Jorge A. González A.*, Maira Oropeza C.**, Teresa Edith Vargas C.** y Eva de García**
Proyecto individual financiado por el Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad Central de Venezuela. CDCH/UCV P.I. Nº 03, 33, 5447, 2004.
* Profesor. Universidad Nacional Experimental Sur del Lago (UNESUR). Estudiante de Postgrado UCV. Facultad de Ciencias. E-mail: jtgonzalez@hotmail.com
** Profesores. UCV. Facultad de Ciencias. Instituto de biología Experimental. Laboratorio de Biotecnología Vegetal
RESUMEN
Con la finalidad de inducir el proceso de embriogénesis somática, segmentos de hojas jóvenes de plantas de Plantago major L. y Plantago hirtella Kunth fueron cultivadas “in vitro” en un medio Murashige y Skoog (MS), suplementado con mioinositol (10 mg l-1), tiamina (0,4 mg l-1), piridoxina (0,5 mg l-1), ácido nicotínico (0,5 mg l-1), glicina (2,0 mg l-1), sacarosa (3%) y empleando como agente gelificante agar (8 g l-1). Se probaron diferentes concentraciones (0; 0,05; 0,1; 0,3; 0,5 y 1,0 mg l-1) de ácido 2,4- dicloclorofenoxiacético (2,4-D). A partir de la tercera semana de cultivo, se desarrolló un callo de apariencia nodular, friable y con una coloración entre pardo claro y crema. La inducción del callo varió levemente dependiendo de la concentración del regulador de crecimiento suministrada al medio. La formación de callo, así como la aparición de embriones somáticos se pudo observar al final de la cuarta semana de cultivo. Alrededor de un 65% de los explantes de las dos especies produjeron embriones después de la octava semana de cultivo, con ausencia de sincronización en los diferentes estados de desarrollo embrionario.
Palabras Clave: Llantén; medicinal; embriones somáticos.
Somatic embryogenesis for two species of plantago genus (Plantago major L. y Plantago hirtella Kunth)
SUMMARY
]]> With the purpose of inducing the process of somatic embryogenesis, segments of young leaves of Plantago major L. and Plantago hirtella Kunth plants were cultured “in vitro” in Murashige and Skoog (MS) media, supplemented with myoinositol (10 mg l-1), thiamine (0,4 mg l-1), pyridoxine (0,5 mg l-1), nicotinic acid (0,5 mg l-1), glycine (2,0 mg l-1), sucrose (3%) and solidified with agar (8 g l-1). Different 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid concentrations were tested (0; 0,05; 0,1; 0,3; 0,5 and 1,0 mg l-1). Since the third week of culture, a nodular and friable light brown callus developed. One week later, somatic embryos originated on callus surface. Around 65% of the explants produced embryos at the eighth week of culture, with absence of synchronization in the different stages of embryo development.Key Words: Common plantain; medicinal; somatic embryos.
RECIBIDO: febrero 20, 2006.
INTRODUCCIÓN
Las plantas medicinales poseen un alto valor económico desde el punto de vista farmacológico. Las investigaciones actuales se han enfocado en la búsqueda de estrategias biotecnológicas que permitan alcanzar una mayor eficiencia en la propagación, crecimiento, rendimiento, extracción y separación de compuestos vegetales naturales con actividad biológica y terapéutica.
El género Plantago, agrupa hierbas perennes y anuales, de las cuales algunas especies son conocidas por sus propiedades medicinales (Ronsted et al., 2003). P. major y P. hirtella, conocidas como Llantén y Falso Llantén, respectivamente, crecen de manera silvestre en el territorio venezolano y son utilizadas en la medicina tradicional para el tratamiento de enfermedades de la piel, enfermedades infecciosas, afecciones de los órganos digestivos, y como antipirético, entre otros (Caraballo et al., 2004; Hernández et al., 2002; Samuelsen, 2000; Mederos et al., 19971998). Diferentes técnicas de cultivo “in vitro” han sido descritas para plantas de este género (Barna y Wakhlu, 1989; Pramanik et al., 1995; Mederos et al., 1997-1998; Das y Raychaudhuri, 2001); sin embargo, no existen estudios del uso de hojas como explantes.
Con base en lo anterior, el objetivo de este trabajo fue el de inducir la formación de callo y embriones somáticos a partir de segmentos de hojas jóvenes de P. major y P. hirtella.
MATERIALES Y MÉTODOS
Segmentos de hojas (0,25 cm2) fueron tomados de plantas de 20 días de germinadas “in vitro” y usados como explantes. Para la inducción del callo y la diferenciación de embriones se utilizó medio MS (1962) suplementado con mioinositol (10 mg l-1), tiamina (0,4 mg l-1), piridoxina (0,5 mg l-1), ácido nicotínico (0,5 mg l-1), glicina (2,0 mg l-1), sacarosa (3%) y diferentes concentraciones de 2,4-D (0; 0,05; 0,1; 0,3; 0,5 y 1,0 mg l-1). El pH del medio se ajustó a 5,8 y se empleo agar (8 g l-1) como agente gelificante, para luego autoclavar a 15 libras de presión y 120 ºC por 20 minutos.
Para la inducción del callo, 10 segmentos de hoja fueron inoculados en frascos con 25 ml de medio. Los cultivos se mantuvieron en condiciones de oscuridad a 28 ºC y se realizaron tres réplicas por tratamiento.
]]> El ensayo se monitoreó semanalmente después de su inicio, y a partir de la cuarta semana se tomaron las observaciones. El experimento se llevó a cabo bajo un diseño factorial. Se utilizó un test a posteriori de comparación de medias de Tukey para n iguales (Montgomery, 1991). Todos los datos fueron procesados con el programa estadístico Minitab, versión 13,20 año 2000.RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Todas las concentraciones de 2,4-D evaluadas indujeron la formación de callo a partir de la tercera semana de cultivo, indistintamente de la especie de Plantago. Para las dos especies se detectaron diferencias significativas en el efecto de la concentración de 2,4-D al compararlo con el tratamiento control sin el regulador de crecimiento.
Tales resultados parecieran sugerir que para ambas especies de Plantago, es indispensable el uso del 2,4-D para la formación de callo. Los resultados obtenidos en esta investigación apoyan los obtenidos por Rout et al. (2000) quienes no encontraron señales de formación de callo cuando cultivaron explantes de Chepahelis ipecacuana en un medio libre de 2,4-D, pero difieren de los obtenidos por Waklhu y Barna, (1989) que observaron la formación de callo compacto en explantes de raíz de Plantago ovata Forsk en un medio libre del regulador de crecimiento.
Generalmente la formación de callo es estimulada en función de la concentración exógena del regulador de crecimiento vegetal utilizado (Rout et al., 2000); sin embargo, también hay que tomar en cuenta la concentración endógena de auxinas en el explante, el tipo de explante y el estado fisiológico del mismo e incluso, la especie vegetal utilizada.
Alrededor de un 65% del total de los explantes respondió hacia la formación de callo embriogénico. A partir de la sexta semana la formación de embriones comenzó a hacerse evidente en ambas especies (Figura 1). El análisis estadístico (P>0,05) reveló que el número de embriones somáticos formados en callos de P. hirtella fue mayor que el observado en callos P. major.
En la Figura 2 se observan los valores promedio del número de embriones por cada 0,25 cm2 de callo (0,1 ± 0,02 g) de P. major y P. hirtella para la octava semana de cultivo.
Los resultados de la investigación concuerdan con los obtenidos para Cephaelis ipecacuana (Rout et al., 2000) y para Plantago ovata (Das y Raychaudhuri, 2001), quienes alcanzaron un mayor número de embriones somáticos en callos embriogénicos cultivados en un medio MS (1962) suplementado con 1 mg l-1 de 2,4-D.
]]> En general, se pudo observar que la formación de embriones somáticos depende fuertemente no sólo de la especie de Plantago, sino también de la concentración del regulador de crecimiento vegetal utilizado. Los resultados permiten concluir que concentraciones entre 0,3 y 1,0 mg l-1 de 2,4-D favorecen la formación y desarrollo de callo y de los embriones somáticos, y que la especie P. hirtella muestra una mejor respuesta en comparación con P. major bajo todas las concentraciones evaluadas.BIBLIOGRAFÍA
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