Laboratório de Bromatologia Faculdade de Farmácia da UFMG, Av. Olegário Maciel - Belo Horizonte - MG - Brasil

Vários estudos têm relacionado a importância nutricional dos hidrolisados protéicos ao seu teor em oligopeptídeos, especialmente, em di-e tripeptídeos. Assim, neste trabalho, alguns parâmetros hidrolíticos foram testados, utilizando-se a papaína, a fim de se obter hidrolisados de caseína coro perfil peptídico adequado para uso em dietas especiais. Os hidrolisados foram fracionados por cromatografia líquida de alta performance de exclusão molecular (SE-HPLC) e, para a quantificação dos peptídeos, empregou-se o método rápido da Área Corrigida da Fração (ACF). Dentre as cinco condições de hidrólise estudadas, três deram origem a preparações com perfis peptídicos nutricionalmente semelhantes. Entretanto, o emprego da temperatura de 37°C e da relação enzima:substrato (E:S) de 2% indicou ser, provavelmente, esta a condição economicamente mais viável para ser utilizada em escala industrial.

Palavras-chave: Dietas especiais, hidrólise enzimática, caseína, peptídeos, papaína, qualidade nutrícional.

Characterization of peptide and aminoacid profile in casein hydrolysates. The nutritional quality of protein hydrolysates has been related in several reports to their di- and tripeptide contents. In the present work different hydrolytic conditions were tested using papain in order to prepare casein hydrolysates with a suitable peptide profile for being used in special diets. The hydrolysates were fractionated by size-exclusion HPLC and the rapid Correct Fraction Area method was used for quantifying the peptides. Among the five hidrolytic conditions studied, three of them gave rise to preparations having nutritionally similar peptide profiles. However, the use of the temperature of 37°C and enzyme: substrate ratio (E:S) of 2% may probably be the most economical condition for industrial production.

Recibido: 20-03-2001 Aceptado: 17-10-2002

A introdução na dieta de hidrolisados enzimáticos ricos em pequenos peptídeos pode ser importante, no sentido de propiciar uma melhor utilização das proteínas, principalmente em determinadas situações como a que ocorre em indivíduos com intolerância à proteína ou em portadores de deficiência enzimática (1,2). Neste sentido, os hidrolisados protéicos têm sido utilizados, especialmente nos países desenvolvidos, na fabricação de alimentos especiais para diversos grupos, tais como os recém-nascidos prematuros, as crianças com diarréia, gastroenterite, má-absorção, fenilcetonúria e, ainda, para pessoas com alergia a proteínas, visto que o decréscimo no tamanho dos peptídeos tem relação direta com a diminuição da imunogenicidade (3-5). Além disso, estes preparados enzimáticos podem ser úteis na sup.lementação dietética de idosos, na nutrição de esportistas, como também, em dietas para controle de peso (6).

O valor nutricional dos hidrolisados depende da proteína de origem, do tipo de hidrólise (enzimática ou química) e do tamanho da cadeia peptídica. A qualidade de urna proteína alimentar é função da quantidade e do tipo de aminoácidos em sua composição, especialmente dos essenciais, representando uma medida da eficácia com a qual pode ser utilizada pelo organismo. Uma proteína de alta qualidade contém aminoácidos essenciais em proporções aproximadas àquelas que satisfazem as necessidades humanas (7). Assim, a caseína foi selecionada para o presente trabalho, devido ao seu alto valor nutricional, elevada susceptibilidade à ação catalítica de todas as proteases conhecidas (8) e a disponibilidade no mercado. Além disso, a qualidade nutricional de hidrolisados protéicos está diretamente relacionada ao seu perfil peptídico, uma vez que, segundo González- Tello (2), a composição destas preparações deve apresentar elevados teores de di-e tripeptídeos e peptídeos com massa molecular média de 500 Da, baixa porcentagem de peptídeos com massa molecular maior que 800 Da e de aminoácidos livres.

Sendo assim, torna-se importante utilizar um método eficiente para o fracionamento e a quantificação de peptídeos e de aminoácidos livres dos hidrolisados protéicos, além de se proceder à avaliação da distribuição de certos aminoácidos na forma de em que são mais facilmente absorvidos pelo organismo (9,10).

Este trabalho teve como objetivo estudar diferentes condições de hidrólise a fim de se obter hidrolisados de caseína com perfil peptídico adequado para uso em dietas especiais. Para isto, foram testados vários parâmetros hidrolíticos empregando-se a enzima papaína.

O sistema de HPLC isocrático consistiu de uma bomba (série HPll00) e de um detector espectrofotométrico em UV- VIS, acoplado a um computador com software HPchemstation (Avondale, USA). Foi utilizada a coluna cromatográfica [poli- (2-hidroxietilaspartamida)-sílica - PHEA], 250 X 9,4 mm, 5 m m e 200 Å (PolylC, Columbia, MD). A papaína foi gentilmente doada pela BIOBRÁS (Montes Claros, Brasil). A caseína bovina (C7078) foi adquirida da Sigma Chemical (St.Louis, MO). O ácido fórmico foi obtido da Merck (Darmstadt, Alemanha). A água para uso no cromatógrafo foi purificada através da passagem pelo Sistema de Purificação de Água Aries (Vaponics, EUA). As membranas de celulose, utilizadas para filtração das amos tras (0,20 m m) e dos solventes (0,45 m m), foram adquiridas da Sartorius (Alemanha).

Preparo dos hidrolisados de caseína

Oram preparados cinco hidrolisados protéicos. As soluções de caseína a 0,125g% (p/v) em tampão fosfato 0,0lmol/L (pH 6,5 e 7,5) foram, inicialmente, pré-aquecidas em banho- maría a 90°C por 30 minutos. Posteriormente, a temperatura foi ajustada para cada caso, e a papaína foi adicionada numa dada concentração, de maneira a obter a relação E:S desejada. O lempo total de hidrólise foi de 5h. Os outros parâmetros das reações estão apresentados na Tabela l.

Parámetros hidrolíticos empregados no preparo dos hidrolisados de caseína pela papaína

O método rápido da Área Corrigida da Fração (ACF), desenvolvido por Silvestre et al. (10), foi utilizado para quantificar os peptídeos e aminoácidos livres presentes nos hidrolisados de caseína. As amostras foram fracionadas e os valores da ACF calculados, de acordo com a curva padrão estabelecida por Morato et al. (11).

Todas as determinações foram realizadas em triplicata. Para verificar a presença de efeitos significativos entre os diferentes tratamentos, foi adotado o delineamento em Análise Fatorial 5x4 (hidrolisados x frações cromatográficas). Para a determinação das diferenças entre as médias e o conteúdo de aminoácidos das frações cromatográficas dos hidrolisados de caseína foi realizado o teste de Duncan (12).

O perfil cromatográfico do hidrolisado H3, a 230 nm, está apresentado na Figura 1. Os hidrolisados protéicos foram separados em quatro frações, conforme descrito anteriormente por SILVESTRE et al. (9), Morato et al. (11) e Carreira (13). A fração 1 corresponde aos peptídeos contendo mais que 7 residuos de aminoácidos; a fração 2 de 4 a 7 residuos; a fração 3, de 2 a 3 residuos e a fração 4 contendo os aminoácidos livres. Os últimos dois picos na fração 4 correspondem à tirosina (pico Y) e ao triptofano (pico W). Assim sendo, a técnica de SE-HPLC empregada no presente trabalho, mostrou ser eficiente na caracterização de hidrolisados protéicos, especialmente nos casos em que o interesse está voltado para o fracionamento de peptídeos de baixa massa molecular, ou seja, inferior a 1000 Da.

Diferentes técnicas têm sido empregadas no fracionamento de peptídeos de hidrolisados protéicos. A maioria refere-se a peptídeos com massa molecular superior a 1000 Da. Dentre estes métodos destacam-se a eletroforese em gel de poliacrilamida - sódio dodecil sulfato (SDS-PAGE), a cromatografia de exclusão molecular (SEC), HPLC capilar e de troca de ligante (LE-HPLC) e a SE-HPLC (14- 18).

Entretanto, o emprego destas técnicas tem demonstrado uma série de inconvenientes, tais como interações secundárias (eletrostáticas ou hidrofóbicas) entre os solutos e a fase estacionária e a ineficiência para separar pequen os peptídeos (19-21). Outros autores, empregando a SE-HPLC (14) ou a HPLC capilar (16), relataram a dificuldade de separar os peptídeos de acordo com o tamanho da cadeia, tendo observado uma superposição de pesos moleculares.

A fim de se ter uma idéia mais precisa do valor nutricional dos hidrolisados protéicos, avaliou-se a distribuição de tirosina e triptofano nas diferentes frações cromatográficas, especialmente na fração F3 (Tabela 2), visto que di-e tripeptídeos representam a forma mais facilmente absorvida destes dois aminoácidos. Além disso, considerando-se a baixa , solubilidade da tirosina livre, seria interessante a sua substituição em preparações dietéticas, por di- e tripeptídeos, , contendo altos teores de tirosina solúvel (22).

Distribuição de tirosina e triptofano (%) nas frações cromatográficas dos hidrolisados de caseína

A distribuição foi estimada baseando-se nas áreas relativas dos dois resíduos a 230 nm. Como apresentado na Tabela 2, o hidrolisado H1 foi o mais vantajoso, uma vez que contém teores mais elevados de tirosina e triptofano na forma de di- e tripeptídeos.

A influência da relação E:S na ação da papaína sobre a caseína pode ser avaliada na Figura 2.

Observa-se que a alteração da relação E:S de 2% para 4% (hidrolisados H2 e H1, respectivamente), alterou significativamente o conteúdo de todas as frações cromatográficas, produzindo um perfil peptídico de qualidade nutricional inferior. Houve diminuição dos níveis de di- e tripeptídeos, assim como aumento do teor de aminoácidos livres e médios peptídeos. A única alteração vantajosa, do ponto de vista nutricional, refere-se ao decréscimo no conteúdo de grandes peptídeos (Tabela 3). Considerando-se que a papaína apresenta baixa especificidade, esta redução expressiva na quantidade de di- e tripeptídeos não era esperada. O aumento da E:S, ao invés de promover a quebra dos grandes e médios peptídeos a di- e tripeptídeos, levou a clivagem destes a aminoácidos livres. Isto poderia estar associado, pelo menos em parte, ao fato de que a 2%, houve apenas pequena formação de di- e tripeptídeos contendo fenilalanina como segundo aminoácido a partir da porção carboxi-terminal os quais, de acordo com Lenier (23) e Reed (24), não serviriam de substrato para a ação desta enzima.

Ação isolada da papaína: efeito da relação E:S. H1: 4%; H2:2% F1: grandes peptídeos (>7 resíduos de aminoácidos); F2: médios peptídeos (4 a 7 resíduos de aminoácidos); F3: di – e tripeptídeos; F4: aminoácidos livres. Os resultados representam a média das triplicatas Médias indicadas por letras iguais não diferem entre si a 5% de probabilidade na comparação de uma mesma fração para diferentes hidrolisados. Médias indicadas por números iguais não diferem entre si a 5% de probabilidade na comparação de diferentes frações de um hidrolisado

Teor de peptídeos e de aminoácidos livres (% nmoles) das frações cromatográficas dos hidrolisados testes

Este efeito da papaína sobre o perfil peptídico foi mais prejudicial do que o da pepsina, uma vez que Carreira (13), variando a relação E:S nas mesmas proporções, não observou alterações significativas nos conteúdos das frações Fl, F2 e F4 e, ainda, obteve uma elevação nos níveis de di- e tripeptídeos.

Comparando-se a ação da papaína com a da subtilisina, observa-se que o segundo tratamento foi bem superior, do ponto de vista nutricional. Assim, Morato et al. (11), ao passar a E:S de 2% para 4%, obtiveram um decréscimo dos teores de grandes peptídeos e aminoácidos livres, bem como um aumento do conteúdo de médios peptídeos e também de di- e tripeptídeos.

Estes resultados contradizem a afirmativa de Gonzalez- tello (2) de que uma alteração na relação E:S não exerce qualquer influência na distribuição de peptídeos nas frações cromatográficas de hidrolisados protéicos. Existem relatos na literatura que confirmam esta observação. Assim, Freitas et al. (3) não obtiveram uma alteração do perfil cromatográfico de um hidrolisado de caseína, ao aumentar de 3,7 vezes a concentração de pancreatina. Segundo os autores, este limite aparente na hidrólise da caseína, pode estar relacionado, pelo menos em parte, à sua seqüência de aminoácidos e a especificidade da enzima empregada. Apesar destes resultados estarem de acordo com o relato de González-tello (2), uma explicação para isso seria a de que os suportes cromatográficos, empregados por estes autores, foram ineficientes para a separação de peptídeos, de acordo com o tamanho da cadeia, especialmente de di- e tripeptídeos (20, 25).

Todavia, os resultados apresentados por outros pesquisadores estão de acordo com os obtidos no presente trabalho, bem como os de Carreira (13) e Morato et al. (11). Assim, Loosen et al. (26) testaram o emprego da subtilisina na hidrólise da caseína, variando-se a relação E:S de 1 a 4%, senda que os melhores resultados foram obtidos empregando- se a relação E:S de 2%, levando à obtenção de um hidrolisado contendo 75% de di- e tripeptídeos e apenas 5% de aminoácidos livres.

O efeito da temperatura na ação da papaína sobre a caseína está representado na Figura 3.

Ação isolada da papaína: efeito da temperatura. H1: 37ºC; H3: 40ºC; H5: 60ºC. F1: grandes peptídeos (>7 resíduos de aminoácidos); F2: médios peptídeos (4 a 7 resíduos de aminoácidos): F3: di-e tripeptídeos; F4: aminoácidos livre. Os resultados representam a média das triplicatas. Médias indicadas por letras iguais não diferem entre si a 5% de probabilidade na comparação uma mesma fração para diferentes hidrolisados. Médias indicadas por números iguais não diferem entre si a 5% de probabilidade na comparação de diferentes frações de um hidrolisado.

Observa-se que a variação da temperatura de 37°C para 40°C (hidrolisados Hl e H3, respectivamente) produziu uma elevação nos teores de di- e tripeptídeos, além de reduzir os níveis de aminoácidos livres e de grandes peptídeos (Tabela 3). Este efeito da papaína sobre a caseína foi diferente daquele da pepsina, uma vez que Carreira (13) mostrou que, ao passar de 37°C para 40°C, não houve alteração nos teores de di- e tripeptídeos, como também nos de aminoácidos livres.

O aumento da temperatura de 40°C para 60°C (H3 e H5, respectivamente), produziu um perfil peptídico ligeiramente inferior, do ponto de vista nutricional. Se por um lado obteve-se uma queda expressiva (cerca de 50%) na quantidade de aminoácidos livres, por outro este tratamento elevou os teores de grandes peptídeos e provocou uma pequena redução nos níveis de di- e tripeptídeos. Verifica-se que, entre os tratamentos realizados, o emprego de temperatura de 40°C foi o mais vantajoso, do ponto de vista nutricional, país permitiu a obtenção de um hidrolisado apresentando o melhor perfil peptídico para ser empregado em dietas especiais, como descrito por González-tello (2). Ressalta-se, ainda, que neste caso também, a ação da papaína sobre a caseína produziu melhores resultados do que a da pepsina, uma vez que ao passar de 40° para 60°C, esta enzima não contribuiu para reduzir os teores de aminoácidos livres (13).

O efeito da elevação da temperatura (de 40°C para 50°C) sobre o perfil peptídico de hidrolisados de caseína obtidos pela ação da subtilisina foi, também, estudado recentemente. Assim, Morato et al. (11) mostraram que o emprego da temperatura acima de 40°C foi prejudicial do ponto de vista nutricional, tendo obtido resultados semelhantes ao do presente trabalho, ao se passar de 40°C para 60°C.

Chataud et al. (1) e Loosen et al. (26) recomendam o emprego de temperaturas superiores a 50°C para o preparo de hidrolisados ricos em di- e tripeptídeos, usando a subtilisina. De acordo com estes autores, isto poderia reduzir o tempo de hidrólise, sem desnaturação significativa da enzima, e minimizar a contaminação microbiana. Entretanto, os resultados aqui apresentados, assim como os obtidos por Morato et al. (11) e Carreira (13), mostraram o contrário, uma vez que o emprego de temperaturas superiores a 40°C foi prejudicial para o perfil peptídico dos hidrolisados. Este tratamento somente foi benéfico para a tirosina, que teve seu teor elevado 5 vezes na fração F3, ao se passar de 40 °C para 50 °C e empregando-se a subtilisina para hidrolisar a caseína (11).

A influencia do pH na ação da papaína sobre a caseína está representada na Figura 4.

Observa-se que o emprego destes dais valores de pH, situados na faixa ótima de atuação da papaína (6,0 e 7,5) (27), produziu algumas diferenças significativas no perfil peptídico. O hidrolisado obtido no pH 6,5 (H4) mostrou-se ligeiramente superior, do ponto de vista nutricional, ao preparado no pH 7,5 (Hl). Ambos hidrolisados apresentaram os mesmos teores de di- e tripeptídeos. Mas, se por um lado o teor de grandes peptídeos de H1 é inferior ao de H4, a quantidade de aminoácidos livres neste hidrolisado reduziu quase seis vezes em relação a Hl.

Ação isolada da papaína: efeito do pH. H1: pH = 7,5; H4: pH = 6,5. F1: grandes peptídeos (>7 resíduos de aminoácidos); F2: médios peptídeos (4 a 7 resíduos de aminoácidos): F3: di-e tripeptídeos; F4: aminoácidos livre. Os resultados representam a média das triplicatas. Médias indicadas por letras iguais não diferem entre si a 5% de probabilidade na comparação uma mesma fração para diferentes hidrolisados. Médias indicadas por números iguais não diferem entre si a 5% de probabilidade na comparação de diferentes frações de um hidrolisado.

Este efeito da influência do pH sobre o perfil peptídico de hidrolisados protéicos, sempre verificado na faixa ótima de ação das enzimas, já foi relatado anteriormente. Assim, Morato et al. (11) mostraram que o hidrolisado de caseína obtido pela subtilisina, em pH 7,5, foi nutricionalmente superior àquele preparado em pH 8,0, já que apresentou maior teor de di- e tripeptídeos, bem como menor quantidade de grandes peptídeos e aminoácidos livres. De forma semelhante, Carreira (13) verificou uma alteração do perfil peptídico, ao reduzir o pH da hidrólise de 2,5 para 1,9, empregando a pepsina. Do ponto de vista nutricional, esta alteração foi benéfica, pois elevo u os teores de di- e tripeptídeos e reduziu o conteúdo de grandes peptídeos, não tendo sido observadas diferenças significativas entre as quantidades de médios peptídeos e de aminoácidos livres.

A distribuição de tirosina e triptofano (Tabela 2) foi afetada pela variação do pH da hidrólise. O melhor resultado foi obtido no pH 7,5, visto que o hidrolisado Hl apresentou os teores mais elevados destes aminoácidos na forma de di- e tripeptídeos. Resultados semelhantes foram obtidos por Morato et al. (11) que, ao testarem diferentes valores de pH dentro da faixa ótima de ação da subtilisina, também observaram diferenças entre os conteúdos de tirosina e triptofano na fração F3, obtendo melhor distribuição destes aminoácidos em pH 6,5 e 8,0. Da mesma forma, Carreira (13), alterando o pH dentro da faixa ótima de ação da pepsina, encontrou diferentes resultados em relação à distribuição de tirosina e triptofano. Assim, maior conteúdo destes aminoácidos aromáticos na forma de di- e tripeptídeos foi observado quando o pH aumentou de 1,9 para 2,5.

Síntese dos resultados obtidos pela ação da papaína

Considerando a afirmativa de González- Tello et al. (2), dentre os hidrolisados preparados, pode-se concluir que H2, H3 e H5 apresentaram as melhores características para serem usados em dietas especiais, ou seja, maior teor de di- e tripeptídeos (F3) e peptídeos com massa molecular média de 500 Da (F2 + F3), a menor porcentagem de peptídeos com massa molecular maior que 800 Da (Fl), bem como nível mais baixo de aminoácidos livres (F4).

A escolha do melhor dentre estes três hidrolisados para ser preparado em larga escala dependeria de uma avaliação econômica. Entretanto, a princípio tudo indica que o hidrolisado H2 seria o escolhido, uma vez que no seu preparo foram empregados os menores valores de temperatura (37Cº) e da relação E:S (2%), condições que devem ser vantajosas para uma produção em escala industrial.

Alguns parâmetros hidrolíticos, tais como o tempo de reação, poderiam ainda, ser alterados, na busca de um melhor perfil peptídico. Entretanto, deve-se estar consciente de que acima de 5h de hidrólise, o risco de contaminação é considerável (1, 26).

A ação da papaína foi mais eficiente na produção de di-e tripeptídeos quando se empregou uma relação E:S de 2%, pH 7,5 e temperatura de 37°C (H2). Com relação à distribuição de tirosina e triptofano, na forma de di-e tripeptídeos, os melhores resultados foram obtidos nos mesmos valores de pH e temperatura, mas nesse caso foi necessário empregar uma relação E:S de 4% (Hl).

Os autores agradecem à CAPES, CNPq e FAPEMIG pelo apoio financeiro a este trabalho, na forma de bolsas de estudo ou de yerba para a pesquisa.

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