síntomas compatibles con malaria y residentes del municipio Sifontes (estado Bolívar, Venezuela). Del total de muestras examinadas, 36 (49,3%) resultaron positivas por microscopia mientras que la PCR resultó positiva en 41 de las muestras analizadas (56,2%); de las muestras positivas por PCR seis resultaron negativas por microscopia y sólo una vez la PCR resultó negativa en una muestra positiva por microscopia; la sensibilidad de la PCR estandarizada fue de 97,2% y la especificidad fue 100%; el grado de acuerdo entre ambas pruebas fue de 90,4% y el índice de κ=0,8355 (muy buena). Por su alta sensibilidad y especificidad la PCR podría ser implementada a fin de valorar la calidad y eficacia del diagnóstico microscópico.

Palabras claves: malaria, diagnóstico, PCR, microscopia, Venezuela.

Despite limitations reported for the microscopic diagnosis of malaria (thick and thin blood films) this is the method used in endemic areas around the world. In order to assess new tools for overcoming these limitations, a molecular test was standardized based on the polymerase chain reaction (PCR), in which only two micro-tubes were used, and compared with microscopic diagnosis. Both diagnosis methods were performed on 73 blood samples from patients with symptoms compatible with malaria and resident in Sifontes municipality (Bolivar State, Venezuela). Of the samples examined, microscopic examination gave 36 (49.3%) positives whilst 41 (56.2%) were PCR positive. Six of the PCR positive samples were reported as negative by microscopic examination but only one sample registered as positive by this method was PCR negative. The sensitivity of the standardized PCR was 97.2% and the specificity, 100%; the degree of agreement between the two tests was 90.4% and the κ index = 0.8355 (very good). The high sensitivity and specificity of the PCR method suggests that it could be implemented to assess the quality and effectiveness of microscopic diagnosis.

En las áreas donde la malaria es endémica, incluyendo Venezuela, la detección e identificación de la(s) especie(s) de Plasmodium responsable(s) del caso, se realiza mediante diagnóstico microscópico (gota gruesa y extendido), técnica que permite, no sólo, la identificación de la especie responsable del cuadro clínico sino también determina la intensidad de la infección; es económica y simple (Santana-Morales et al., 2012. Malar. J. 11: 199. Disponible en: http://www.malariajournal.com/content/11/1/199). Sin embargo, se ha señalado que tiene escasa sensibilidad (Ochola et al., 2006. Lancet Infect Dis. 6: 582-588) e importante limitación en el diagnóstico de las infecciones mixtas (Coleman et al., 2006. Malar. J. 5: 121. Disponible en: http://www.malariajournal.com/content/5/1/121). También puede fallar si las láminas no son preparadas correctamente o cuando la forma parasitaria predominante son trofozoítos jóvenes (o en anillo) (McKenzies et al., 2003. Am. J. Trop. Med. Hyg. 69: 372-376) o incluso si el microscopista que realiza el diagnóstico tiene poca experiencia o un pobre entrenamiento (Dini & Frean, 2003. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 97: 675-677).

Aunque las técnicas de biología molecular y particularmente las que dependen de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) son costosas y complejas han demostrado ser capaces de detectar parasitemias muy bajas, identificar la especie de Plasmodium responsable del cuadro clínico y diagnosticar infecciones mixtas (Rodulfo et al., 2007. Braz. J. Med. Biol. Res. 40: 535-543). Por ello su aplicación permitiría superar las limitaciones del diagnóstico microscópico. El objetivo de este trabajo fue estandarizar una prueba de PCR utilizando sólo dos reacciones mediante la modalidad múltiple de la PCR, disminuyendo así el costo de la prueba y comparar los resultados obtenidos con la técnica de referencia.

En el estudio participaron 73 personas con síntomas compatibles con malaria quienes acudían al Centro de Investigaciones de Campo Dr. Francesco Vitanza ubicado en Tumeremo, capital del municipio Sifontes del estado Bolívar. Personas > 5 años y < 80 años, pacientes con enfermedades crónicas y mujeres embarazadas fueron excluidos del estudio. Además se incluyeron 21 muestras sanguíneas de personas que no habían visitado zonas endémicas de malaria. Todas las personas que participaron en el estudio o sus representantes legales fueron informadas sobre el propósito y los objetivos del estudio y se solicitó su participación mediante la firma de un consentimiento informado. El protocolo de trabajo tuvo la aprobación del Comité de Bioética del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la Universidad de Carabobo.

Para la realización de la prueba de PCR, a las personas que aceptaron participar en el estudio se les tomó una muestra de sangre completa a la cual se adicionó EDTA; además a cada participantes, se les realizó gota gruesa por punción en el lóbulo de la oreja; posteriormente, la lámina se coloreó con Giemsa (Lopéz, 1988 OPS. Publ. Cientifica Nº. 512., pp 39-50) y se examinó por microscopistas experimentados del Centro de Investigaciones de Campo Dr. Francesco Vitanza (Tumeremo, estado Bolívar).

El contenido de G-C y la formación de homo y heterodímeros, así como también el grado de complementariedad de los cebadores diseñados por Snounou et al. (1993. Mol. Biochem. Parasitol. 61: 315-329), fue verificado utilizando los programas Oligo Analizer versión 1.0.3 y Gene Runner versión 3.01. El análisis permitió obtener valores de dG mayores a -8 kcal/mol, indicando que los cebadores no forman dímeros entre ellos; tampoco se dan hibridaciones inespecíficas, ni la formación de estructuras secundarias al ponerlos juntos en un mismo microtubo, bajo el esquema de temperaturas utilizadas en esta investigación.

El ADN de cada muestra fue extraído utilizando la metodología propuesta por Rivero et al. (2004. Inter. J. Trop. Insect Sci. 24: 266-269), y para la amplificación del genoma de Plasmodium spp. se utilizó la modalidad múltiple de la PCR, que permitió primero la amplificación de un fragmento amplio y común a cuatro especies de Plasmodium, seguido de una segunda PCR y para ello se siguió la metodología descrita por Snounou et al. (1993. Mol. Biochem. Parasitol. 61: 315-329) con una modificación en la segunda PCR la cual consistió en colocar un total de ocho cebadores (un par para cada especie) en un único microtubo. En ambas PCRs la mezcla de reacción estuvo constituida por el tampón de la reacción (50 mM Tris-HCl y 50 mM NaCl; pH= 8,5) (Colorless GoTaq^® Flexi), 1,5mM de MgCl₂, 60 μM de cada uno de los desoxirribonuleótido trifosfato (dNTPs) y 250 nM de cada cebador. Para la primera PCR se añadió a cada tubo de reacción 100 ng del ADN extraído a partir de las muestras sanguíneas a evaluar mientras que en la segunda PCR se utilizó 2,5 μL de una dilución 1/100 del producto obtenido en la primera reacció. En ambos casos el volumen final de reacció fue de 25 μL. La amplificació del ADN se realizóen un termociclador BIO-RAD modelo PTC 2000TM incubando las muestras a 95ºC por 5 minutos, luego se realizaron 24 y 30 ciclos (respectivamente) a 94ºC por 1 minuto, 58ºC por 2 minutos, 72ºC por 2 minutos y una extensión final a 72ºC por 5 minutos. En cada prueba se incluyeron controles positivos, negativos y mixtos, este último contenía el ADN de dos o más especies de Plasmodium y los productos obtenidos se observaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio (0,5 μg/mL). Cada muestra fue analizada por triplicado, siendo los resultados 100% reproducibles. La Fig. 1 muestra los productos de PCR obtenidos a partir del ADN extraído de las muestras sanguíneas de las personas que participaron en el estudio; así como también de los controles positivos, negativos y mixtos.

Los resultados obtenidos permitieron calcular la sensibilidad y especificidad de la prueba de PCR en relación al método de referencia (Altman & Bland, 1994. BMJ. 308: 1552) y el grado de acuerdo (índice de kappa) entre la PCR y el examen microscópico (Landis & Koch, 1977. Biometrics. 33: 159-174).

Del total de muestras sanguíneas examinadas por microscopia 49,3% resultaron positivas (36/73). La especie parasitaria identificada con más frecuencia fue P. vivax (30/36; 83,3%) mientras que P. falciparum fue identificado en seis de las 36 (16,7%) muestras positivas. Por otra parte, la prueba de PCR resultó positiva en 41 de las 73 muestras examinadas (56,2%); del total de muestras positivas 80,5% (33/41) resultaron positivas a P. vivax y 19,5% (8/41) fueron positivas a P. falciparum, mientras que las 21 muestras procedentes de personas de áreas no endémicas, resultaron negativas. La prueba de PCR resultó positiva en seis de las muestras negativas para la prueba de microscopia y sólo una vez la PCR resultó negativa en una muestra positiva por microscopia (Tabla I). Cabe destacar que no se detectaron infecciones mixtas ni por PCR ni por microscopia.

La mayor parte de los protocolos para el diagnóstico molecular de malaria describen pruebas de PCR que involucran el uso de cinco reacciones separadas para detectar primero el género y posteriormente identificar la especie de Plasmodium presuntamente presente en la muestra (Snounou et al., 1993. Mol. Biochem. Parasitol. 61: 315-329; Morassin et al., 2002. Am. J. Trop. Med. Hyg. 66: 503-508; Mens et al., 2007. Trop. Med. Int. Health. 12: 238-244). La PCR estandarizada aquí utiliza sólo dos reacciones por paciente, esto reduce significativamente los costos y disminuye su laboriosidad y el tiempo de respuesta, sin afectar la sensibilidad y especificidad de la prueba, que en nuestro caso, resultaron similares a los publicados por otros investigadores (Johnston et al., 2006. J. Clin. Microbiol. 44: 1087-1089; Singh et al., 2013. J. Biol. Agric. Healt. 3: 31-38).

Adicionalmente, se ha señalado que la sensibilidad analítica de la PCR es mucho más alta que la del diagnóstico microscópico (menor a 5 parásitos/μL de sangre) (Roper et al., 1996. Am. J. Trop. Med. Hyg. 54: 325-331), por ello es posible identificar casos de malaria que no son detectados usando el método tradicional (Okell et al., 2009. J. Infect. Dis. 200: 1509-1517), tal como se observó aquí, seis casos no fueron identificados mediante el diagnóstico microscópico pero sí mediante la prueba de PCR, esto representó el 8,2% del total de muestras analizadas.

Durante el desarrollo de esta investigación se observó un diagnóstico de malaria por P. vivax que resultó ser un resultado negativo mediante PCR, es posible que la secuencia blanco de los cebadores haya sufrido mutación/delección o el ADN se haya degradado (Batwala et al., 2010. Malar. J. 9: 349. Disponible en http://www.malariajournal.com/content/9/1/349) o podría ser atribuido a la observación de un artefacto durante la realización del diagnóstico microscópico que confundió al microscopista (Calderón et al., 2006. Mosaico Cient. 3: 43-48). Por otra parte, y aunque no se observó en este estudio, durante el diagnóstico microscópico es frecuente que se confunda una especie de Plasmodium con otra (Parajuli et al., 2009. Nepal Med. Coll. J. 11: 23-27; López et al., 2011. Rev. Ciencia Tecnol. 9: 68-81; Fontecha et al., 2012. Malar. J. 11: 119. Disponible en http://www.malariajournal.com/content/11/1/119); estos errores pueden evitarse utilizando la PCR, que en nuestro caso demostró un 100% de especificidad.

Aunque durante este estudio no se identificaron casos de infecciones mixtas mediante la PCR ni mediante el diagnóstico microscópico, los controles mixtos de PCR muestran las bandas correspondientes a las diferentes especies de Plasmodium aún cuando el ADN de varias especies se encuentra en el mismo microtubo. Esto sugiere la capacidad de la PCR aquí estandarizada en el diagnóstico de las infecciones mixtas, uno de los problemas del diagnóstico microscópico de la malaria en Venezuela (Cáceres et al., 2006. Bol. Mal. Salud Amb. 46: 49-57).

En nuestro estudio los errores del diagnóstico microscópico alcanzaron 9,6%; pese a ello se observó una muy buena concordancia entre ambos métodos lo cual puede atribuirse a que los participantes fueron personas sintomáticas, residentes de una de las áreas maláricas de Venezuela más activas (Cáceres, 2012. Bol. Mal. Salud Amb. 52: 275-285) y muy probablemente portadoras de altas parasitemias, se ha reportado que existe una buena concordancia entre PCR y diagnóstico microscópico cuando la densidad parasitaria es relativamente alta (>500 parásitos/μL) (Suárez-Mutis & Coura, 2006. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 39: 495-497; Nicastri et al., 2009. Am. J. Trop. Med. Hyg. 80: 712-717); es necesario valorar la PCR aquí estandarizada en una muestra de individuos asintomáticos a fin de verificar su potencial en el diagnóstico de este tipo de infecciones. Por otro lado, la experiencia del microscopista determina en gran medida el resultado del diagnóstico microscópico (Ginorio Gavito et al., 2004. Rev. Cubana Med. Trop. 56: 49-53; Rosas-Aguirre et al., 2010. Rev. Perú Med. Exp. Salud Pública. 27: 540-547) en este estudio los microscopistas eran expertos en la lectura de las láminas, lo que puedo haber determinado la muy buena concordancia pudo entre ambos métodos obtenida en esta investigación ya que se ha reportado que la capacitación y el entrenamiento regular y sistemático disminuye los errores del diagnóstico microscópico de la malaria (Obare et al., 2013. Malar. J. 12: 113. Disponible en: http://www.malariajournal.com/content/12/1/113).