Morela Fuchs*, Ventura González*, Sonia Castroni*, Ezequiel Díaz* y Luís Castro*
*Investigadores. INIA. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias Dto. de Biotecnología. Av. Universidad, vía El Limón. Apdo. 4653. Maracay 2101 estado Aragua
Resumen
Con el objetivo de inducir mutaciones en caña de azúcar, Saccharum sp., para la obtención de plantas resistentes a enfermedades se evaluó el efecto de la radiación gamma sobre la regeneración in vitro de plantas a partir de callos. Se seleccionaron cinco variedades B6749, B7987, PR62258, B4362 y PR641791, las tres primeras susceptibles al mosaico de la caña de azúcar (SCMV) y las dos últimas susceptibles a roya. Callos organogénicos de estas variedades fueron irradiados con cinco dosis de rayos gamma: 0, 2, 4, 8 y 12 kR. El efecto de la radiación sobre la diferenciación de plantas se evaluó a los 90, 120 y 150 días. Las plantas regeneradas fueron trasplantadas al suelo en condiciones de umbráculo para determinar la tasa de supervivencia. El análisis de varianza para los datos de diferenciación mostró diferencias significativas entre variedades y entre dosis. La B6749 tuvo el mayor valor de diferenciación seguida de la B4362. Con base en la distribución de frecuencia en los distintos grados de diferenciación para cada variedad y dosis, se estableció la LD50 para cada variedad, estando en un rango de 2 kR para las variedades más sensibles y entre 4 y 8 kR para las menos sensibles. Dosis entre 2 y 4 kR pueden ser utilizadas con posibilidades de obtener una aceptable tasa de mutaciones.
Palabras Clave: Saccharum spp.; radiación gamma; callos; mutaciones; diferenciación.
Summary
Key Words: Saccharum spp.; mutation; gamma radiation; differentiation; callus.
Introducción
La caña de azúcar, Saccharum spp., como cultivo semiperenne está expuesto continuamente a la acción de factores ambientales y agentes biológicos que pueden afectar negativamente la producción. Muchas de las variedades conocidas obtenidas de los programas de mejoramiento genético pueden perder su capacidad productiva cuando aparecen nuevos patógenos o nuevas razas en las áreas de producción.
En Venezuela es posible desarrollar variedades de buena productividad usando métodos convencionales (González, 1983), sin embargo, éstas han sido descartadas en los estados finales de selección con la aparición de la raza B del virus del mosaico de la caña de azúcar (SCMV; Ordosgoitti et al., 1985), y de otros patógenos como Ustilago scitaminea (Ordosgoitti et al., 1981) y roya, Puccinia melanocephala (Ordosgoitti et al., 1986), agente causal del carbón y roya, respectivamente.
Aunque pueden obtenerse genotipos resistentes a una o más de estas enfermedades por métodos tradicionales de mejoramiento genético, se ahorraría tiempo si variedades de comprobada adaptabilidad y buen rendimiento, pero susceptibles a una de estas enfermedades, se convirtieran en resistentes a través de técnicas no convencionales. Esto se alcanzaría con el uso de agentes mutagénicos (Panje et al., 1959; Rao et al., 1971, Urata y Heinz, 1971; Walker y Sisodia, 1969) o por selección de variabilidad somaclonal generada a través de cultivo in vitro (Mee y Heinz, 1969; Krishnamurthi y Tlaskal, 1974; Liu y Yeh, 1984, Oropeza y García, 1996) o más recientemente por la combinación de agentes mutagénicos y variación somaclonal (Heinz, 1973; Pérez, 1989; Liu, 1990).
Las técnicas nucleares en el mejoramiento de plantas son utilizadas para inducir mutaciones. Desde el descubrimiento de los rayos X hasta el uso de las radiaciones ionizantes como los rayos gamma y los neutrones, se han establecido metodologías para inducir variación, las cuales se emplean en el mejoramiento de cultivos importantes como arroz, trigo, cebada, algodón que son propagados por semillas. Técnicas de inducción de mutaciones, en combinación con cultivo de tejidos y métodos moleculares, permiten disponer de una metodología para mejorar plantas propagadas vegetativamente como musáceas, papa, yuca y piña (Ahloowalia y Maluszynski, 2001)
Por primera vez Mee y Heinz (1969) regeneraron plantas de caña de azúcar a partir del cultivo in vitro de callos y detectaron generación de nueva variabilidad. Este tipo de variabilidad fue llamada variación somaclonal (Larkin y Scowcroft, 1981). La variación somaclonal generada en cultivo in vitro puede ser incrementada por varios ciclos de cultivos, regeneración de gran número de plantas por períodos largos de tiempo y mediante selección in vitro para características de interés como Tolerancia a estrés biótico y abiótico. Esta variación ocurre debido a mutaciones puntuales, rearreglos cromosomales, metilación del ADN y elementos transposables (Jain, 2001).
En sus trabajos Ho y Vasil (1983) demostraron que la diferenciación de tejido de callo de caña de azúcar ocurre a partir de células individuales, desde el punto de vista de la inducción de mutaciones, esto representa una ventaja, ya que permite la recuperación de mutantes completos y no tejidos quiméricos como usualmente ocurre cuando se aplican agentes mutagénicos a propágulos vegetativos (Micke et al., 1987; Brunner, 1986). Se ha encontrado que el uso de agentes mutagénicos en cultivos in vitro tiende a aumentar la tasa de mutación por encima de la variación somaclonal observada sólo en cultivo de tejidos.
Cuando agentes mutagénicos físicos o químicos son aplicados a material de propagación sexual o asexual, se observa una relación directa entre la dosis y la tasa de mutación, pero también es notable una relación similar entre la dosis y el daño celular. Esta relación varía con el genotipo. Tomando ésto en consideración, la dosis ideal sería aquella que ocasione una alta tasa de mutaciones recuperables y un bajo daño a los tejidos. Generalmente se utilizan dosis por debajo del nivel LD; (Brunner, 1986). En caña de azúcar se presenta variabilidad en la tasa de diferenciación de plantas en callos irradiados entre variedades( Mee y Heinz, 1969).
]]> Con el objetivo de inducir resistencia al SCMV y a la roya en genotipos de caña de azúcar de comprobada adaptabilidad y rendimiento, mediante la irradiación con rayos gamma de callos de caña de azúcar, la presente investigación tuvo como finalidad establecer la dosis de radiación que ocasionara una tasa alta de mutaciones y permitiera al mismo tiempo obtener una alta población de plantas regeneradas que pudieran ser evaluadas para estas características.Materiales y metodos
Inducción de callos
Para este estudio se seleccionaron cinco variedades de caña de azúcar B6749, B7987, PR62258, PR641791 y B4362. Las primeras tres de ellas susceptibles al SCMV y las dos últimas susceptibles a la roya. Plantas de seis meses de edad fueron utilizadas como fuente de explantes.
Los explantes foliares fueron tomados del apicifolio de la planta, para esto se cortaron secciones de 10 cm de largo y 1 cm de espesor por encima del ápice meristemático, esta pieza fue desinfectada con alcohol etílico al 70% y posteriormente sumergida en una solución de hipoclorito de sodio (cloro comercial) al 3%, lavándose posteriormente tres veces con agua destilada, en una campana de flujo laminar.
Los explantes se tomaron de 3 x 3 mm y colocados en medio Murashige y Skoog, modificado por Liu (1984), conteniendo sales minerales Murashige y Skoog (1962), 100 mg/l de Myo-inositol, 1 mg/l de Tiamina-HCl, 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de Pyridoxina, 2 mg/l de Glicina, 50 mg/l de Arginina, 3 mg/l de 2,4D, 400 mg/l de Caseina hidrolizada, 50 mg/l de agua de coco, 20g/l de sacarosa y 6gr/l de agar. El pH del medio fue ajustado a 5,8; esterilizando el medio en autoclave a 121 ºC y 15 psi.
Los cultivos fueron mantenidos en completa oscuridad a 25 °C, durante dos meses. Cuando se observó un desarrollo de callo de aproximadamente 2 cm de diámetro, ellos fueron transferidos a un medio de diferenciación de plantas con una composición similar al anterior, pero, sin Arginina, disminuyendo la concentración de 2,4D a 1mg/l y agregando 0,5 mg/l de Benzyl amino Purina (BA). Las condiciones ambientales en la cámara de crecimiento fueron 25 ºC , 16 horas de luz y 8 h de oscuridad con una intensidad de luz de aproximadamente 37,5 µE.S-2m-2.
Radiación de callos y diferenciación
Callos friables y organogénicos fueron utilizados en este ensayo. Se tomaron 20 callos para cada dosis de radiación por variedad para un total de 100 callos. Las dosis aplicadas estuvieron basadas en 2, 4, 8 y 12 kR. La aplicación de estos tratamientos se realizó con una fuente de 60Co del Instituto de Investigaciones Científicas (IVIC). Previo al establecimiento de estas dosis se llevó a cabo una prueba de dosimetría con las siguientes dosis 0,5; 1,0; 1,5 y 2,0; en el cual no se detectaron diferencias entre los callos irradiados y no irradiados, estableciéndose así el rango de dosis ya señalado. Inmediatamente después de la irradiación, los callos fueron transferidos a medio de diferenciación fresco y colocados en las condiciones de crecimiento anteriormente descritas, arreglando los tratamientos en un diseño completamente aleatorizado.Las observaciones de diferenciación fueron tomadas a los 90, 120 y 150 días después de la irradiación (DDI), considerando una escala de 1 a 4: 1 para ausencia de signos visibles de diferenciación, 2 para signos incipientes de diferenciación, caracterizado por la presencia de pigmentos verdes y antocianos, 3 para presencia de brotes de 1cm de longitud, 4 para presencia de vástagos mayores de 1cm de longitud.
]]> Establecimiento de plantas en potesCuando los brotes alcanzaron una longitud entre 3 y 4 cm, ellos fueron pasados a un medio de enraizamiento, preparando éste con las sales de Murashige y Skoog (1962), 3 mg/l de ac. Naftalen acético (ANA), 0,1 mg/l de Tiamina-HCl, 100 mg/l de Myo-inositol, 20 gr/l de sacarosa y 6 gr/l de Agar.
Una vez que se observó desarrollo del sistema radical, las plantas fueron transplantadas a potes conteniendo una mezcla de suelo:arena 1:2 (v/v), colocándolas en condiciones de umbráculo en cámara húmeda, cubriéndolas con bolsas plásticas transparentes. Las plantas fueron expuestas gradualmente a las condiciones normales del umbráculo y a una irrigación menos frecuente, hasta alcanzar un régimen diario. Se realizó un conteo final de las plantas que alcanzaron esta condición, para establecer la tasa de supervivencia.
Resultados y discusión
El análisis de varianza para los datos de diferenciación establece claras diferencias entre variedades, entre dosis, así como también una respuesta diferencial de las variedades al incremento en las dosis de radiación. En el Cuadro 1 se muestran los valores promedios de diferenciación para cada variedad considerando todas las dosis, los efectos promedios de las dosis en el grado de diferenciación para todas las variedades y las tasas de diferenciación de cada variedad para cada dosis.
La capacidad de diferenciación de los callos estuvo afectada por la dosis de radiación, en las B4362, B7987 y B6749, notándose una disminución en el grado de diferenciación de los callos con el incremento en las dosis de radiación. Los callos no irradiados presentaron formación de brotes foliares a los 150 DDI, mientras que en los callos irradiados se observaron incipientes signos de diferenciación y en otros casos ausencia de signos de diferenciación como en los callos de las PR641791 y PR62258, donde pudo palparse baja capacidad de regeneración, aún en los callos no irradiados.
| CUADRO 1. Grado de diferenciación de plantas por variedad de caña de azúcar y por dosis de radiación a los 150 días después de la radiación, para un total de 20 callos por tratamiento | ||||||
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| Variedades | ||||||
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| Dosis (kR) | B4362 | B6749 | B7987 | PR62258 | PR641791 | Promedio |
| | ||||||
| 0 | 3.90 | 3,33 | 3,94 | 1,95 | 1,71 | 2,99 |
| 2 | 2,83 | 2,18 | 3,57 | 2,63 | 1,00 | 1,68 |
| 4 | 2,33 | 1,13 | 3,56 | 1,59 | 1,33 | 1,25 |
| 8 | 1,71 | 1,07 | 2,32 | 1,12 | 1,43 | 1,09 |
| 12 | 1,15 | 1,00 | 1,90 | 1,08 | 1,09 | 0,91 |
| Promedio | 2,49 | 1,97 | 3,01 | 1,70 | 1,39 | |
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| Grado de diferenciación : 1: ausencia de signos visibles de diferenciación, 2: signos incipientes de diferenciación, 3: brotes de 1 cm de longitud, 4: brotes mayores de 1 cm de longitud. | ||||||
La pérdida de la capacidad regenerativa de los callos ha estado asociada a diferentes factores, Oropeza y García (1996) encuentran que callos de caña de azúcar mantenidos en subcultivos por períodos prolongados de tiempo en medio conteniendo concentraciones relativamente altas de 2,4 D (3 mg/l), pierden su capacidad para regenerar plantas. La pérdida de la capacidad de las células para formar estructuras organizadas se asocia a desarreglos en la estructura de los cromosomas. Variación en el número y estructura de los cromosomas ha sido observada en células cultivadas, entre estos los más frecuentes son: ruptura del cromosoma, el intercambio y reunión de fragmentos, eliminación completa de brazos del cromosoma (cromosomas acrocéntricos y telocéntricos) y traslocaciones recíprocas (Lee y Phillips, 1988).
Cuando se somete el callo a un tratamiento con radiación gamma, es de esperar que se produzca un incremento en los cambios en los cromosomas. Los rayos gamma por ser un tipo de radiación ionizante, tienen una alta capacidad de penetración y su acción letal en las células se mide usualmente como pérdida de la actividad mitótica, que ocurren por aberraciones cromosomales (Ahnström, 1995). Siddiqui y Javed (1982) trabajando con callos de las variedades PR1000, NC0310, SL4 y Co547, irradiados con dosis de rayos gamma de 1 a 10 kR, mediante una fuente de 60Co, observaron que la radiación afectó el color y la friabilidad de los callos, que al incrementarse las dosis de radiación, no presentaron signos de diferenciación. Los autores mencionados determinaron que en secciones de tallo en Co547, la LD50 fue de 2,4 kR.
Las diferencias en la respuesta de los callos en su capacidad regenerativa y ante el tratamiento con rayos gamma estuvo determinada por el genotipo. Linacero y Vásquez (1993) al analizar la regeneración de plantas de tres cultivares de arroz a partir de embriones inmaduros, encuentran una fuerte dependencia del genotipo en la respuesta observada, variando de 36,7% hasta 78,6%. Entre los cambios observados en las plantas ellos señalan la presencia de mosaico cromosomal, meiosis anormal y albi-nismo. En caña de azúcar Ngampongsai et al. (1992) señalan diferencias en la resistencia a la radiación con rayos gamma en la formación de callo y regeneración de plantas en los cultivares U-Thong 1 y Q83.
Cuando se analiza el comportamiento de las variedades sin irradiar se observó que la B6749 tuvo el mayor grado de diferenciación, la B4362 mostró valores intermedios, mientras que las B7987, PR62258 y PR641791 tuvieron bajos valores de diferenciación. En las dosis de 2 y 4 kR se observaron aceptables valores de diferenciación si se comparan con los callos no irradiados, mientras que en las dosis de 8 y 12 kR la diferenciación fue prácticamente nula, inclusive a 150 DDI.
Estos resultados indican que los callos de la B6749 fueron los de mayor capacidad de diferenciación y los más resistentes a la radiación, seguidos por los de B4362 con alta capacidad de diferenciación y moderadamente resistente a la radiación. Las PR641791 y PR62258 presentaron muy baja capacidad de diferenciación, por lo que no fue posible en esta etapa evaluar el efecto de la radiación. No obstante, cuando se analiza la distribución de frecuencias para el número de plantas que alcanzaron el estado de potes (Cuadro 2), pudo notarse que los callos de PR62258, que mostraron pocos signos de diferenciación a los 150 DDI, tuvieron la capacidad de regenerar plantas completas y en mayor porcentaje en los callos irradiados (4 kR).
Los callos de B6749 regeneraron el mayor número de plantas y de estas un número significativo se regeneró de los callos irradiados con 4 y 8 kR. Callos de la B4362 produjeron un número significativo de plantas de callos irradiados con las dosis de 2 kR y muy pocas o ninguna en las dosis de 4, 8 y 12 kR. Los callos de las B7987 regeneraron plantas en mayor porcentaje en los callos irradiados con las dosis 2 kR. En estos casos, hubo un efecto favorable de la radiación sobre la capacidad de las células para continuar el proceso organogénico. Respuestas similares a estas han sido señaladas por He (1994) en callos embriogénicos de trigo donde la regeneración de plantas fue mejor al irradiar con dosis de 1 a 1,5 kR. Pins et al. (1994) señalan también un efecto estimulante de la radiación en dosis bajas (5 Gy) sobre la regeneración de callos procedentes de semillas de Eleusine coracana.
Estudios realizados por Torp et al. (2001) para incrementar la capacidad de regeneración de cultivos de anteras de trigo, Triticum aestivum, donde la formación de embrión y el porcentaje de plantas verdes está determinado por el genotipo del material donador, identifican mediante marca-dores AFLP la existencia de regiones cromosómicas (QTLs) que explican un total del 80% de la variación genotípica en el porcentaje de plantas verdes.
]]>| CUADRO 2. Distribución de frecuencias del número de plantas obtenidas de callos irradiados que alcanzaron el estado de pote, para cinco variedades y cinco dosis de irradiación. Número de plantas, porcentaje del total. | ||||||
| Dosis de redacción | ||||||
| Variedad | 0 kR | 2 kR | 4 kR | 8 kR | ]]> 12 kR | Total |
| B4362 | 173,00 | 106,00 | 25,00 | 14,00 ]]> 4,40 | 0,00 | 318,00 |
| ]]> | ||||||
| B7987 | 176,00 | 394,00 | 25,00 | 0,00 ]]> 0,00 | 0,00 | 595,00 |
| ]]> | ||||||
| B6749 | 838,00 | 574,00 | 498,00 | 389,00 ]]> 16,46 | 64,00 | 2 363,00 |
| ]]> | ||||||
| PR62258 | 37,00 | 51,00 | 442,00 | 3,00 ]]> 0,55 | 11,00 | 544,00 |
| ]]> | ||||||
| PR641791 | 4,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 ]]> 0,00 | 0,00 | 4,00 |
| | ||||||
| Total | 1228 | 1125 | 990 | 406 | 75 | 3 824 |
| % Total | 32,11 | 29,42 | 25,89 | ]]> 10,62 | 1,96 | 100,00 |
Se podría esperar que en estas regiones existan alelos que favorezcan el desarrollo de plantas verdes. Si los cambios producidos por la acción de la radiación gamma en los callos irradiados se producen en regiones similares, pudiera explicarse el efecto favorable de la irradiación en la regeneración de plantas de caña de azúcar, observados en los callos irradiados.
Conclusiones
Las variedades de caña de azúcar mostraron una respuesta variable al incremento en las dosis de radiación gamma, siendo la B6749 la más tolerante y la B7987 la más sensible, mientras que las demás variedades evaluadas mostraron niveles intermedio de sensibilidad. El valor de LD50 vario entre 0 y 2 kR para las variedades más sensibles y de 2 a 4 kR para la menos sensible.
Hubo un efecto inductor de la radiación en el proceso organogénico de los callos de caña de azúcar, en las dosis de 2 y 4 kR, por lo que dosis de radiación gamma entre 2 y 4 kR pueden ser utilizadas para inducir variabilidad en plantas regeneradas a partir de callos y asegurar una alta población de plantas a evaluar.
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