Plant growth stimulation by Burkholderia cepacia, a native rizobacterias of acid soils in venezuelan savannas1
Edith Mora* y Marcia Toro**
1Este trabajo forma parte de la Tesis Doctoral de la Ing. Agr. Edith Mora, Postgrado de Ecología. financiado por el FONACIT y es parte del proyecto Manejo Conservacionista de Suelos de Sabanas bien Drenadas de la Iniciativa Científica del Milenio 2004-FONACIT.
*Estudiante. Postgrado de Ecología y
**Profesora. Universidad Central de Venezuela (UCV). Instituto de Zoología Tropical. Laboratorio de Estudios Ambientales. Apdo. Postal 47.058. Caracas 1040-A. Venezuela.
RESUMEN
Se evaluó la rizósfera de plantas nativas de sabana Galactia jussiaeana y Centrosema venosum basados en la presencia de bacterias solubilizadoras de fosfatos. El objetivo fue identificar y caracterizar las bacterias. Se realizaron pruebas bioquímicas y tests de promoción de crecimiento vegetal (capacidad PGPR): promoción de la germinación y de estimulación del crecimiento radical en la planta Zea mayz (variedad Turén). La bacteria predominante en la rizósferas de G. jussiaeana y C. venosum fue Burkholderia cepacia. Para probar su capacidad de promover la germinación se establecieron placas de Petri con semillas de Zea mayz inoculadas y sin inocular con la bacteria, obteniéndose un 100% de germinación en las inoculadas y 71% en el control. También se observó un crecimiento significativo de la radícula en las semillas inoculadas. La determinación de longitud radical se realizó en plantas de maíz en condiciones estériles, inoculadas ó no con la bacteria y regadas con solución nutritiva. Después de 3 semanas se observó que las plantas inoculadas mostraban una longitud superior en 28% por sobre las no inoculadas, mayor biomasa y fósforo foliar. Estos resultados pueden atribuirse al incremento de la disponibilidad de nutrimentos minerales, como el fósforo, a la producción de fitohormonas estimuladoras del crecimiento radical y de otros metabolitos producidos por la bacteria. Se resaltó la utilización potencial de Burkholderia cepacia como bacteria con propiedades de biofertilizante, nativa de suelos ácidos tropicales.
Palabras Clave: Burkholderia cepaci; rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal; biofertilizante; suelos ácidos.
SUMMARY
]]> The rhizospheres of Galactia jussiaeana and Centrosema venosum native plants of tropical savannas wereanalized to observe the presence of phosphate solubilizing bacterias. Biochemical tests were applied to thebacteria for its characterization and identification. Our results showed that Burkholderia cepacia was the dominant species. Plant growth promotion tests (PGPRcapacity) of the bacteria, seed germination capacity, androot growth promotion were applied to Zea mays (var.Turen). To evaluate germination promotion, inoculatedand non inoculated seeds were set in sterile Petri dishes, and we observed that inoculated seeds germinated100%, while only 71% of non inoculated seedsgerminated. Inoculated radicles were significantivelylonger than those non inoculated. Root length wasmeasured, under sterile conditions and nutritive solution, in plants inoculaed or non inoculated with thebacteria; control condition was the same without bacteria inoculation. After three weeks, inoculated plants showed 28% more root length, higher biomassand foliar concentration of phosphate than those notinoculated. An improvement of availability of phosphate and production of promoting root growthhormones by the bacteria could be influencing theresults. We show out the potential of Burkholderia cepacia, a bacteria native from tropical acid soils, as abiofertilizer.Key Words: Burkholderia cepacia; plant growthpromoting rhizobacteria (PGPR); biofertilizers; acidsoils.
RECIBIDO: agosto 08, 2006 APROBADO: abril 25, 2007
INTRODUCCIÓN
En condiciones naturales la mayoría de las plantas tropicales adaptadas a diversos nichos ecológicos se encuentran asociadas con microorganismos del suelo los cuales juegan un papel clave en el ciclaje de nutrimentos y en la protección de plantas contra el estrés ambiental al cual pueden estar sometidas (Bowen y Rovira 1999; Jeffries y Barea, 2000).
El fósforo (P) elemento fundamental en la nutrición de las plantas ha sido señalado como el principal elemento limitante en el trópico, según Sánchez y Salinas (1983), el 82% de la extensión de tierras del trópico americano presentan esta característica. En Venezuela, se han realizado estudios que reflejan la baja disponibilidad de P en los suelos. Casanova (1992) estimó que aproximadamente 60 millones de hectáreas tienen problemas de acidez donde el P es el principal elemento limitante.
Las sabanas del estado Guárico (Hernández-Valencia, 1996), presentan condición ácida y baja fertilidad natural (López-Hernández, 1977). El P es fijado debido a su precipitación como fosfatos de hierro y aluminio, lo cual disminuye la disponibilidad del elemento (López-Hernández, 1977). La deficiencia de P es una de las características edáficas más frecuentes.
Los organismos que son directamente promotores del crecimiento, son llamados Rizobacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal (o PGPR: Plant Growth Promoting Rhizobacteria). Son aquellas bacterias que se encuentran libres en el suelo, capaces de adaptarse, colonizar y permanecer en la rizósfera de la planta favoreciendo el crecimiento o desarrollo de ésta con sus actividades, como son: incrementar la solubilidad de elementos minerales (P, K, Ca, entre otros), fijar nitrógeno atmosférico, reducir patógenos de las raíces (por antagonismo o competencia) y producir sustancias reguladoras del crecimiento de las plantas (auxinas, citoquininas y giberelinas) que contribuyen a incrementar el crecimiento de la raíz (Glick, 1995).
En los agroecosistemas, es deseable manejar este tipo de organismos, ya que se estaría optimizando un agente biológico que favorece la nutrición de las plantas junto con el sistema (Toro y López-Hernández, 1998). Por la limitante que representa el P en los suelos ácidos se estudiaron las rizósferas de plantas nativas basados en la presencia de bacterias capaces de solubilizar fosfatos de calcio, de hierro y Aluminio. Los objetivos de este trabajo fueron identificar y caracterizar las bacterias presentes en las rizósferas de Galactia jussiaeana y Centrosema venosum, y estudiar sus características como bacterias promotoras de crecimiento vegetal en la planta Zea mayz.
MATERIALES Y MÉTODOS
]]> Ubicación Geográfica del Sitio de Estudio: el estudio se realizó en la Estación Experimental La Iguana, en las Sabanas al Sur-Oriente del estado Guárico (8º 25’ N y 65º 25’ W), con un clima Isotérmico. Los suelos son de baja a moderada fertilidad, pH ligeramente ácido (Matheus, 1986; Chacón et al., 1991).Aislamiento de las bacterias: se tomó 1 g de suelo rizosférico fresco de cada una de las plantas nativas G. jussiaeana y C. venosum. Se realizaron diluciones seriadas y se sembró 1 ml de la dilución en placas de Petri con medios selectivos que contenían fosfatos de calcio, hierro o aluminio (YED, PS; Thomas y Shantaram, 1986; Peix et al., 2001; Wenzel et al., 1994). Aquellas colonias que mostraron un halo de aclaramiento a su alrededor o el cambio de color del medio (de morado a amarillo) fueron seleccionadas como solubilizadoras de los fosfatos referidos y acidificadoras del medio circundante, respectivamente.
Identificación de las bacterias: se seleccionaron las colonias con capacidad solubilizadora. Una vez purificadas en el medio correspondiente se realizó la caracterización morfológica y las pruebas bioquímicas para su identificación (Mac Faddin, 1980). Posterior-mente se aplicaron las galerías y pruebas confirmatorias para su identificación definitiva (Patrick et al., 1999).
Pruebas de Promoción de Crecimiento de la Planta
Promoción de germinación: se distribuyeron uniformemente 5 semillas de maíz, esterilizadas superficialmente con hipoclorito de sodio al 10%, en cápsulas de Petri estériles. Se aplicó 1 ml de Burkholderia cepacia a cada semilla con una densidad de 108 células/ml (Thomas y Shantaram, 1986; Peix et al., 2001). Los tratamientos control carecían de la suspensión bacteriana. A los 7 días se midió el porcentaje de germinación y el tamaño de las radículas. Se realizaron cinco repeticiones para cada tratamiento, calculando el promedio de cada parámetro para su posterior comparación estadística.
Promoción de crecimiento radical: para determinar la longitud radical se estableció un experimento en condiciones de invernadero y esterilidad durante 21 días (López, 1997), en recipientes de plástico (macetas) con arena, esterilizada a vapor fluente por una hora durante tres días consecutivos y colocando una semilla de maíz esterilizada (según se señaló anteriormente). Se establecieron 2 tratamientos: inoculadas y control, cada uno con 5 repeticiones. A las plantas inoculadas se les aplicó a los 4 d y 15 d de crecimiento, 1 ml del cultivo bacteriano (108 células/ml); a las plantas control se añadió 1 ml de agua estéril. Ambos tratamientos fueron regados con solución nutritiva de Hewitt (1966). Cumplido el tiempo se midió la longitud de raíz por el método de Newman (1966), modificado por Tennant (1975) y se evaluaron diferentes parámetros en planta según se indica a continuación.
Determinaciones en planta: a las plantas cosechadas se les determinó la biomasa del vástago, previo lavado de la parte aérea con agua destilada y secado del material a 60 ºC durante 24 h. Para la determinación del P foliar se aplicó una digestión ácida al material vegetal molido con mezcla binaria. Posteriormente se determinó por colorimetría el contenido de P (Murphy y Riley, 1962).
Análisis estadístico: se realizó una prueba de homogeneidad de varianza para analizar las variables peso seco del vástago, contenido foliar de P y longitud radical aplicando un ANOVA de una vía. Las diferencias significativas se evidenciaron colocando la desviación estándar entre paréntesis al lado de los resultados obtenidos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las rizósferas de G. jussiaeana y C. venosum presentaron colonias con capacidad de solubilizar fosfato de calcio, hierro y aluminio (Cuadro 1), característica de gran importancia en suelos ácidos de sabanas, ya que estos suelos son deficientes en nutrimentos como fósforo, calcio y magnesio (Purnomo et al., 2005). La solubilización química y/o microbiológica de los fosfatos inorgánicos y la mineralización microbiológica de los fosfatos orgánicos, son algunos de los principales aportes de P a la solución del suelo, mecanismos relevantes en suelos poco fértiles como los que se estudian.
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Es importante resaltar la capacidad de estas bacterias como microorganismos capaces de solubilizar los principales tipos de fosfatos insolubles presentes en los suelos ácidos, a través de su capacidad de acidificar el medio circundante (Cuadro 1); esta capacidad es debida a la propiedad que poseen dichas bacterias de producir ácidos orgánicos que actúan solubilizando los fosfatos insolubles (Illmer y Schinner, 1995; Illmer et al., 1995). Su aplicación como biofertilizante en los sistemas agrícolas tropicales debe considerarse como una alternativa agroecológica (Vessey, 2003).
De acuerdo a las características morfológicas de las colonias bacterianas seleccionadas en diferentes medios y a las pruebas bioquímicas preliminares se concluyó el predominio de una sola especie identificada como B. cepacia. Las galerías específicas y las pruebas realizadas posteriormente (Reynaud et al., 1988) corroboran dicha identificación (Cuadro 2).
La inoculación de Z mayz con B. cepacia favoreció en un 29% logrando alcanzar 100% de germinación comparado con el testigo que fue de 71%; las redículas con tamaño representativo dieron en promedio una longitud de 2,17 cm en las semillas inoculadas y de 0,72 cm en el tratamiento control. Esto indica el crecimiento significativo de la radícula en las semillas inoculadas, mostrando una clara promoción de la germinación de Z. mayz por B. sepacia (ver figura).
Las pruebas para promoción del crecimiento mostraron que después de 3 semanas las plantas inoculadas poseían una longitud radical superior en 28% a las plantas no inoculadas, así como 52% mayor producción de biomasa y 50% mayor contenido de P foliar (cuadro 3). Son significativos los incrementos de biomasa y de contenido de P foliar, en tanto que las diferencias en longitud radical no fueron significativas; la gran desviación estándar de los datos lo refleja. Sin embargo, los efectos obtenidos sobre los parámetros de crecimiento como la biomasa y el contenido de p foliar permiten caracterizar a la bacteria B. cepacia como promotora de crecimiento (PGPR) del maíz en condiciones invernadero.
Se aplicó un ANOVA de una vía para cada análisis. Entre paréntesis se observa la Desviación Estándar. Los resultados son promedio de 5 repeticiones.
Los resultados obtenidos permiten evidenciar a B. cepacia como una bacteria capaz de promover el crecimiento y desarrollo de Z. mayz. Es conveniente probar su capacidad promotora sobre otros cultivos de interés agrícola nacional. La caracterización y aislamiento de esta bacteria como promotora de crecimiento vegetal permite sugerir su utilizaciónbiotecnologíca (Klopper et al., 1989; Pal et al., 1999), como biofertilizante para cultivos tropicales que se desarrollen en suelos ácidos, sin embargo, se debe evaluar su efecto en condiciones de invernadero y campo antes de multiplicar y masificar su uso.
]]> CONCLUSIONES-B. cepacia fue la especie de bacteria solubilizadora de fosfatos dominante en las rizósferas estudiadas. Mostró una adecuada capacidad de solubilizar fosfato de calcio, hierro y aluminio, estos dos últimos predominantes en los suelos ácidos de sabanas.
-La bacteria B. cepacia favoreció la germinación, elongación de la raíz y producción de biomasa promoviendo el crecimiento de Z. mayz.
-Estas características la señalan como una bacteria de potencial aplicación como biofertilizante y/o en control biológico en cultivos de interés agrícola de los suelos ácidos de sabana.
AGRADECIMIENTO
Agradecemos la asistencia de los Brs. Erika Osorioy David Bolívar en los análisis de laboratorio.
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