Utilización del diseño TTC para detectar epistasis en soya

Marco Antonio Acevedo Barona*, José Manoel Colombari Filho** e Isaías Olivio Geraldi***

* Investigador. INIA-Guárico. Calabozo, estado Guárico. Venezuela. E-mail: macevedo@inia.gob.ve

** Universidad São Paulo. Escuela Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz" Curso de doctorado en Genética y Mejoramiento de Plantas. Piracicaba/SP. Brasil. CEP 13400-970, Caja Postal 83. E-mail: jmcfilho@esalq.usp.br

*** Profesor Asociado. Universidad São Paulo. E-mail: iogeral@esalq.usp.br.

El estudio de la naturaleza de la variabilidad genética existente en una población es importante, no sólo para la selección del tipo de cultivar, sino también para la escogencia del método de mejoramiento más apropiado. Con el objetivo de estudiar la variancia epistática para el carácter rendimiento en granos en soya, Glycine max L., fue utilizando el análisis "Triple Test Cross" (TTC) modificadopara especies autógamas por Jinks et al., 1969. Elmaterial experimental utilizado en este trabajo estuvo conformado por 32 líneas (P_i), escogidas aleatoriamente de una población entre los progenitores PI 123439 y PI 239235; las líneas Pi fueron posteriormente cruzadas con otras 2 líneas testadoras (L₁ y L₂) de la misma población, contrastantes para rendimiento en granos, las cuales fueron usadas como testadoras. Durante el ciclo 2006/2007, fueron evaluados 100 tratamientos en el arreglo experimental látice triple triplicado en parcelas experimentales de 2,00 metros de longitud, separadas 0,50 metros. Considerando la metodología del análisis biométrico, el contraste permitió detectar epistasis significativa para rendimiento en grano en soya, por las pruebas F y t. Entonces, es posible concluir que en soya, el carácter rendimiento en granos está afectado por la interacción entre los loci (epistasis) que la determinan.

Palabras Clave: Soya; Triple Test Cross TTC; Glycine max L.; epistasis.

The study of the nature of the genetic variability present in a population is important, not only for the selection of the type of the cultivar, but also for the selection of the more appropriate breeding method. In order to study the epistatic variation for grain yield in soybean, the "Modified Triple Test Cross" (TTC) method for plant self (Jinks et al., 1969) was used. The experimental material used in this work was conformed by 32 lines (P_i), chosen randomly, which later were crossed with other 2 lines of the same population, contrasting for grain yield and used as testers (L₁ and L₂).During cycle 2006/2007, 100 treatments were evaluated in the design triple lattice tripled (9 replicates) in experimental plots of 2.00 meters length, separated 0.50 meters. Considering the methodology of biometric analysis, the contrast of the means () allowed the detection of significant epistasis through F and t tests for grain yield in soybean. Therefore it is possible to conclude that, in soybean, the character grain yield is affected by the interaction between loci (epistasis).

Key Words: Soybean; Triple Test Cross TTC; Glycine max L.; epistasis.

RECIBIDO: noviembre 07, 2008 ACEPTADO: junio 02, 2009

El estudio de las poblaciones en los programas de mejoramiento de cualquier especie tiene como objetivo principal conocer la variabilidad de tipo genética y no genética (ambiental). La detección y estimación de los efectos genéticos es necesaria para obtener información sobre la naturaleza de la acción de los loci involucrados en el carácter en estudio y establecer las bases para la selección del método de mejoramiento más apropiado. Los estimados así obtenidos son validos para la población bajo estudio, del cual el material genético constituye una muestra representativa y para las condiciones ambientales en que el estudio fue conducido.

La mayoría de los caracteres de importancia económica, como el rendimiento en granos, son del tipo cuantitativo; el estudio genético de este tipo de caracteres es realizado adoptando modelos básicos que definen al fenotipo como resultante del genotipo bajo la influencia del ambiente. En consecuencia, la variación genotípica y variación ambiental son parte fundamental de la variación fenotípica.

Ramalho et al. (1993) presentan que el primer estudio sobre la variancia genética fue realizado por Fisher, en 1918; en dicho trabajo, demostró que la variancia genética esta compuesta por 3 componentes importantes, a saber: (1) la variancia aditiva, referida al efecto medio de los loci, (2) la variancia de dominancia, debida a las interacciones entre alelos del mismo locus y (3) la variancia epistática, producto de las interacciones entre alelos de diferentes loci.

Según Dickerson (1963), la variancia aditiva contribuye en su totalidad a la respuesta a la selección, mientras que las variancias de dominancia y epistática son generalmente aprovechables en la selección clonal y en la selección de híbridos (F1) producto del cruzamiento entre líneas homocigotas. En este sentido, los componentes de la variancia epistática, de tipo aditivo x aditivo, aditivo x dominante e dominante x dominante son capitalizadostotalmente en la selección clonal y en hibridos (F1) de cruzamientos de líneas homocigotas y parcialmente en la selección dentro de poblaciones segregantes. Entonces, la naturaleza de la variación genética presente en una población básica es importante, no sólo para la escogencia del tipo de cultivar, sino también para la escogencia del método de selección.

Por su parte, Bernardo (2002) señala que cuando las variancias aditiva, dominante y epistática están presentes en la expresión de un carácter, no es posible obtener adecuadamente la magnitud de cada uno de los componentes, a través de los diseños cuantitativos convencionales. Para resolver esta limitación, Kearsey y Jinks (1968) desarrollaron el modelo "Triple Test Cross" (TTC), como una extensión del diseño III (Comstock y Robinson, 1952).

Estos diseños genéticos de TTC permiten obtener estimados eficientes de variancia epistática, como también de variancia aditiva y de dominancia en ausencia de epistasis. También cobra poca importancia el tipo desistema de reproducción, nivel de endocría, frecuencia génica y genotípica de la población en estudio.

Numerosos trabajos han sido realizados en diferentes especies, para demostrar la importancia de la epistasis en caracteres de importancia agronómica, como lo muestran en trigo (Ketata et al., 1976 y Goldringer et al., 1997, en maíz (Wolf y Hallauer, 1997 y Parvez et al., 2006, en arroz (Sallem et al., 2005), en algodón (Bhatti et al., 2006), en maní (Arachis hypogaea; Upadhyaya y Nigam, 1999) y en soya (Araujo, 2006). Todos estos trabajos han utilizados los distintos modelos de TTC y de manera general concluyen que la variancia epistática es importante en caracteres cualitativos y cuantitativos; que un número restringido de genotipos puede no detectar epistasis y entonces, los estimados de variancias aditiva y dominante para los caracteres estudiados estarían sesgados, cuando no se considera la epistasis en el modelo y finalmente, agregan que la detección, así como la magnitud de la variancia epistática, es afectada por la interacción epistasis x ambientes.

Sin embargo, en soya existe escasa investigación referida a la variancia epistática. En razón de ello, el trabajo tuvo como objetivo estudiar la variancia epistática para el carácter rendimiento en granos en soya, Glycine max L., utilizando el diseño TTC modificado por Jinks et al. (1969).

El material experimental utilizado en este trabajo proviene de una población endocriada de soya oriunda del cruce entre las líneas exóticas PI 123439 y PI 239235 del banco de germoplasma de los Estados Unidos. De dicha población fueron obtenidas aleatoriamente 32 líneas (P_i) de flores rosadas para ser usadas como machos, y otras 2 líneas para ser utilizada como testadoras (L₁ y L₂) de flores blancas como progenitoras femeninas. Ambos materiales presentaron comportamiento contrastante para el carácter rendimiento en granos (g parcela^-1). El color de la flor fue utilizado como marcador morfológico para distinguir híbridos de autofecundación, ya que, según Stephens y Nickell, (1992), este carácter, en soya, presenta herencia monogénica.

Los materiales fueron hibridizados dando seguimiento a la metodología propuesta por Jinks et al. (1969), para el diseño de "TTC" modificado donde las 32 líneas P_i fueron cruzadas con las líneas testadoras L₁ y L₂ para obtener un total de 64 cruces F₁; estos cruces se realizaron en el ciclo 2002/2003 en casa de vegetación, la técnica, equipamientos y horario para la hibridación son ampliamente discutidas por Vello (1992). Durante los ciclos 2003, 2003/2004 y 2004/2005 se realizó el avance de las generaciones F₂, F₃ y F₄, respectivamente.

El experimento de evaluación del material F4 fue conducido en el ciclo 2006/2007 en el campo experimental del Departamento de Genética, Escuela Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidad de São Paulo, localizada en el municipio Piracicaba/SP, a 22° 42' 30" de latitud sur y 47° 38' 00" de longitud oeste, a 537 metros de altitud. El tipo de suelo es LATOSSOLO VERMELHO AMARELO (EMBRAPA, 1999), DISTROFICO, con 30% de arena, 10% de limo y 60% de arcilla, y pH de 5,6; (Santos da Silva, 2005).

El arreglo experimental utilizado fue "Latice Triple Triplicado" (LTT) con 9 repeticiones y 100 tratamientos distribuidos de la siguiente manera: 32 cruces (L₁ x P_i), 32 cruces (L₂ x P_i), 32 P_i, las 2 líneas testadoras (L₁ y L₂) y 2 testigos comerciales (IAC 5 y IAC 12). Las parcelas experimentales estaban conformadas por hilera de 2,0 metros de longitud, separadas 0,50 metros, conteniendo 35 plantas; en la maduración, fue evaluado el carácter rendimiento de granos, en gramos por parcela.

Y_ijk = μ + t_i + r_j + b_k(j) + e_ijk           (1)

donde, Y_ijk es el valor fenotípico observado del tratamiento i en el intra-bloque k, dentro de la repetición j; μ es la media general; t_i es el efecto del tratamiento i, con i variando de 1 a 100; rj es el efecto de la repetición j, con j variando de 1 a 9; b_k(j) es el efecto del intrabloque k, jerarquizado dentro de la repetición j, con k variando de 1 a 10; y e_ijk, está referido al error experimental asociado a la parcela i_jk.

Las medias ajustadas y corregidas por número de plantas por parcelas obtenidas del análisis de variancia fueron posteriormente sometidas al análisis biométrico propuesto por Jinks et al. (1969), para detección de epistasis.

La prueba para detectar epistasia, según la metodología es realizada tomando como base la variancia entre las medias para carácter estudiado (rendimiento en granos), de acuerdo al contraste , donde es la media del cruzamiento entre la i-ésima línea y la línea testadora L₁, se refiere a la media del cruzamiento entre la i-ésima línea con el testador L₂, mientras que P_i es la media de la i-ésima línea, siendo i = 1, 2, ... 32 en este trabajo. Cuando este contraste de medias es constante, es decir, no presenta variación significativa entre el conjunto total de líneas (P_i) utilizadas en el análisis, se dice que no existe epistasis y la variancia genética del carácter sigue un modelo aditivo-dominante. Caso, contrario, cuando ese contraste de medias presenta variación significativa, se entiende que existe epistasis y las variancias genéticas aditiva y dominante estimadas por el modelo están sesgadas.

La epistasis con 31 grado de libertad fue calculada utilizando la suma de cuadrados corregida (ecuación 2), según Kearsey y Pooni (1996).

            (2)

Ambos términos de la ecuación están divididos por 3 y el mismo está referido a la suma de los cuadrados de los coeficientes del contraste es decir, 1² + 1² + (–1)², y n corresponde al número de líneas (P_i) utilizadas, mientras que 3 Ä , se refiere al número de autofecundaciones para obtener las progenies F_2:4. Los cuadrados medios obtenidos del análisis de variancia para epistasis fueron corregidos por el número de repeticiones (r), ya que estaban calculados usando valores medios.

Finalmente, el desvío total del contraste fue probado usando la (ecuación 3) prueba t, de acuerdo con lo propuesto por Ketata et al. (1976)

siendo que σ el desvío padrón del error intra-bloques del análisis de variancia.

Los valores correspondientes a la significancia de los cuadrados medios de las diferentes fuentes de variación, medias generales, eficiencia del diseño látice y el coeficiente de variación del análisis de variancia son mostrados en el Cuadro 1.

CUADRO 1. Análisis de variancia del diseño látice triple triplicado para tratamientos y su desdoblamiento para el carácter rendimiento de granos (g parcela-1), año 2006/2007.

**, * y N.S.: teste F significativo al 1%, 5% y no significativo, respectivamente.

El análisis de variancia reveló diferencias altamente significativas (P<0,01) para todas las fuentes de variación, excepto para bloques dentro de repeticiones y corrección del número de plantas por parcela. Para la fuente de variación tratamientos las diferencias estadísticas encontradas sugiere la existencia de suficiente variación genética para rendimiento en granos en la población evaluada. El desdoblamiento de ésta fuente en cruzamientos y líneas muestra también suficiente variabilidad genética entre ellos, incluso para las líneas testadoras (L₁ vs., L₂), lo cual resulta satisfactorio para la detección de epistasis utilizando el TTC modificado, ya que las líneas testadoras, además de presentar diferencias genéticas deben ser contrastantes; este resultado es posible corroborarlo cuando se analizan las medias alcanzadas entre ambas líneas testadoras: L1 alcanzó 156,67 g parcela^-1, y la línea L₂, 97,04 g parcela^-1, mostrando diferencia de 60 g parcela^-1, entre ellas.

El coeficiente de variación obtenido para el carácter rendimiento en granos fue de 32,37%, como lo señala Pimentel-Gomes (200) este parámetro está afectado por varios factores, entre ellos por el tamaño, forma de la parcela utilizada y más importante, el tipo del carácter estudiado. Los caracteres cuantitativos, como rendimiento en granos, son gobernados por muchos loci, y son altamente influenciado por el ambiente, pudiendo esto explicar el alto valor aquí mostrado. Sin embargo, valores similares son estudiados por (Santos da Silva, 2005), utilizando parcelas de igual dimensión a la de este trabajo. También fue observado eficiencia del diseño látice (EL) sobre el diseño bloques completos al azar del orden de 102%.

Las medias ajustadas obtenidas del análisis de variancia para los diferentes grupos de tratamientos están presentadas en el, Cuadro 2.

De modo general, los valores de las medias variaron entre 72,90 y 248,81 g parcela^-1 para los genotipos línea 2 y cruzamiento 55x14, respectivamente. Mientras que las medias de los testigos fueron 106,00 g parcela^-1 (IAC 12) y 203, 65 g parcela^-1 (IAC 5). Es de hacer notar que 44% de los genotipos mostraron una media superior a la media general del experimento (144,13 g parcela^-1).

El análisis de las medias por grupos mostró que el tratamiento (L_2i) tuvo una media de 131,85±24,94 g parcela^-1, para el grupo (P_i) 138,97 ± 35,73 g parcela^-1, ya para el grupo (L_1i) donde se utilizó la línea de superior comportamiento, la media fue de 161,94 ± 34,35 g parcela^-1, siendo incluso superior a la media del experimento como un todo, del testigo IAC 5 e incluso superior al desempeño per se de la línea testadora L₁, cuya media fue 156,67 g parcela^-1.

Los valores referidos a la magnitud y significancia de los cuadrados medios por las pruebas F y t están mostradas en el Cuadro 3, para el carácter rendimiento en grano en gramos por parcela.

CUADRO 3. Análisis de variancia de epistasis para el carácter rendimiento en granos (g parcela^-1), en soya, año 2006/2007.

**, prueba F significativa al 1%.

‡, prueba t significativa al 1% con 702 GL.

Con sus observaciones Vega (1988) señala que en plantas autógamas como soya, los tipos de epistasis más importantes serían los aditivo x aditivo, por ser cultivares homocigotos, y la presencia de este tipo de epistasis puede contribuir para la obtención de líneas superiores. El mismo autor agrega que los métodos de mejoramiento genético utilizados para el desarrollo de líneas puras como cultivares explotan básicamente la variancia aditiva y la epistática de tipo aditiva x aditiva presente en la población objeto de selección.

Hallauer y Miranda Filho (1988) señalan que los estudios de variación genética son fundamentales para la planificación y conducción del programa de mejoramiento, y agregan que en especies autógamas como soya, los primeros estudios realizados por (Brim y Cockerham, 1961, Hanson y Weber, 1962; y Loiselle et al., en 1991), demostraron que la variancia genética aditiva fue el componente principal para la mayoría de los caracteres evaluados. Ya estudios más recientes, realizados por Toledo et al. (2000) y Kusterer et al. (2007), utilizando líneas endocriadas, segregantes y marcadores moleculares, ratificaron los resultados obtenidos en los primeros trabajos, pero además detectaron efectos de epistasis, dominancia, ligamiento entre loci e interacción genotipos x ambientes.

Bernardo (2002) señala que las principales limitantes del diseño TTC está referida a que la epistasis detectada es debida solamente a los loci para los cuales las líneas testadoras son diferentes, y también la dificultad deencontrar líneas testadoras contrastantes para varios caracteres simultáneamente. Es pertinente aclarar que cuando no se cumple la primera exigencia del diseño (líneas contrastantes), las consecuencias genéticas son la ambigüedad de la prueba y la detección de interacción no alélica cuando no existe (Jinks y Virk, 1977).

El contraste de medias por línea, no fue posible realizar, ya que dicho contraste, contiene además de efectos epistáticos efecto de tipo dominante; los cuales darían interpretaciones erróneas de dicho análisis. Aunque, se puede presumir que la presencia de epistasis está determinada de alguna manera por el genotipo expresado por cada línea per se, y por tratarse de un carácter cuantitativo altamente afectado por el ambiente, es posible inferir que estos resultados pueden variar debido a la interacción genotipos x ambientes, como fue presentado por Ketata et al. (1976); Parvez et al. (2006), Silva Da Fanuel y Alves (1983); Upadhyaya y Nigam (1998), y Kusterer et al. (2007).

- En soya, el rendimiento en granos está determinado por la interacción no alélica entre los loci que determinan y la variancia debida a la epistasis no podría ser excluida de la estimación de la variancia genética. Las estimaciones de variancia genética utilizando los diseños de cruzamientos genéticos tradicionales podrían obtener estimados de variancia aditiva y dominante sesgadas.

- Es evidente que la variancia epistática para el carácter rendimiento en granos está determinada por el genotipo de las líneas evaluadas, y posiblemente, los estimados obtenidos en una localidad estarían afectados por la interacción genotipos x ambientes, lo cual hace necesario la evaluación en varios ambientes.

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