Expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico en carcinoma gástrico: Relación clínico patológica
Dres. Rendón V. Janet María*, Menolascino Bratta Francisco**, Ascanio, Wuilian R. ***, Suarez Alfredo*, Useche Emerson*.
*Servicio de Gastroenterología. Hospital Central Universitario "Dr. Antonio María Pineda". UCLA. Barquisimeto, Edo. Lara. Venezuela
**Servicio de Anatomía Patológica. Hospital Central Universitario "Dr. Antonio María Pineda". UCLA. Barquisimeto, Edo. Lara. Venezuela
***Servicio de Cirugía General. Hospital J M de Los Ríos, Caracas Venezuela.
Para cualquier información o separata contactar a la: Dra. Rendón V. Janet María. Servicio de Gastroenterología. Hospital Central Universitario "Dr. Antonio María Pineda". UCLA. Barquisimeto, Edo. Lara. Correo-e: majarev@yahoo.com
RESUMEN
El Carcinoma Gástrico se mantiene como uno de los tipos más comunes de cáncer a nivel mundial, teniendo una tasa significante de mortalidad. En el estudio de su oncogénesis se han determinado diversos factores genéticos y moleculares que juegan un rol importante en su evolución, entre ellos el receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE) y su coligandos. En este estudio descriptivo y transversal se analizó la expresión de dicho receptor en los especímenes de un total de 36 gastrectomías por carcinoma gástrico realizadas en el Hospital Central Universitario „Dr. Antonio María Pineda‰ durante el período 2002-2006, mediante el método de la estreptavidina-biotina etiquetada del análisis inmunohistoquimico y se estableció la relación entre esta expresión y diferentes parámetros clínico-patológicos de conocido valor pronóstico. Se observó un mayor porcentaje de expresión del RFCE en los casos con menor profundidad tumoral dentro de la pared gástrica (T1- T2 = 58,33%), en aquellos con invasión a ganglios linfáticos (65.2%; p = 0.15) y órganos distantes (75%; p = 0.53) y en los casos con mayor estadio (IV=75%) y en la enfermedad avanzada (III-IV=61.9%; p = 0.36) y en aquellos con moderado grado de diferenciación (66.67%) con respecto a los otros grados. Sin embargo, el análisis estadístico mostró que los resultados no fueron significativos. El RFCE está relacionado con la progresión del carcinoma gástrico y pudiera ser un factor predictivo de enfermedad avanzada.
Palabras Claves:
Carcinoma gástrico, Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, Inmunohistoquímica, Relación Clínico-Patológica. ]]> SUMMARYGastric carcinoma is still one of the most common cancer types worldwide, with a significant mortality rate. The study of its oncogenesis has identified several molecular and genetic factors that play an important role in its evolution, including the receptor for epidermal growth factor (CSFR). This cross-sectional descriptive study was aimed to analyze the expression of this receptor in 36 gastrectomy specimens collected in the „Dr. Antonio María Pineda‰ Central University Hospital from 2002 to 2006, using the labeled streptavidin-biotin method of immunohistochemical analysis, and establishing the correlation between its expression and different clinical-pathological parameters of recognized prognostic value. A higher frequency of EGFR expression was found in cases with minor tumoral extension in gastric wall (T1- T2 = 58.33%), in invasions to lymphatic ganglia (65.2%; p = 0.15) and distant organs (75%; p = 0.53), and in cases of advanced stage (IV=75%) and disease (III- IV= 66.67%; p = 0.36) and those with moderate grade of differentiation (66.67%). Statistical analysis showed that there was no correlation between these outcomes. EGFR is related to gastric carcinoma progression and might have a predictive role in the advanced disease.
Keywords: Gastric Carcinoma, Epidermal Growth Factor Receptor, Immunohistochemical Clinical-Pathological Correlation.
Fecha de Recepción Sep. 2008. Fecha de Revisión Nov. 2008. Fecha de Aprobación Mar. 2009.
INTRODUCCIÓ
NUna de las causas más frecuentes de muerte en el mundo es el cáncer gástrico el cual presenta una incidencia variable en los distintos países y regiones del planeta siendo especialmente elevada en países asiáticos, como Japón
(1) y con tendencia a la disminución en varias regiones como Europa y EE.UU.(2).Los factores genéticos juegan un rol significante en el desarrollo de los cánceres gástricos, junto con factores epigenéticos bien conocidos, tales como la dieta y el estilo de vida(3). Los receptores tirosino-quinasas son moléculas claves en las rutas de señales que llevan al crecimiento y a la diferenciación de células normales(4). La expresión aberrante de las tirosino-quinasas, como la reflejada por la fosforilación aberrante de la tirosina, ha sido reportada en células de cáncer gástrico(5).
Entre los receptores tirosino-quinasas, la familia de genes del factor de crecimiento epidérmico (FCE), incluyendo su receptor (RFCE) y el erb B2, es la más frecuente en cánceres humanos, tales como el cáncer colorrectal, el cáncer de vejiga y el cáncer gástrico, entre otros(6,7). Por otro lado el RFCE es una proteína transmembrana de cerca de 1200 aminoácidos que tiene un dominio extracelular glicosilado que se une al receptor, y lleva a la activación de un dominio intracelular tirosino-quinasa que causa la fosforilación de las proteínas celulares.
Los niveles elevados de este receptor, del FCE o sus RNAm han sido demostrados en muchos carcinomas, lo cual está relacionado a un pronóstico desfavorable
(8,9). Niveles altos de expresión del RFCE también han sido reportados en una variedad de líneas celulares cancerígenas, incluyendo hígado, ovario y colon(10).La detección por hibridación in situ del RNAm del RFCE reveló que su alta expresión está asociada con una frecuencia más elevada de recurrencia de cáncer gástrico(11).
]]> En varios estudios se ha determinado la significancia clínica del RFCE en el carcinoma gástrico(12) y la relación de su expresión con pobre pronóstico de los pacientes(13).En el presente estudio se determinó la expresión del RFCE, empleando métodos de inmunohistoquímica, en especimenes de gastrectomías con carcinoma gástrico (adenocarcinoma) realizadas en el Hospital Central Universitario "Dr. Antonio María Pineda" de la ciudad de Barquisimeto, y se estableció su relación con factores clínico- patológicos de conocido valor pronóstico, tales como el tipo histológico del tumor infiltración a la pared gástrica, grado de diferenciación celular, metástasis regional y a distancia y el estadio del tumor, de manera de contribuir a la comprensión y el enfoque clínico-terapéutico de esta patología.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se revisaron todas las historias clínicas correspondientes a los pacientes ingresados al Hospital Central Universitario "Dr. Antonio María Pineda" entre Enero 2002 y Diciembre 2006, con diagnóstico de cáncer gástrico. De éstas, se seleccionaron 36 casos a los que se les practicó gastrectomía total o subtotal y cuya pieza fue procesada y estudiada en el Servicio de Anatomía Patológica "Dr. Hans Döehnert" de dicho hospital. De dichas historias se obtuvo los datos tales como: Edad, sexo, fecha y tipo de intervención quirúrgica practicada, estadio clínico-patológico y presencia de metástasis a distancia. De los registros del Servicio de Anatomía Patológica se obtuvo los datos anatomopatológicos correspondientes a cada tumor y que incluían: Ubicación del tumor, tipo de neoplasia, grado de diferenciación, nivel de infiltración y estado de los ganglios linfáticos.
Para el estadiaje del tumor se utilizó el Sistema del TNM adoptado por The American Joint Comitte on Cancer (AJCC). De los casos seleccionados se revisaron todas las láminas correspondientes a cada uno de los tumores estudiados, corroborando el diagnóstico y seleccionando las áreas más representativas para cada uno de ellos. Efectuando este paso, se ubicaron los bloques de parafina correspondientes a cada una de las áreas seleccionadas, de los cuales se realizaron cortes de 2 micrómetros de espesor a fin de realizar los estudios correspondientes.
De cada caso se obtuvo dos láminas, a la primera se le realizó coloración de hematoxilina y eosina, a fin de constatar que se corresponde con el área tumoral de interés. La segunda lámina se empleó para el estudio inmunohistoquímico del RFCE.
Los cortes empleados para el estudio de inmunohistoquímica fueron colocados en láminas previamente xilanizadas (DAKO S3003), y posteriormente colocados en estufa a 55-60 À C por 30 minutos, para eliminar el exceso de humedad y facilitar la adhesión del tejido a la superficie de vidrio. Luego todos los cortes fueron desparafinados e hidratados mediante pasos sucesivos por tres xiloles y tres alcoholes de concentración decreciente por 10 minutos cada uno, hasta llegar a agua destilada.
Una vez desparafinados e hidratados, los cortes fueron sometidos a métodos fisicoquímicos de recuperación antigénica, empleando soluciones recuperadoras comercialmente disponibles (Solución recuperadora de antígeno a base de citrato pH 6, DAKO código S2369) y temperatura de 99À C en horno microondas por 10 minutos. Enfriada la solución a temperatura ambiente, se procedió al bloqueo de la peroxidasa endógena, con solución de peroxido de hidrogeno al 3% en metanol por 15 minutos para posteriormente continuar con el protocolo establecido para el empleo del método de la estreptavidina biotina marcada (DAKO LSAB +), para finalmente proceder al revelado con diaminobencidina (DAB) y contraste con hematoxilina de Meyer, realizando el montaje de los cubreobjetos con resinas sintéticas (MARTEX).
Para el estudio de inmunohistoquímica se empleó un anticuerpo primario contra RFCE clon H11 (producido por la Corporación DAKO CA, USA) a una dilución de 1:50. En todos los casos se emplearon controles de positividad conocida y controles negativos. Como control positivo se empleó un carcinoma epidermoide de la lengua con reactividad previamente determinada. En las secciones de control negativo se omitió el anticuerpo primario sustituyéndolo por inmunoglobulina G de conejo no inmunizado.
Para la evaluación del método de inmunohistoquímica fueron examinadas dos a seis áreas diferentes del tejido tumoral por dos patólogos, empleando microscopios de luz Carl Zeiss modelo Axioscope 20. Cada patólogo por separado y sin conocimiento de la información clínica, emitió sus resultados en cuanto a la positividad de cada uno de los tejidos al anticuerpo estudiado, en función de parámetros preestablecidos.
]]> Para el reporte de los resultados se emplearon los criterios establecidos por la Corporación DAKO, y según los cuales el patrón de tinción puede ser homogéneo o heterogéneo dependiendo del tipo de tumor y tejido. Se clasifica como homogéneo cuando toda la neoplasia presenta similar intensidad de coloración y como heterogéneo cuando existen áreas de intensidad variable dentro de un mismo tejido. Se consideró como positivo todo patrón de tinción (completo o incompleto) que incluya la membrana celular. La ausencia de marcaje, tinciones del citoplasma o extracelulares sin remarcar la membrana, fue calificada en una escala de 0, 1+, 2+, 3+.ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se utilizó medidas de tendencia central como porcentajes y promedios, las cuales fueron calculadas mediante el software electrónico SPSS for Windows 15 y se comparó con test de Fisher y de Chi cuadrado para los resultados de inmunohistoquímica. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p<0.05.
RESULTADOS
En total fueron incluidos 36 pacientes con diagnostico de carcinoma gástrico, de los cuales 27 (75%) eran masculinos y 9 (25%) femeninos, con una edad promedio de la muestra de 57,36 años (rango de 19-80 años), siendo el grupo etario más afectado el de 60-69 años. A 24 (66,7%) pacientes se le realizó gastrectomía subtotal y a 12 (33,3%) gastrectomía total, localizándose el carcinoma en 22 (61,1%) casos en antro, 8 (22,2%) en cuerpo, 4 (11.1%) en cardias y 2 (5,6%) en fundus. Desde el punto de vista histológico, 15 (41,7%) fueron adenocarcinomas moderadamente diferenciados, 12 (33,3%) poco diferenciados, 8 (22,2%) pobremente diferenciados y 1 (2,8%) mucinoso. El grado de invasión predominante en la muestra fue T3 con 20 casos (55,6%), seguido de T2 con 9 (25%), T4 con 4 (11,1%) y finalmente T1 con 3 (8,3%).
Se registró invasión a ganglios linfáticos en 23 (63,9%) casos y en 13 (36,1%) no hubo compromiso de estos, siendo el grupo N1 (1 a 6 ganglios positivos) el predominante con 21 casos (58,3%), seguido de N0 (sin invasión a ganglios) con 13 (36,1%), N2 con (7 a 15) con 2 (5,6%) y N3 (más de 15 ganglios) sin ningún caso. Por otro lado, se detectó metástasis en 4 casos (11.1%), siendo el hígado el órgano más afectado. El estadio predominante fue el IIIa con 12 (33,3%) casos, seguido del Ib con 8(22,2%), II y IIIb con 5 casos respectivamente (13,9%), IV con 4 (11,1%) y con 2 (5,5%).
Se determinó una expresión positiva del receptor en 20 casos del total (55,6%) contra 16 (44,4%) que no la presentaron (cuadro 1), con 12 casos (33,3%) con marcaje débil (+), 7 (19,4%) moderado y 1 (2,8%) intenso (gráfico 1). Mientras que resultaron positivos al receptor 10 (66,7%) casos con tumor moderadamente diferenciado, 7 (58,3%) con pobremente diferenciados, 2 (25%) bien diferenciado y el único caso de mucinoso resultó positivo (cuadro 2). Hubo una mayor expresión del receptor en el grupo T4 con 100% (N=4), seguido de T1 con 66,7% (N=2), T2 con 55,6% (N=5) y por último T3 con 44,4% (N=9). (Cuadro 3). La mayoría de los casos con invasión a ganglios linfáticos resultaron positivos con 65,2% (N=15) y los casos sin invasión a ganglios resultaron negativos en la expresión del receptor con 61,5% (N=8), no siendo estadísticamente significativa esta diferencia (p=0.15) (cuadro 4), reportándose además, mayor expresión para N1 con 66,7% (N=14), seguido de N2 con 50% (N=1), N0 con 38,5% (N=5). Sin embargo esta diferencia tampoco fue estadísticamente significativa (gráfico 2). La mayoría de los casos con M1 (75%) resultaron positivos al receptor, mientras que los casos con M0 no mostraron una diferencia porcentual significativa entre los positivos y negativos (cuadro 5). Los casos con estadios III y IV en su mayoría resultaron positivos al receptor (60 y 75% respectivamente) (gráfico 3) y con respecto a la etapa de la enfermedad, hubo una mayor expresión en la avanzada (estadios III-IV) con un 61,9% de los casos (N=13) contra un 46,7% (N=7), sin ser esta diferencia estadísticamente significativa (p=0,36) Cuadro 6).
DISCUSIÓN
En este estudio se pudo observar un predominio del cáncer gástrico en el sexo masculino con respecto al femenino, con una relación 3:1, resultado parecido al de otros reportes previos(14, 15, 16, 13).
La edad promedio aquí reportada (57,36 años) y el grupo etareo más afectado (60-69 años) son semejantes a lo observado en la literatura nacional e internacional(16, 17, 15, 12). Siendo este grupo el encontrado en áreas geográficas con baja incidencia de carcinoma gástrico(15).
En cuanto al tipo de intervención practicada en los casos con carcinoma gástrico aquí presentados, hubo un mayor porcentaje de gastrectomía parcial o subtotal (66.7%), cifra cercana al 77% reportada por Amemiya en esta misma región(16) y a la de 70.8% de Gutiérrez et al en el estado Táchira(17).
]]> En lo que respecta a la localización del tumor, se observó un predominio en antro (61.1%) con respecto a las demás regiones, lo que coincide con los reportes locales(16, 17) e internacionales(18, 19), siendo el tercio superior el menos afectado. En su serie de 63 pacientes García et al localizaron el tumor en la porción gástrica distal en un 38% y 35% en la proximal(12).En la revisión del tipo histológico del carcinoma, se notó que hay un predominio del grupo moderadamente diferenciado (41.7%), seguido por el pobremente diferenciado y por último, por el bien diferenciado, distribución similar a la encontrada en algunas series(16) y diferente a la de otros trabajos, donde el grupo predominante es el bien diferenciado(17). García et al en su serie reportó mayor frecuencia del carcinoma pobremente diferenciado (28%) sobre los otros grupos.
En cuanto a la profundidad de invasión nuestros resultados coinciden con lo reportado por otros autores(16, 17) quienes encuentran con mayor frecuencia invasión hasta la serosa.
Al revisar la literatura nacional e internacional hay variación en cuanto al compromiso ganglionar por el tumor, aunque la mayoría de las series reportan una elevada invasión a ganglios(12, 13). En nuestro estudio, se observó más casos con invasión ganglionar (63.9%), siendo el grupo de N1 (1 a 6 ganglios positivos) el predominante.
Cabe destacar, que en este estudio, se detectó un alto porcentaje de casos sin metástasis a distancia (88.9%), cifra superior a la reportada en otras publicaciones(13) siendo el hígado, el órgano más afectado en los casos donde si se presentó este tipo de metástasis, correspondiéndose con lo señalado en la literatura(15). Consideramos que esto puede ser producto de un sub-registro de las metástasis en las historias clínicas.
A diferencia de las series de Amemiya y Gutiérrez(16, 17) donde se informa que los estadios de mayor predominio fueron IIIb y IV respectivamente, en este trabajo fue el IIIa con un 33,3%, sin embargo al comparar la etapa de la enfermedad, se puede constatar que los resultados son similares entre estas series, existiendo un predominio de la etapa avanzada (estadios III y IV) con respecto a la precoz (estadios I y II). García et al en su publicación de 63 pacientes reportaron 22 casos para el estadio III, 18 para el II, uno para el I y 7 para el estadio IV(12). Mientras que Gamboa en su serie de 89 pacientes reportó un 26% para el grupo I ă II y 63% III - IV (13).
Se determinó una inmunopositividad del RFCE en 55% de los casos, discretamente mayor que en estudios internacionales que reportan 30-50%(20, 21) y con trabajos locales que informan 36.9%(17). Desde el punto de vista del grado de expresión se observó un bajo porcentaje de casos con marcaje intenso (3+), coincidiendo con ciertos estudios(13).
Al comparar el grado de diferenciación con la inmunorreactividad al RFCE, en esta investigación se determinó un alto porcentaje de negatividad para los ADC bien diferenciado y un mayor porcentaje de positividad para los de moderada y pobre diferenciación, valores parecidos a los reportados en investigaciones previas(12). Cabe mencionar que la relación entre estas variables no había sido determinada en los trabajos previamente realizados en el país.
A diferencia de lo establecido en otras investigaciones (12, 13, 17) en las que se encuentra una mayor expresión del RFCE en los casos en que el tumor se localizó más profundo dentro de la pared gástrica (muscular y serosa), en nuestros casos no pudimos establecer esta relación, por el contrario encontramos una relación inversa, en donde a mayor profundidad de invasión menor expresión y por el contrario a mayor invasión menor expresión, aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas.
Al relacionar la inmunorreactividad del receptor del factor de crecimiento epidérmico con la invasión ganglionar se deduce que hubo mayor inmunopositividad en los casos con compromiso ganglionar, sin embargo esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p >0.05). Algo similar se evidencia en otros estudios(13).
]]> Además se pudo detectar, que un alto porcentaje de casos con metástasis a distancia presentó expresión positiva del receptor en comparación con el grupo sin metástasis, sin embargo, esta diferencia de igual forma no fue estadísticamente significativa. En el reporte de Gamboa et al, de 89 casos, se observa esta misma tendencia(13).Por último se observó un mayor porcentaje de positividad (61,9%) del receptor en estadios (III y IV) cifras muy similares a la señaladas en el reporte antes mencionado(13) y en otros(17).
De acuerdo a lo observado en los resultados obtenidos y antes señalados, se da mayor consistencia a la evidencia mostrada en otros trabajos acerca del rol fundamental que juega la expresión del receptor del factor de crecimiento en la oncogénesis del carcinoma gástrico, es decir, que tiene influencia sobre ciertos parámetros indicativos de un fenotipo agresivo en este tipo de neoplasias, tales como profundidad de la invasión tumoral, estadio avanzado, pobre grado de diferenciación, y la ocurrencia de metástasis a ganglios linfáticos y a distancia. Estas características hacen del RFCE un blanco atractivo para la terapia contra el cáncer gástrico (22). En otras palabras, los carcinomas gástricos que exhiben inmuno-expresión positiva tienen tendencia a una conducta más agresiva y por lo tanto a un pobre pronostico, por lo que estos pacientes podrían beneficiarse del bloqueo selectivo del RFCE y sus ligados con anticuerpos monoclonales, los cuales inhiben el crecimiento del carcinoma(23). Al dirigir las terapias de inhibición, no solamente podría ser posible intentar mejorar el pronóstico en el tratamiento de los tumores primarios que expresan dicho receptor, sino que también podrían ser dirigidos selectivamente a las metástasis que también expresan el receptor, independientemente del estado del RFCE del tumor primario(7).
Dentro de esta línea de investigación, el Cetuximab (Erbitux, Merck Kga A Damstadt, Germany), es un anticuerpo monoclonal quimérico murino - humano (mAb) dirigido al sitio de unión del RFCE y ha mostrado utilidad en combinación con otros fármacos (Folfiri) en el adenocarcinoma gástrico y el de la unión gastroesofágica(24).
A pesar de las limitaciones que pueda presentar esta serie, deja el espacio abierto para la continuidad de nuevas investigaciones en esta área tan interesante, ya que podría brindar nuevas perspectivas desde el punto de vista del enfoque de la terapéutica de esta patología.
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