Lic. Miguel Cáceres M.Scs, Militza Quintero, Jhon Cruz, Marco Bastidas, Dr. Juan Puig

Laboratorio de Biología y Medicina Experimental (LABIOMEX), Facultad de Ciencias, Departamento de Biología, Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela.

RESUMEN

Objetivo: Identificar la mutación R579X ubicada en el exón 18 gen RB1, en pacientes con lesiones cervicales asociadas a infección por virus de papiloma humano mediante PCR-SSCP, PCR-RFLP y secuenciamiento. Método: Estudio de 72 muestras de hisopado/cepillado de cuello uterino provenientes de 36 mujeres sanas, y 36 con infección por virus de papiloma humano y con presencia de lesiones cervicales a las cuales se les realizó la extracción de ADN, la amplificación del exón 18 del gen RB1 mediante PCR, y el análisis mediante PCR-SSCP, Secuenciamiento y PCR-RFLP. Resultados: El análisis por PCR-SSCP reveló dos patrones diferentes de corrida y mediante el secuenciamiento se logró identificar la mutación R579X en el exón 18 del gen supresor de tumores RB1 en el 30,56 % de las muestras experimentales. Conclusiones: La mutación R579X encontrada en las muestras experimentales conlleva a la formación de una proteína truncada no funcional, y aunado a esto, el virus de papiloma humano podría estar favoreciendo a la inmortalización de las células que presentan dicha mutación.

Palabras clave: RB1. Virus del papiloma humano. PCR-SSCP. PCR-RFLP. ADN secuenciamiento.

SUMMARY

Objective: To identify the mutation R579X in exon 18 located RB1 gene in patients with cervical lesions associated with human papilloma virus infection by PCR-SSCP, PCR-RFLP and sequencing. Method: Study of 72 samples of cervical brushing of the healthy women, infected with human papilloma virus and with cervical lesions that required DNA extraction, PCR amplification of exon 18 of the RB1 gene, PCR-SSCP, Sequencing and PCR-RFLP analysis. Results: PCR-SSCP analysis revealed two different band patterns. We indentified the R579X mutation in exon 18 of the RB1 tumor suppressor gene in 30.56 % of the experimental samples. Conclusions: The mutation found in the experimental samples leads to the formation of a non-functional truncated protein, in adition, human papilloma virus infection might contributed to the immortalization of cells with this mutation.

Key words: RB1. Human papilloma virus. PCR-SSCP. PCR-RFLP. DNA sequencing.

El cáncer cervical representa el segundo tipo de cáncer más frecuente en la población femenina a nivel mundial. En Venezuela, este cáncer ocupa el segundo lugar en incidencia y mortalidad en la población femenina del país, lo cual lo convierte en un verdadero problema de salud pública. Para el año 2008, se reportaron 1 251 casos, con una incidencia en mujeres con edades comprendidas entre 20 y 85 años (1-3).

El virus del papiloma humano (VPH) es el único virus asociado directamente con el desarrollo de cáncer en el tracto anogenital, considerándose como el agente etiológico del mismo (4). Un evento clave en la inducción del cáncer cervical es la integración de los VPH de alto riesgo al cromosoma de su hospedador (5). Cuando ocurre la integración viral, el genoma del VPH puede fragmentarse por la región E2 llevando a la inactivación del gen E2. Al detenerse la síntesis de la proteína E2 cesa la acción represora de esta sobre los genes E6 y E7. Las proteínas E6 y E7 de los VPH de alto riesgo, son activas funcionalmente señalizando las proteínas P53 y RB1 respectivamente, de tal manera que son degradadas por el sistema ubiquitina dependiente. La desaparición de las proteínas P53 y RB1 bloquea la apoptosis e inmortaliza las células infectadas por VPH (1,6).

El gen RB1 se localiza en el cromosoma 13 en la región q14.2. Tiene una longitud de 180 388 pb y está formado por 27 exones y codifica para un ácido ribonucleico mensajero (ARNm) de 4.7 kb que se traduce en una fosfoproteína nuclear llamada RB constituida por 928 aminoácidos y con un peso molecular de 105-110 kDa. Las formas hipofosforiladas de la proteína RB1 forman complejos con ciertos factores transcripcionales, incluido el E2F, que regula la expresión de varios genes celulares que se requieren en la fase S del ciclo celular. Por tanto, RB en su estado de hipofosforilación, bloquea la progresión del ciclo celular porque permanece unida a E2F. Cuando la célula se desplaza de la fase G1 a la fase S, la proteína RB es fosforilada por un complejo de cinasas dependientes de ciclinas (CDK) y esto hace que E2F se separe y quede libre para que transcriba los genes que se necesitan para que el ciclo celular prosiga (7,8).

En pacientes con retinoblastoma han sido reportadas todo tipo de mutaciones en RB1, deleciones, inserciones, duplicaciones, inversiones, transiciones en regiones CpG y mutaciones puntuales, siendo estas últimas las más frecuentes, contando cerca de 50 % de las alteraciones en el gen RB1 (9). La mayoría de los estudios concuerdan con que los exones 3, 8, 18, 19 y 20 son las regiones preferenciales de mutación (“hot spots”). Además, existen estudios en donde reportan que las mutaciones en el gen RB1 se distribuyen a lo largo de la secuencia codificante, así como también, en las regiones intrónicas del gen (7, 10). Un evento común en diversos tipos de cáncer es la inactivación del gen RB1. Algunos estudios sugieren que patrones alterados de la expresión de la proteína RB1 se asocian con formas diferentes de cáncer humano. En lesiones invasoras del cérvix uterino, la expresión de la proteína RB es casi nula a diferencia de lo que sucede con las lesiones pre-cancerosas del cérvix, en donde existe una gran expresión de dicha proteína (11). En el cáncer cervical, la inactivación de la proteína RB ocurre por la unión con la proteína E7 de los VPH de alto riesgo (12). La proteína E7 puede disociar el complejo RBE2F, se ha encontrado que este complejo está ausente en varias líneas celulares de cáncer cervical, ya sea por expresión de la proteína E7 de VPH o porque portan una mutación en el gen RB1 (13).

MÉTODOS

Se realizó un estudio descriptivo preliminar de corte transversal donde se analizaron 72 muestras del área genital de mujeres con edades comprendidas entre 17 y 55 años, activas sexualmente, atendidas, previo consentimiento informado, en consulta pública o privada por médicos especialistas. Presentando diagnóstico clínico previo de infección con VPH por citología, colposcopia o biopsia. Se seleccionaron 36 pacientes que presentaron infección por VPH de alto y bajo riesgo, con lesiones pre-cancerosas (NIC I, NIC II y NIC III) o cáncer de cuello uterino, constituyendo el grupo experimental; las otras 36 pacientes sin lesiones y sin presencia de VPH, constituyeron el grupo control.

La extracción del ADN se realizó según el protocolo de Blin y Stafford (14), al cual se le realizaron algunas modificaciones. El pellet celular se resuspendió en 200 μL de tampón de Lisis (Tris-HCl 10 mM pH 8.2; EDTA 2 mM; y NaCl 400 mM), 20 μL de SDS 10.% y 8 μL de Proteinasa K (10mg/mL). Se incubó a 55.ºC durante 2 h. Seguidamente, se agregaron 200 μL de Chelex-100 al 5 % y se calentó por 10 min a 95 ºC. Se centrifugó 10 000 rpm por 10 min en una centrifuga eppendorf 5 424 y se tomaron 400 μL de la capa superior a la cual se le añadieron 2 volúmenes de etanol puro en frío y 0,2 volúmenes de acetato de amonio 10 M, se dejó precipitar el ADN a -20 ºC durante 12 h. Se centrifugó para bajar el precipitado y se resuspendió el ADN en 200 μL de tampón TE 10 mM pH 8.

Las muestras de ADN se sometieron a una PCR que amplifica un fragmento del gen de la β-globina, para determinar la calidad del ADN (15). La detección y tipificación de VPH se realizó en un estudio previo (16). Se amplificó el exón 18 del gen RB1 empleando los oligonucleótidos RB-18F y RB-18R (17). La mezcla de reacción consistió en tampón de PCR 1X, 2,0 mM de MgCl2, 200 μM de dNTP’s, 25 pmoles de cada uno de los iniciadores y 0,5U de Taq polimerasa (Invitrogen). Se utilizó un termociclador Eppendorf Mastercycler ep gradient S con el siguiente programa de amplificación: 1 min a 94 ºC, 30 seg a 44 ºC y 30 seg a 72 ºC. Los resultados fueron observados mediante electroforesis en geles de poliacrilamida 6.% en tampón TBE 0,5X.

Una vez obtenidos los amplificados del exón 18 se aplicó la técnica de PCR-SSCP (18). El aparato de electroforesis utilizado fue una cámara de marca Hoffer SE 660 Amersham Bioscience, acoplada a un refrigerante poly science moldel 90. Los vidrios tienen una medida de 18 x 16 cm, el grosor del gel es de 0,4 mm con una concentración de poliacrilamida 16 %. Los amplificados del exón 18 fueron desnaturalizados, empleando para ello el mismo volumen de tampón de carga para SSCP (Formamida 95 %, EDTA 20mM y Azul de bromofenol 0,05 %), se sometieron a 95 ºC durante 10 min y se colocaron inmediatamente en hielo por 10 min. Se sometieron a un campo eléctrico a 1285 V, 30 W en una fuente de poder modelo EC 4000P series 90 por 6 h. Los patrones de SSCP fueron visualizados mediante tinción con nitrato de plata (19).

Se realizó una digestión con la enzima de restricción DdeI para determinar la presencia de la mutación R579X en el exón 18 en las muestras del grupo experimental (17). La mezcla de restricción consistió de 5μL del amplificado del exón 18, 1U de enzima, tampón de reacción 1X y agua destilada estéril para un volumen final de 10 μL. La mezcla se incubó por 1 h a 37 ºC y se inactivó la enzima a 65 ºC por 1 min. Para observar los patrones de digestión se tomaron 5 μL del digerido y se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida 6 % en tampón TBE 0,5X.

Para el análisis de los resultados se empleó el paquete estadístico SPSS para Windows, versión 15.0.0. Se aplicó el test de Chi-cuadrado (X2) y se construyeron tablas de contingencia de 2x2 o doble entrada, con el fin de investigar la asociación entre la mutación R579X del exón 18 del gen RB1, y relacionarla con los resultados de infección por VPH y el desarrollo de las lesiones cervicales en pacientes infectadas con el virus.

RESULTADOS

Se analizaron las 72 muestras de hisopado o cepillado de cuello uterino. Todos los ADN purificados permitieron la amplificación de un fragmento del gen de la beta-globina, y se demostró que eran aptos para la PCR. Estas muestras fueron analizadas mediante los sistemas de PCR MY09/MY11 y GP5/GP6 y fueron sometidas a PCR-RFLP para su tipificación en un estudio previo (16).

De las muestras del grupo experimental, el 77,78.% presentó infección por VPH y el 22,22 % no presentó infección por el virus. El 39,29 % de esas muestras corresponden a VPH de alto riesgo, 25 % a VPH de bajo riesgo y 35,71 % a tipos de VPH no determinados. En cuanto a la presencia de lesiones cervicales, el 97,22.% de las muestras experimentales presentó lesiones pre-cancerosas o carcinoma de cuello uterino, de las cuales el 36,11 % corresponden a NIC I, 19,44.% a NIC II, 11,11 % a NIC III y 30,56.% a carcinoma in situ. El 2,78 % no presentó lesiones cervicales, pero presentó infección por VPH.

Una vez verificada la calidad del ADN en las muestras se procedió a la amplificación del exón 18 del gen RB1 para realizar su posterior análisis mutacional. Todas las muestras en estudio permitieron la amplificación de 248 pb correspondientes al exón 18 del gen y a segmentos de los intrones 18 y 19 (Figura 1).

El análisis por PCR-SSCP reveló dos patrones diferentes de corrida. Estas variaciones son denominadas isoformas o variantes alélicas, y se diferenciaron en el número de bandas presentes. La isoforma a presentó cuatro bandas y la isoforma b presentó siete bandas. El 100 % de las muestras del grupo control presentó la isoforma a, mientras que en el grupo experimental la distribución de las isoformas fue de 69,64 % para la isoforma a y 30,56 % para la isoforma b (Figura 2).