Marilú Chirinos*, Rosalía Velásquez S.*, Arnaldo Noguera* Miguel Pérez*, Jonás Mata* y Delia Polanco**
* Profesores. Universidad Central de Venezuela (UCV). Facultad de Agronomía. Instituto de Genética. Centro de Investigación en Biotecnología Agrícola. Laboratorio de Cultivo de Tejidos y **Cátedra de Raíces y Tubérculos. Dpto. de Agronomía. Apdo 4579. Maracay, estado Aragua. Venezuela.
RESUMEN
El cultivo de anteras de yuca, Manihot esculenta Crantz, es una estrategia de mejoramiento genético para la producción de plantas haploides, permitiendo la selección de clones mejorados y la detección de genes favorables mediante las técnicas moleculares. No se ha precisado un protocolo que asegure la producción de plantas haploides en el cultivo, para ello se evaluó la respuesta morfogénica de dos clones de yuca: UCV-2726 (dulce) y UCV2375 (amarga), para tal fin se evalúo el tamaño del botón floral (1-1,5mm y 2-2,5mm) que determinará la fase de desarrollo óptimo de la microspora. Se evaluaron dos medios de cultivo: Murashige y Skoog (MS) y Chu et al., (N6) ambos suplementados con dos concentraciones de auxina. Se estableció un diseño completamente aleatorizado en un arreglo factorial 32, y realizando la prueba de media de Duncan. Se observaron microsporas en tétrada y en fase uninucleada para el tamaño de botón 1-1,5 mm. Durante la inducción de callos se encontraron diferencias para el tamaño del botón, siendo mayor el número de callos formados para el tamaño de 1-1,5 mm en el medio de MS. El ANAVAR no arrojó diferencias significativas entre el tipo de clon y la respuesta al medio de cultivo, sin embargo, hubo diferencias en cuanto al tamaño del botón floral. Se generaron dos grupos de medias indicando que ambas longitudes generan diferentes números de callos. El tejido calloso se diferenció morfogénicamente en raíces, esto pudiera estar asociado con las auxinas aplicadas al medio.
Palabras Clave: Manihot esculenta; anteras; haploides.
Anther culture in two cassava clones
SUMMARY
Cassava anther culture is a strategical tool for breeding programs in order to obtain haploid plants, allowing selection of improved clones and detection of very important genes through molecular markers. A complete protocol for cassava haploid plant production has not been developed, therefore we evaluated morphogenic response in two cassava clones: sweet (UCV-2726) and bitter (UCV-2375), for two different sizes (1-1.5 mm and 2-2,5 mm) of floral buds selected in order to ascertain the optimal developmental phase of the microspore. Murashige and Skoog and Chu et al. media were evaluated, supplied with two different auxin concentrations. A factorial 32 completely randomized design and Duncan test were used as statistical methods. For floral bud size of 1-1.5 mm, tetrad and uninucleated microspores were observed. During callus induction, differences were found for bud size with the highest number of calluses formed for 1-1.5 mm in MS medium. The ANAVAR did not show significant differences between clone types and culture media. There were two different mean groups for callus number. Callus tissue differentiated morphogenically into roots; this might be associated with auxins applied to the medium.
Key Words: Manihot esculenta; anthers; haploids.
]]> RECIBIDO: febrero 20, 2006.INTRODUCCIÓN
El consumo de yuca, Manihot esculenta Crantz, se ha incrementado en los últimos años dado su aporte en la dieta humana y animal, a la mayor eficiencia en el aporte de carbohidratos en relación con los cereales, y su alto porcentaje de fibra (Brekelbaum, 1991).
Es una especie altamente heterocigota y alopoliploide (2n = 4x = 36), esto dificulta la obtención de líneas homocigotas (Luciani, 1985). Con la producción in vitro de haploides y dihaploides, a partir de anteras en yuca, se podrían obtener líneas homocigotas deseables y necesarias para la producción de híbridos con expresión de alelos recesivos que no se detectan por la heterocigosidad (Roca, 1991).
La formación in vitro de plantas haploides ocurre a partir de polen inmaduro, cuando el polen está maduro no se inicia al desarrollo embriogénico o se desarrollan plantas diploides (Reddy, 1985; Guha-Mukherjee, 1999). Los estudios en microesporogénesis son necesarios porque permiten observar las diferentes secuencias de desarrollo del polen, tipificando el grado de maduración del grano de polen. La fase uninucleada es la que mejor responde a las condiciones in vitro (Villalobos, 1991).
Woodward (2001) regenera embriones somáticos a partir de inflorescencias de yuca en el medio de Murashige y Skoog (MS) suplementado con 2 µM CuSO4 y 12 mg l-1 de picloram, previo pretratamiento a 4 ºC por 10 días. Contrariamente Liu, (1978) observa la no formación de callos en anteras de yuca cuando los botones son pretratados por más de 48 horas a 4 ºC.
Por otro lado, Ascanio (1988) trabajando con anteras de café señala que si éstas son sometidas a bajas temperaturas, se incrementa la respuesta callogénica o embriogénica, debido a la formación de dos núcleos iguales durante la primera mitosis. Este trabajo tiene como objetivo evaluar la respuesta in vitro en el cultivo de anteras de dos clones de yuca pertenecientes al Banco de Germoplasma del Campo Experimental de la Facultad de Agronomía, UCV, probándose dos tamaños de botón floral, dos medios de cultivo y la respuesta morfogénica de los callos formados.
MATERIALES Y MÉTODOS
El ensayo se realizó en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Centro de Investigaciones en Biotecnología Agrícola (CIBA) de la Facultad de Agronomía, UCV. En el material vegetal se utilizaron flores masculinas de los clones UCV 2726 (Tipo Dulce) y UCV 2375 (Tipo Amarga) ubicados en el Campo Experimental, cortando la zona apical de la planta y llevadas al laboratorio en cava con hielo. Se seleccionaron dos tamaños de botones florales: 1–1,5 mm y 2–2,5 mm con el objeto de determinar la fase de desarrollo óptimo de la microspora. Se colocaron en nevera a 5ºC por 7 días para producir un choque de frío.
Se evaluaron 2 medios de cultivo diferentes: MS (1962) suplementado con 50 g l-1 azúcar, 2 mg l-1 ácido naftalen acético (ANA), 0,5 mg l-1 kinetina (Kin), y 50mg l-1 cystina como antioxidante y el medio N6 compuesto por las sales de Chu et al. (1975), 50 g l-1 azúcar, 4 mg l-1 ANA, 1mg l-1 Kin, 50 mg l-1 cystina.
]]> Para las observaciones al microscopio del estado de desarrollo de la microspora se usó carmín Acético al 1%.En el ensayo se utilizó un diseño completamente al azar en un arreglo factorial de 3² con 4 repeticiones por tratamiento, tomando como unidad experimental una cápsula de Petri con 7-8 anteras. Las variables evaluadas fueron porcentaje de formación de callos, apariencia del callo y respuesta morfogénica. Los datos se analizaron por el programa SAS 6,1.RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Desarrollo de la microspora
El tamaño del botón floral se relacionó con las etapas de desarrollo de la microspora (Figura 1), se observaron microsporas en tétradas, uninucleadas en el tamaño 1–1,5 mm mientras que en los botones 2–2,5 mm se observaron granos de polen maduros más las fases anteriores. Estos resultados coinciden con los presentados por Cañas y Roca (1982) quienes determinaron por estudios citológicos el estado de desarrollo de las microsporas con respecto a la longitud del sépalo en botones florales de yuca, estableciendo el tamaño óptimo el comprendido entre 1,5–2,2 mm, correspondiente a los estados de tétradas tardías y microsporas uninucleadas tempranas. Woodward (2001) señala que el rango de tamaño en botones masculinos de yuca oscila entre 0,3–2,5 mm existiendo correlación entre el tamaño del botón y el estado uninucleado de la microspora.
Inducción de callos
Debido al alto porcentaje de contaminación obtenido en el medio N6, el factorial se redujo a 2². No se observó diferencias significativas entre el tipo de yuca y la respuesta al medio de cultivo (Cuadro 1), sin embargo, hubo diferencias para la variable tamaño del botón floral.
CUADRO 1. Análisis de varianza (ANAVAR) para la variable tamaño del botón floral.
| F de V | ]]> gl | SC | CM | FC | P › F |
| Clon de yuca | 3 | 88,42 | 29,47 | 3,09 | 0,0676 |
| Error | 12 | 114,34 | 9,53 | ||
| Total | 15 | 202,77 |
A partir de los 9 días, ocurrió engrosamiento de las anteras y cambio de coloración en la superficie, a los 15 días se observaron formaciones hiperhídricas y apertura de las anteras y a los 25 días la coloración de los callos era de beige a marrón claro en ambos clones (Figura 2). La proporción de callos varió significativamente en cuanto al tamaño del botón, encontrándose mayor número de callos/antera en el rango 1-1,5 mm (Cuadro 1), de apariencia friable, y con un gran número de células redondeadas y en constante división al realizar las observaciones microscópicas, se señala además células en fase binucleada. Según Ascanio (1988) trabajando con microsporas in vitro de café determinó que en la primera mitosis, se originó dos núcleos iguales, cada uno de los cuales se dividirá nuevamente y continuará el proceso hasta formar un callo o un embrión somático.
El tipo de clon dulce (UCV 2776) y amarga (UCV 2375) no influyó sobre la formación de callos, se presume que la diferenciación in vitro en las anteras del tipo amarga no está afectada por los glucósidos cianogénicos o que estos compuestos están presentes en muy baja cantidad o están ausentes. Tampoco se observó diferencias significativas en tipo de yuca y longitud del botón floral, lo cual indica que estos dos factores son independientes a la formación de callos (Cuadro 2).
]]> CUADRO 2. Análisis de varianza (ANAVAR) para las variables tipo de yuca y longitud botón floral.| F de V | gl | SC | CM | FC | Pr › F |
|---|---|---|---|---|---|
| Longitud | 1 | 64,641 | 64,64 | 6,78 | 0,0230 * |
| Tipo | 1 | 23,765 | 23,76 | 2,49 | 0,1403 N.S. |
| Long * tipo | 1 | 0,0156 | 0,015 | 0,0 | 0,9684 N.S. |
α = 0,05 CV= 68,44
Se generaron dos grupos de medias, A: 6,52mm y B: 2,5mm, demostrando que ambas longitudes generan un número diferente de callos.
Respuesta morfogénica de los callos
En callos provenientes de botones de 1–1,5 mm se formaron raíces con longitud aproximada de 10 cm (Figura 3).
Fariñas (1992) demostró que las respuestas morfogénicas en callos son producto de los tratamientos utilizados, los cuales dependen de factores internos y externos del explante o genotipo.
CONCLUSIONES
-El tamaño y estado óptimo del botón floral para la formación de callos fue de 1–1,5 mm, tamaño en el cual el mayor número de granos de polen estaba en estado uninucleado. Las anteras respondieron satisfactoriamente al medio de cultivo constituido con las sales MS para la formación de callos y la diferenciación morfogénica. El tipo de yuca no afectó la respuesta de las anteras al medio de cultivo.
]]> -El alto porcentaje de contaminación durante el ensayo, pudo estar asociado a las condiciones ambientales a la cual estuvieron sometidas las plantas en campo, coincidiendo con el período lluvioso.-Es necesario aplicar pruebas citogenéticas que determinen el número de cromosomas en las células del callo.
BIBLIOGRAFÍA
1. ASCANIO, C. 1988. Inducción de plantas haploides a partir del cultivo in vitro de anteras de cafeto (Coffea arábica L). Trabajo de Ascenso. Maracay, Venezuela. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Agronomía. 89 p. [ Links ]
2. BREKELBAUM, T. 1991. Secado natural de yuca (Manihot esculenta Crantz) en la costa norte de Colombia. IICA Colombia. 20 p. [ Links ]
3. CAÑAS, B. y W. ROCA. 1982. Cultivo de anteras en yuca (M. esculenta Crantz). Revista de la Universidad Industrial de Santander, Colombia 12(1):5-16. [ Links ]
4. CHU, C., C.C. WANG, C.S. SUNG, K.C. YIN, C. CHUC and F.Y. BI. 1975. Establishment of an efficient medium anther culture of rice through comparative experiment on the nitrogen sources. Scientia Sirica. 18(5):659-668. [ Links ]
5. FARIÑAS, Y. 1992. Producción de plantas haploides mediante el cultivo in vitro de polen de tomate (Lycopersicon esculentum Mill). Tesis Doctoral. Maracay, Ven. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Agronomía. 188 p. [ Links ]
6. GUHA- MUKHERJEE, S. 1999. The Discovery of haploid production by anther culture. in vitro Cell. 35:357-360. [ Links ]
7. LIU, M. and W. CHEN. 1978. Organogenesis and chromosome number in callus derived from cassava anthers. Can. J. Bot. 56(10):287-290. [ Links ]
8. LUCIANI, J. 1985. Avance en la selección por contenido de materia seca en plantas de yuca de libre polinización. Revista de la Facultad de Agronomía, UCV. Alcance 33:111-123. [ Links ]
9. MURASHIG, T. and F. SKOOG. 1962. A revised medium for rapid growth and broassays with tabacco tissue cultures. Phyosiol. Plant. 15:474-497. [ Links ]
10. REDDY, V., S. LEELAVATHI. and S. SEN. 1985. Influence of genotype and culture medium on microspora callus induction and green plant regeration in anthers of Oryza sativa L. Physiology Plant. 63:309-314. [ Links ]
11. ROCA, W. y L. MROGINSKI. 1991. Cultivo de tejidos en la Agricultura. Fundamentos y aplicaciones. Cali, Colombia, CIAT. 970 p. [ Links ]
12. VILLALOBOS, V. 1990. Fundamentos teórico – práctico del cultivo de tejidos vegetales. Editorial de la Organización Mundial para la Agricultura y Alimentación (FAO). 112 p. [ Links ]
13. WOODWARD, B. and J. POUNTI–CAERLAS. 2001. Somatic embryogenesis from floral tissue of Cassava (M. esculenta Crantz). Euphytica. 120:1-6. [ Links ] ]]>