DIVERSIDAD GENÉTICA DE UNA COLECCIÓN DE CACAO MEDIANTE RAPDS
Martha E. Osorio*, Efraín Salazar,** Asia Y. Zambrano** y J. R. Demey***
*Estudiante graduado. UCV
**Investigadores. CENIAP-INIA
***Consultor. TI-GC
Resumen
Se estudia la diversidad genética de los materiales de cacaos criollos pertenecientes al Banco de Germoplasma Colección 95 ubicado en Ocumare de la Costa, estado Aragua, Venezuela y materiales pertenecientes a los tres grupos de cacaos de referencia: criollos (Chuao-120, Porcelana y Guasare), trinitarios (ICS-8 y OC-61) y forasteros (IMC-11 e IMC-67), a través de la amplificación al azar de fragmentos de ADN polimórficos (RAPD). El iniciador OPC-14 fue el que produjo la estructura que mejor describe la diversidad natural de los genotipos y permitió la formación de cuatro grupos. Esta clasificación prueba una relación entre la procedencia y los grupos generados por medio de la caracterización molecular, sugiriendo que los genotipos de la Colección 95 han sido propagados a partir de una planta común.
Palabras Clave: Theobroma cacao L.; diversidad genética; marcadores moleculares; RAPD.
Summary
Key Words: Theobroma cacao; genetie diversity; rnolecular markers; RAPD.
Recibido: abril 06, 2001
Introducción
La totalidad del cacao, Theobroma cacao L., cultivado en Venezuela hasta mediados del siglo XIX era del tipo criollo (Pittier, 1933). La alta calidad reconocida mundialmente de este tipo de cacao ha sido el soporte del desarrollo de la industria cacaotera nacional. Sin embargo, a finales de ese siglo se produjo un proceso de hibridación descontrolada con los cacaos traídos de Trinidad lo cual originó la pérdida de los árboles criollos típicos, ocasionando la disminución de la calidad del producto venezolano.
Debido a la necesidad urgente de rescatar los genotipos criollos típicos, para mantener los precios del mercado basados en la calidad, así como para, iniciar programas de mejoramiento genético tendentes a la obtención de plantas de cacao criollo con productividad aceptable y alta calidad en sus frutos, se crea la colección de germoplasma conocida como colección 95, en la Estación Experimental de Ocumare de La Costa, conformada por plantas con características propias de cultivares criollos, y cuyos rendimientos fueron sostenidamente superiores al promedio para este tipo de materiales.
La selección se realizó utilizando metodologías tradicionales basadas en la combinación de aspectos agronómicos y morfológicos siguiendo descriptores para esta especie. No obstante, esta caracterización ha sido cuestionada por basarse en caracteres fenotípicos, directamente influenciados por la heredabilidad del rasgo, factores ambientales, herencia multigénica, herencia cuantitativa y por la dominancia parcial en algunos caracteres, lo cual puede confundir la expresión de un rasgo genético (Wilde et al., 1992).
El desarrollo de marcadores como los polimorfismos en las longitudes de los fragmentos de restricción de ADN (RFLP) y la amplificación al azar de fragmentos de ADN polimórficos (RAPD) han hecho posible caracterizar los individuos, así como evaluar relaciones filogenéticas entre los mismos de manera más eficiente (Figueira et al., 1992; Wilde et al., 1992).
Por lo antes expuesto, el estudio de la diversidad genética de la colección basada en marcadores moleculares se presenta como una alternativa más precisa para la identificación de los materiales, ya que estas técnicas permiten la discriminación de los individuos en función del genotipo, independientemente del efecto ambiental o de las interacciones entre genes. Entre las metodologías desarrolladas, los RAPD ofrecen la ventaja adicional de ser una metodología más rápida, sencilla que no presenta el riesgo de uso de materiales radioactivos (Thormann y Osborn, 1992; N'Goran et al., 1994; Figueira et al., 1994; Lazo et al., 1994).
Lanaud et al. (1999) estudiaron cacaos criollo, trinitaria y forastero mediante RFLP y RAPD y establecieron las relaciones filogenéticas entre estos tipos, facilitando un punto de referencia para el análisis de los resultados que se obtengan en la caracterización de poblaciones de cacao utilizando cualquiera de estos dos tipos de marcadores.
Materiales y métodos
Material Vegetal
Se seleccionaron hojas jóvenes y frescas de los materiales de la colección 95 de cacao criollo (Cuadro 1) según la caracterización definida por Sánchez y Tortolero (1996) y materiales pertenecientes a los tres grupos de cacaos de referencia: criollos (Chuao-120, Porcelana y Guasare), trinitarios (ICS-8 y OC-61) y forasteros (IMC- 11 e IMC-67).
Aislamiento de ADN
Las hojas seleccionadas se pulverizaron con nitrógeno líquido, añadiéndosele posteriormente 5 ml de buffer CTAB 2X (2% de CTAB, 100 mM de tris base pH 8,0, 20 mM de EDTA pH 8,0, 1,4M de cloruro de sodio y 0,3% de b-Mercaptoetanol con 100 mg de Polyvinilpirrolidona 40,000 (PVP-40) por gramo de tejido foliar, para ser llevado a incubación a 60 °C por 60 minutos. Luego se agregó cloroformo: octanol (24:1) precipitándose con dos volúmenes de Etanol 95% y 0,5 volúmenes de NaCI 5M. Una vez precipitado y peletizado el ADN se agregaron 300 m l de buffer de resuspensión TE (10 mM de tris-HC1,1 mM de EDTA pH 8,4), para dejarse resuspendiendo durante toda la noche a 4 °C; seguidamente se realizó una doble purificación con fenol equilibrado: cloroformo (1:1), eliminando así la presencia de ARN con ARNasa A (Promega) según estudios de Porebski et al. (1997).
CUADRO 1. Colección 95 de cacao criollo
Material Procedencia Código
Tamaira-3 Chuao TA-3Los
Serapios-2 Chuao LS-2 ]]>
Palmira-1 Chuao PAL-1
Pasaguapo-5 Chuao PAS-5
La Vega-3 Chuao LV-3
La Vega-6 Chuao LV-6
La Vega-15 Chuao LV-15
La Madre de Dios-1 Chuao LDM-1
Cata-1 Cata Cata-5
Cata-8 Cata Cata-8
Cata-16 Cata Cata-16
Cuyagua el coco Cuyagua CEC-1 ]]>
Cuyagua paso clarito-1 Cuyagua CPC-1
Cuyagua remedio de pobre-1 Cuyagua CRP-1
Cuyagua remedio de pobre-2 Cuyagua CRP-2
Cuyagua nombre María-4 Cuyagua CNM-4
Cuyagua mamei roleao-2 Cuyagua CMR-2
Cuyagua mamei roleao-4 Cuyagua CMR-4
Cuyagua mamei roleao-5 Cuyagua CMR-5
Capellania-1 Cumboto CP-1
Capellania-4 Cumboto CP-4
Capellania-5 Cumboto CP-5 ]]>
Capellania-8 Cumboto CP-8
Capellania-9 Cumboto CP-9
Santa Cruz de la Vega-6 Cumboto SCLV-6
Santa Cruz de la Vega-7 Cumboto SCLV-7
Los ADN fueron cuantificados de manera visual con la ayuda del ADN del fago lambda (470 m g/m l) de Promega, almacenados luego a -20 °C para los usos subsiguientes.
Amplificación del ADN
Para la amplificación se utilizaron iniciadores de Operon Technology (Alameda, California) con aproximadamente 70% de G=C y 10 mer, Taq ADN polimerasa (Promega, Corp.), dNTPs (100 mM) y buffer de reacción 10 X (Promega, Corp).
La mezcla de amplificación para un volumen total de 25 m l estuvo compuesta de: 1,5 mM de MgC12, 5 mM de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 1 m M de iniciador, 25 ng de ADN genómico, 1,25U de Taq polimerasa y 3 m l de buffer Taq polimerasa (1OX). Los iniciadores probados fueron: OPA-01, OPA-02, OPA-04, OPA-07, OPA-10, OPA-11, OPA-12, OPA-15, OPA-17, OPA-18, OPA-19, OPB-01, OPB-03, OPB-05, OPB-06, OPB-07, OPB-11, OPC-13, OPC-14, OPC-15, OPC- 16, OPD-01, OPE-02, OPE-08, OPF-12, OPF-13, OPF-14, OPM-04, OPM-14 y OPM-20.
Las mezclas fueron sometidas a un primer ciclo de desnaturalización del ADN a 94 °C por 5 min, hasta cumplir 42 ciclos de cambios de temperaturas; cada ciclo estuvo compuesto de los siguientes segmentos: 93 °C por 1 min; 37 °C por 30 segundos y 72 °C por 2 min. Luego se llevó a cabo una fase final de incubación a 72 °C por 7 min (Porebski et al., 1997).
Para la visualización de los fragmentos amplificados se tomaron 10 ml de cada una de las soluciones de ADN amplificadas al azar, mezclándolas con 2,2 m l de glicerol 65% y 0,8 m l de azul de Bromofenol (1%), separados electroforétícamente en geles de agarosa 2% (con 2 m l de una solución de bromuro de etidio a razón de 10 mg/ml) a 40 mA durante 2 h y 45 min, utilizándose el buffer TBE 1X, pH 8,3 como buffer de electrodo. Los pesos moleculares de los genotipos estudiados se establecieron mediante el Molecular Weight Markers 50 bp DNA Step Ladder, 90 m g de Promega.
Para el análisis digital de la imagen de los productos de PCR se utilizó la cámara Kodak DC-40, lentillas de acercamiento de 6 dioptrías (+6), el cono N° 4 (Edas Hood N° 4) y un filtro para Bromuro de Etidio (590 Df, 100 nm). La sensibilidad de banda utilizada fue de 75%. Los geles fueron digitalizados utilizando el ID lmage Analysis Software (EASTMAN KODAK COMPANY, 1977). Con el analizador de imágenes se realizó un análisis cuantitativo de las bandas separadas, lo que permitió reconocer los patrones para cada material genético en pares de bases.
Con las bandas identificadas en los patrones de cada material genético, se generó un vector de orden para el conjunto de las movilidades absolutas y construyó una matriz, en ella la movilidad fue sustituida por ausencia o presencia de la banda, es decir, una matriz de ceros (0) y unos (1) que indicaron el patrón observado para cada individuo, según metodología descrita por Zambrano (1999).
La diversidad genética entre los materiales de la colección 95 y los cacaos criollos, trinitarios y forasteros, utilizados como genotipos de referencia, fue estudiada usando tres coeficientes de similitud: Jaccard, Simple y Dice (Sokal y Sneath, 1963). Se utilizó el dendrograrna como método de representación gráfica; se probaron tres métodos de agregación: ligamiento simple, ligamiento medio y ligamento completo (Sneath y Sokal, 1973).
El coeficiente de correlación cofenética sirvió para evaluar cómo era preservada la estructura de los datos por los diferentes métodos de agrupación, esperando que el agrupamiento con mayor coeficiente fuese el que mejor describa el agrupamiento natural de los datos (Rohlf y Sokal, 1981).
Todos los análisis se realizaron utilizando el NTSYSpc ver 2,10t (Exeter SOFTWARE, 2000).
Resultados y discusión
De los 30 iniciadores empleados, sólo OPA-04 (AAATCGGGCT), OPB-07 (GGTGACGCAG) y OPC-14 (TGCGTGCTTG) fueron los que produjeron la mayor cantidad de fragmentos amplificables y reproducibles. El iniciador OPC-14, cuya electroforesis de productos de amplificación se presenta en la Figura 1, fue el que produjo la estructura que mejor describe la diversidad natural de los genotipos.
La mejor representación gráfica (Figura 2) se obtuvo de la distancia medida mediante del coeficiente de similitud de Jaccard bajo el método de agrupación de ligamiento medio, con un coeficiente de correlación cofenética (r=0,96908; Cuadro 2).
El estudio de las relaciones genéticas de los cacaos de la colección 95 permitió la formación de 4 grupos (Figura 2); el 1ro con los materiales cuya distancia entre los miembros de cada grupo es menor o igual a 0,40, formado por tres materiales provenientes de Cata (CATA-5, CATA-8 y CATA-16), 6 materiales de Chuao (PAL-1, PAS-5, LV-3, LV-6, LV- 1 5 y LDM-1), 4 de Cuyagua (CNM-4, CMR-2, CMR-4 y CMR-5), los genotipos criollos (Porcelana y Guasare) y los trinitarios (ICS-8 y OC-61). Los resultados indican que existe una similaridad genética de los genotipos de la colección 95 con los genotipos de referencia criollos y trinitarios, estos últimos con una alta cercanía genética entre ellos. Resultados similares han sido señalados por Lanaud et al. (1999), lo que explicaría la disminución de la calidad del producto venezolano como resultado del proceso de hibridación desconocida.
FIGURA 1. Amplificación aleatoria del ADN polimórfico (RAPD), usando el iniciador OPC-14,
en los 26 materiales pertenecientes a la colección 95 y los tipos de referencia.
FIGURA2. Relaciones genéticas de los cacaos de la colección 95 y los tipos de referencia (Chuao-120, Porecelana y Guasare, trinitarios (ICS-8 y OC-61) y forasteros . estudiadas a traves de (1-coeficiente
de similitud de Jaccard) y el método de ligamiento medio para su agrupación jerárquica. Iniciador OPC-14.
CUADRO 2. Coeficientes de correlación cofenética para las distancias medidas mediante los diferentes coeficientes de similitud y métodos de agrupación para cada primer.
Coeficientes de Similitud
Ligamiento simple 0,93978 0,88668 0,90017
OPA-04 Ligamiento medio 0,96757 0,94744 0,94046
Ligamiento completo 0,95219 0,93024 0,92355
Ligamiento simple 0,93918 0,81622 0,86044
OPB-O7 Ligamiento medio 0,95815 0,94468 0,90731
Ligamiento completo 0,88451 0,86749 0,88604
Ligamiento simple 0,91067 0,84731 0,86144
OPC-14 Ligamiento medio 0,96908 0,89419 0,95075 ]]>
Ligamiento completo 0,92935 0,79477 0,90075
El 2do grupo correspondiente a los materiales cuya distancia es menor o igual a 0,55 constituido por los dos restantes genotipos de Chuao (TA-3 y LS-2), los materiales procedentes de Cumboto (CP-1, CP-4, CP-5, CP-8, CP-9, SCLV-6 y SCLV-7) y los genotipos de referencia forasteros (IMC-11 y IMC-67).
El 3er grupo lo forma únicamente el tipo de referencia Chuao-120, y el 4to grupo integrado por los restantes cuatro materiales de Cuyagua los cuales se segregan del resto, con alta similitud entre ellos, lo que hace presumir que son los que verdaderamente se destacan del resto de la colección.
Esta clasificación sugiere que existe relación entre la procedencia y los grupos generados a través de la caracterización molecular. La hipótesis de que los grupos generados por la clasificación son independientes de la procedencia, fue rechazada según el estadístico Chi-cuadrado con una significancia de p<0,01, lo que corrobora que los genotipos de la colección 95 se agrupan casi exclusivamente por su procedencia o sitio de colecta, sugiriendo que estos materiales han sido propagados a partir de una planta común y que, tal como lo señalan Figueira et al. (1994), se han producido algunas alteraciones o cambios morfológicos en las partes más preciadas por el hombre (y que permitió colectarlas como materiales diferentes), sin un cambio substancial en la base genética, detestable a través de un marcador dominante como el RAPD.
Lo antes señalado corrobora la limitación principal de los descriptores morfológicos, que favorecen una imagen sesgada de la verdadera diversidad de los materiales en función del paisaje y un interés agronómico.
En su conjunto, estos resultados concuerdan con los obtenidos por Lanaud et al. (1999), quienes señalan que las variedades de criollos son muy contrastantes en cuanto a su morfología y que van desde el tipo porcelana de mazorcas lisas, al tipo pentágono de mazorcas particularmente rugosas, pero que son muy homogéneas desde el punto de vista genético. También señalan que la selección humana ha jugado un papel fundamental en la situación mencionada, ya que ha contribuido a la fijación y conservación de tipos morfológicos muy diferentes resultado de mutaciones puntuales.
La alta heterogeneidad detectada dentro de los grupos sugiere que el germoplasma ha sido expuesto a una alta hibridación natural en el tiempo. De allí la necesidad de incluir poblaciones naturales de Theobroma en estudios genéticos de variedades cultivadas para discernir mejor las relaciones genéticas dentro de estas, lo cual es esencial para el desarrollo de los planes dirigidos a la conservación y el mejoramiento del banco de germoplasma.
Los resultados obtenidos incorporan elementos que apoyan la necesidad de revisar la actual clasificación de los tipos de cacaos que posibilite establecer relaciones de parentesco entre los mismos.
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